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连翘酯苷B调控铁死亡在APAP诱导的药物性肝损伤中的作用及机制研究

申报人：张婷 申报日期：2026-03-16

基本情况

2026创新项目
连翘酯苷B调控铁死亡在APAP诱导的药物性肝损伤中的作用及机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
药物性肝损伤（DILI）是临床上常见的肝脏疾病之一，其中以对乙酰氨基酚（APAP）过量所致的肝损伤最为典型。目前，DILI的临床干预手段仍较为有限，且部分药物存在明显副作用，亟需探索新的治疗策略。铁死亡（ferroptosis）是一种新近发现的铁依赖性程序性细胞死亡方式，在DILI发生发展中具有重要作用，但机制尚未完全阐明。连翘酯苷B（Foythiaside B，FB）是从中药连翘中分离得到的一种苯乙醇苷类化合物，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多种药理活性。但FB能否通过调控铁死亡发挥对DILI的保护作用尚缺乏系统性研究。我们前期实验结果显示，FB可显著减轻APAP诱导的小鼠肝脏损伤，降低血清转氨酶水平，改善肝组织病理学损伤。同时，肝组织中铁死亡关键调控蛋白ACSL4的表达经FB预处理后显著降低，提示FB可能通过抑制ACSL4介导的铁死亡通路，发挥对APAP诱导肝损伤的保护作用。基于此，本项目拟结合体内外实验，系统探究FB对APAP所致肝损伤的保护作用，并深入探讨其调控铁死亡的关键机制，旨在为DILI的防治提供新的理论依据与实验基础，为基于天然产物的肝保护药物研发提供新的候选分子。
1.负责人作为核心成员参与2025年国家级大学生创新训练项目1项，并参与完成相关研究。
2.负责人作为核心成员参与第十届全国大学生生命科学竞赛（创新创业类）获国家级二等奖。
3.以主要成员参与2篇SCI论文投稿（1篇已接收，1篇外审中）。
4.通过前期科研训练，已具备良好的科研思维，熟练掌握动物饲养及动物模型构建、细胞操作、蛋白免疫印迹（Western blot）、氧化应激指标检测、流式细胞术及ELISA等关键实验技术。 
1.山东省自然科学基金，干扰素调节因8通过RIP3调控LPS介导的巨噬细胞程序性坏死参与急性肝衰竭发病及机制研究（ZR2021MH287），2022.1-2024.12，10万元，主持。（张惠）
2.济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金，白术内酯-I（ART-I）调控M1型巨噬细胞极化对急性肝衰竭保护作用及其机制研究（JYHL2021ZD01），2022.01-2024.12，20万，主持。（张惠）
3.济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金，山茱萸新苷调控髓源抑制性细胞对免疫相关肝损伤的保护作用及机制研究（JYHL2022MS21），2023.01-2025.12，10万元，主持。（闫风连）
4. 山东省自然科学基金，ACE2调控中性粒细胞胞外陷阱形成在银屑病发生中的生物学机制（ ZR2025QC842），2025.10-2028.09，13万元，主持。（闫风连） 
       指导教师长期深耕于肝脏疾病发病机制及治疗策略研究领域，具备扎实的科研积淀与丰富的实践经验，能够在课题设计、实验技术及研究思路等方面为团队提供系统、精准的指导。依托所在团队—济宁医学院免疫学“泰山学者”实验室，同时借助山东省细胞生物医疗技术重点实验室和济宁市免疫学重点实验室的平台优势，研究团队拥有完备的实验设施、先进的仪器设备以及充足的科研经费，能够为本课题的顺利实施提供坚实保障。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
张婷 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 动物模型构建及组织病理学检测
徐鹏飞 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 氧化应激指标检测
于骐瑞 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 组化和凋亡检测
王育丞 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 ELISA检测
仲昭明 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2023 Q-PCR和文献管理
张新宇 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2024 Western blot检测

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张惠 基础医学院 否
闫风连 基础医学院 否

立项依据

1. 构建APAP诱导的急性药物性肝损伤体内外模型，明确连翘酯苷B（Forsythiaside B，FB）对APAP所致肝损伤的保护作用、剂量效应及给药窗口。
2. 从肝功能、组织病理、氧化应激、炎症反应及细胞死亡等方面系统评价FB的干预效果，并结合铁死亡相关指标、药理学救援和反向诱导实验，明确FB是否通过抑制铁死亡减轻APAP诱导的肝损伤。
3. 围绕Keap1-Nrf2/xCT-GPX4信号轴，阐明FB调控铁死亡的分子机制，明确Nrf2通路在FB抗铁死亡和肝保护作用中的关键地位，为药物性肝损伤防治提供实验依据和潜在干预策略。 
1. 明确FB对APAP诱导急性肝损伤的保护作用及给药窗口。
 体内实验：
 采用6-8周C57BL/6雄性小鼠，体重为18-22g。APAP建模前禁食12小时。
（1）建立APAP诱导小鼠急性肝损伤模型，分别设置FB预处理组和APAP后治疗组，评价其预防和治疗窗口。
    分组：Vehicle对照组
                         FB单独给药组
                        APAP模型组
                        APAP + 乙酰半胱氨酸(NAC)组（阳性对照）
                         APAP + FB低/中/高剂量预处理给药组
                         APAP + FB低/中/高剂量治疗给药组
（2）检测FB对APAP诱导肝损伤相关病理及生化指标的影响：
a. 检测血清转氨酶（ALT、AST）水平；
b. HE染色观察肝脏组织学变化；
c. TUNEL染色观察肝细胞死亡水平；
d. 检测肝组织中SOD、MPO、CAT、GSH/GSSG及LDH水平等氧化应激指标；
e. Q-PCR检测肝脏及脾脏中IL-6、IL-12、TNF-α的mRNA表达水平；
f. ELISA检测血清炎症因子IL-6、IL-12、TNF-α的表达。
（3）评估FB干预对APAP诱导肝损伤小鼠生存率的影响。
 体外实验：
（1）培养HepaRG细胞，构建APAP诱导的细胞损伤模型，用合适浓度的FB处理，体外水平验证FB对APAP诱导的肝损伤的保护作用：
a. 检测FB对损伤模型细胞活力的影响，确定最佳作用浓度；
b. 流式细胞术检测不同浓度FB处理对细胞凋亡的影响；
c. 检测不同浓度FB处理的细胞上清及裂解液中LDH释放、GSH含量、SOD活性等氧化应激指标；
d. 流式细胞术结合JC-1染色评估线粒体膜电位变化，反映FB对氧化应激的调控作用。 

2. 明确FB是否通过抑制铁死亡减轻APAP诱导的肝损伤。
 体内实验：
  构建APAP诱导的药物性肝损伤模型，用不同浓度的FB处理，同时设置铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）和铁螯合剂Deferoxamine（DFO）作为阳性对照，以及铁死亡激动剂Erastin处理组，观察FB是否能够调控铁死亡发挥肝保护作用。
      分组：APAP模型组
                             APAP + FB低/中/高剂量组
                             APAP + Fer-1组
                             APAP + DFO组
                             APAP + Erastin组
a. 检测肝组织中铁死亡关键指标MDA、LPO、Fe²⁺含量；
b. Western blot检测Nrf2、GPX4、xCT等铁死亡相关蛋白表达情况；
c. 免疫组化检测Nrf2及4-HNE（脂质过氧化标志物）的表达与分布；
d. 采用透射电镜观察肝细胞线粒体缩小、嵴减少、膜密度增加等铁死亡相关超微结构改变。
 体外实验：
 拟采用HepaRG细胞建立APAP诱导的肝细胞损伤模型对上述体内结果进行验证。
a.设置Control组、Vehicle组、FB单独处理组、APAP模型组、APAP + FB低剂量组、APAP + FB中剂量组和APAP + FB高剂量组，检测细胞活力、LDH释放、ROS、MDA、Fe²⁺水平及GPX4、SLC7A11/xCT、ACSL4等铁死亡相关蛋白表达，明确FB对APAP诱导肝细胞损伤及铁死亡相关改变的调控作用；
b.设置APAP模型组、APAP + FB组、APAP + Fer-1组和APAP + DFO组，以铁死亡抑制剂Fer-1和铁螯合剂DFO作为药理学救援工具，观察其是否能够模拟FB的保护作用。同时，设置APAP + FB + Fer-1组和APAP + FB + DFO组，进一步判断FB与铁死亡抑制剂或铁螯合剂之间是否存在协同效应；
c. 设置APAP模型组、APAP + FB组、APAP + Erastin组、APAP + FB + Erastin组。通过观察Erastin是否逆转FB对细胞活力、LDH释放、Fe²⁺积累、C11-BODIPY脂质过氧化、MDA水平以及GPX4、SLC7A11/xCT表达的改善作用，进一步验证FB减轻APAP诱导肝细胞损伤是否与抑制铁死亡密切相关；
d. 采用Erastin直接诱导铁死亡模型作为补充验证，设置Control组、FB单独处理组、Erastin模型组、Erastin + Fer-1组、Erastin + DFO组、Erastin + FB低/中/高剂量组；进一步验证FB是否具有直接抗铁死亡作用，从而明确其抑制APAP诱导肝细胞铁死亡的作用及其在肝保护效应中的关键地位。

3. 阐明FB通过Keap1-Nrf2/xCT-GPX4轴调控铁死亡的机制。
   前期通过网络药理学预测及生物信息学分析，发现FB的潜在作用靶点显著富集于Keap1-Nrf2信号通路，且该通路下游与铁死亡关键调控因子xCT、GPX4存在密切关联。据此提出假说：FB可能通过调控Keap1-Nrf2/xCT-GPX4轴参与铁死亡过程。为验证这一假说，本研究拟系统阐明FB通过Keap1-Nrf2/xCT-GPX4轴调控铁死亡的机制。Keap1-Nrf2通路在抵御肝细胞铁死亡中发挥关键作用，多种天然产物通过激活该通路发挥肝保护效应。本研究拟采用HepaRG细胞，构建APAP或Erastin诱导的损伤模型，给予FB干预，系统验证FB通过Keap1-Nrf2/xCT-GPX4轴调控铁死亡的分子机制：
a. 利用Nrf2荧光素酶基因报告系统，检测FB对Nrf2转录活性的影响；
b. 分别提取不同处理组的细胞质与细胞核蛋白，Western blot检测Nrf2的核转位情况；
c. Western blot检测不同处理组中Keap1及Nrf2下游蛋白NQO1的表达水平；
d. 联合使用Keap1-Nrf2通路抑制剂ML385，进一步验证该通路在FB调控铁死亡中的作用；
e. 检测Nrf2 mRNA表达水平；利用放线菌酮（CHX）或蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，探究FB对Nrf2的调控是发生在转录水平，还是影响蛋白合成或降解过程；
f. 通过分子对接技术预测FB与Keap1-Nrf2复合体的潜在结合模式。
g. RNA-seq作为机制补充研究：培养HepaRG细胞，构建APAP或Erastin诱导损伤模型，经FB干预后，收集样本进行RNA-seq测序, 重点围绕铁死亡、谷胱甘肽代谢、Nrf2抗氧化应答、APAP代谢和线粒体氧化应激相关通路进行筛选。通过qPCR、Western blot及RNA干扰技术验证候选分子在FB调控肝细胞铁死亡中的作用，从而完善“FB—Keap1-Nrf2/xCT-GPX4轴—铁死亡抑制—肝损伤保护”的机制链条。 
   肝脏是维持生理稳态的核心器官，具有高度异质性，承担着免疫调节、脂质与胆固醇稳态、宏量营养素代谢及外源化合物（包括药物）生物转化等重要职能1。据世界卫生组织统计，肝病已成为全球疾病负担的主要来源之一，其死亡率常年居高不下。药物性肝损伤（Drug-Induced Liver Injury, DILI）是指由药物及其代谢产物诱发或异常免疫反应诱发的肝损伤，是临床常见的肝脏疾病类型。全球超1100种上市药物被证实具有潜在肝毒性，涵盖抗结核药、抗肿瘤药、抗生素、解热镇痛药及部分中草药等。全球DILI的年发病率约为2‰，我国年发病率约为23.8/10万人，较高的发生率使其成为全球范围内不容忽视的医疗安全问题2。因缺乏特异性生物标志物、临床表现多样，且涉及氧化应激、线粒体功能障碍及免疫炎症等多重通路，DILI早期诊断与靶向治疗仍面临重大挑战3,4，亟需探索更有效的标志物、靶点及干预药物。
   对乙酰氨基酚（Acetaminophen, APAP）是一种临床广泛使用的解热镇痛药。在治疗剂量下，APAP主要在肝脏中通过葡萄糖醛酸结合和硫酸结合反应转化为无毒的亲水性代谢产物。然而，APAP的过量使用已成为导致肝毒性的主要原因之一，可诱发严重肝损伤乃至急性肝衰竭（Acute Liver Failure, ALF）5。APAP相关肝损伤影响超百万人，是DILI和ALF的常见病因之一6。APAP诱导的肝损伤（APAP‑induced liver injury，AILI）小鼠模型能高度模拟人类病理生理过程，是常用的药物性肝损伤研究模型。AILI的核心发病机制包括：毒性代谢产物生成、蛋白质加合物形成（诱发线粒体功能障碍与过氧亚硝酸根生成）、氧化应激、线粒体损伤及DNA损伤所介导的细胞死亡等。涉及信号通路： MAPK、MPT、Keap1-Nrf2-ARE及 TRPM2等。其中，Keap1-Nrf2被公认为是DILI的关键内源性防御系统（图1）。已有研究发现，Nrf2基因敲除小鼠因无法有效恢复谷胱甘肽水平，对APAP诱导的肝毒性更为敏感；而Keap1基因敲除小鼠因Nrf2持续激活，表现出更强的抵抗力7。Keap1通过结合Nrf2促进其泛素化降解，负向调控GPX4、GCLC、HO-1等下游靶基因的表达，进而减轻氧化应激损伤。因此，干预Keap1与Nrf2的蛋白相互作用，已成为激活Nrf2信号通路、治疗多种氧化应激相关疾病的重要策略8。
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图1. APAP致肝毒性的适应性机制5
   DILI常导致自噬、焦亡和铁死亡等多种细胞死亡方式。其中铁死亡是一种非凋亡性铁依赖型细胞死亡形式，区别于细胞凋亡、自噬和焦亡等其他类型的细胞死亡，其特征是脂质过氧化，并伴有多类肝脏病理状况9。除了铁代谢外， Cys2 / GSH/GPX4轴、GCH1/BH4/ DHFR轴，以及FSP1/CoQ轴等途径也参与铁死亡调控（图2）。GPX4利用还原型谷胱甘肽将有毒的脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇，从而切断铁死亡链式反应的传播。在APAP诱导的AILI中，铁死亡同样扮演着重要角色10。过量APAP经细胞色素P4502E1（CYP2E1）代谢生成高活性的亲电子产物N-乙酰-对苯醌亚胺（NAPQI）。当NAPQI生成量超过谷胱甘肽的结合能力时，未结合NAPQI与线粒体蛋白共价结合形成APAP-蛋白加合物，诱发氧化应激增强和线粒体功能障碍。持续存在的氧化应激与铁离子协同作用，驱动铁依赖性脂质过氧化，最终诱导铁死亡并导致肝细胞损伤，引发肝损伤。在APAP诱导的肝损伤中，多种分子参与了对铁死亡的精细调控（图2）。GPX4作为铁死亡的关键抑制因子，依赖还原型谷胱甘肽清除脂质过氧化物；上调GPX4可保护细胞免受铁诱导损伤。ACSL4催化多不饱和脂肪酸活化，促进其嵌入细胞膜并加剧脂质过氧化从而驱动铁死亡；敲除ACSL4能显著降低脂质过氧化水平及铁超载。在抗氧化调控层面，Nrf2与Keap1解离后启动下游GPX4及System Xc⁻相关基因表达，维持氧化还原稳态，进而抑制铁死亡。此外，脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛（4-HNE）不仅通过共价修饰抑制MRP通道活性导致有毒谷胱甘肽结合物累积，还直接靶向GPX4蛋白第93位半胱氨酸（C93）促进其K48位泛素化降解，从而瓦解细胞的抗氧化防御体系。在 APAP诱导的肝损伤中，铁死亡相关基因和蛋白表达也发生了显著变化。研究表明，前列腺素-内过氧化物合酶2（Ptgs2）在APAP处理后表达上调，而负调控因子GPX4及胱氨酸/谷氨酸逆向转运体xCT的表达则明显下调。xCT参与细胞内谷胱甘肽（GSH）的合成，其下调导致GSH耗竭，加剧氧化应激与脂质过氧化。同时，APAP诱发肝内亚铁离子蓄积，过量游离铁通过Fenton反应生成大量活性氧（ROS），加速铁死亡11,12。研究表明，铁死亡的特异性抑制剂Ferrostatin- 1可以提高APAP处理的原代肝细胞存活率；敲低铁死亡的关键酶ACSL4则可减轻APAP诱导的肝细胞毒性和脂质过氧化13；激活 Nrf2 通路以维持肝细胞氧化还原稳态亦可抑制铁死亡，发挥对AILI的保护作用14。
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图2. 铁死亡过程中的调控信号通路及相关防御机制9

   N-乙酰半胱氨酸（NAC）是目前唯一获批用于治疗APAP过量的临床解毒剂。但口服生物利用度低、疗效高度依赖于给药时机（通常在过量后10小时内显著），并可能引发包括过敏性休克等不良反应。相比之下，传统中药及其天然活性成分因具有副作用小、毒性低和成本低廉等特点，展现出良好的开发前景。自APAP肝毒性被发现以来，研究者借助动物模型和细胞实验系统评估多种植物化学物的保肝作用。已有研究证实，多种天然产物对APAP诱导的肝损伤模型具有显著的保护作用。在线粒体功能调控方面，肉桂、乌头和山茱萸可降低活性氧（ROS）水平，并调节p-AMPK、p-ACC、CPT1及ACADM等能量代谢相关蛋白，缓解APAP肝毒性15。五味子素B通过增强GPX4活性、抑制脂质过氧化以及调节铁稳态（降低铁沉积、恢复铁调素与转铁蛋白水平）减轻肝损伤16。黄芩苷通过激活Nrf2信号通路，增强xCT/GPX4抗氧化轴，抑制TLR4-NF-κB/MAPK和NLRP3/caspase-1/GSDMD通路，减轻炎症、凋亡、焦亡及铁死亡17。芍药通过抑制氧化应激和细胞凋亡发挥保肝作用18。蒲公英通过调控Nrf2/HO-1通路、抑制JNK磷酸化及调节凋亡相关蛋白表达，在AML12细胞和小鼠模型中抑制APAP诱导的氧化应激、炎症和凋亡19。近年来，铁死亡被证实是DILI发生发展的关键因素,多种天然成分亦被报道可通过抑制该过程缓解肝损伤。小檗胺通过直接结合GCLC，激活NRF2/GCLC/GPX4轴并上调FSP1，抑制脂质过氧化、GSH耗竭及线粒体功能障碍，减轻铁死亡、氧化应激和炎症，其保护效果与铁死亡抑制剂Fer-1相当20。黄花蒿可能通过靶向ESR1，激活Nrf2/GPX4信号轴，抑制氧化应激与铁死亡21。儿茶素上调xCT和GPX4表达，减少脂质过氧化，发挥抗铁死亡作用22。黄腐酚（啤酒花天然成分）通过共价修饰Keap1蛋白的三个关键半胱氨酸残基，激活Nrf2/xCT/GPX4信号通路，调节GPX4、SLC7A11等铁死亡相关蛋白的表达，减少脂质过氧化和铁积累，抑制铁死亡，从而缓解AILI23。
   近年来，中医药因其多组分、多靶点、多通路协同作用而备受关注。连翘是我国历史悠久的实用灌木，其干燥果实为清热解毒的中药，具有抗炎、抗菌和抗病毒等多种体内外治疗功效。其活性成分众多，可通过调控氧化应激、炎症、NF-κB 信号通路、铁死亡、内质网应激等发挥神经保护作用24。连翘酯苷 B（Forsythiaside B, FB）是连翘的核心活性成分，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗过敏、自由基清除、抗病毒等生物活性25–27。在多种疾病模型中通过调控炎症、氧化应激及相关信号通路发挥广泛药理作用。
   例如，在乳腺炎中，FB通过调控TLR2/MAPK/NF-κB通路，下调促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）；并激活Nrf2通路上调HO-1、SOD及GSH活性，清除ROS、降低MDA、改善乳腺组织病理损伤27。在骨关节炎中，FB上调Nrf2及HO-1表达，抑制软骨损伤与退化，减轻氧化应激和炎症28。在自身免疫性脑脊髓炎中，FB抑制胶质细胞活化和NLRP3炎症通路，减轻神经炎症及脱髓鞘病变，降低发病率并改善症状25。在艾滋病中，FB增强Siglec-14构象稳定性并上调其表达，抑制巨噬细胞中HIV-1复制；同时，FB抑制促炎因子，上调干扰素刺激基因及趋化因子表达，并通过激活JAK1/STAT1通路在Siglec-14敲低的巨噬细胞中发挥抗病毒作用29。综上所述，FB在多种疾病模型中通过调控炎症、氧化应激、凋亡及增殖等相关通路发挥保护作用。然而，目前FB在肝脏疾病中的研究仍较为有限，鉴于其多靶点特性，FB在药物性肝损伤及铁死亡调控中的潜在应用价值值得进一步探索。
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图3.FB预处理对APAP诱导肝损伤保护机制

    我们前期的预实验结果表明，FB预处理可显著降低APAP诱导的药物性肝损伤小鼠的死亡率、减少血清ALT、AST水平，减轻肝脏充血及组织损伤，抑制肝细胞凋亡，并降低血清和肝脏中炎症因子表达。ACSL4通过催化多不饱和脂肪酸活化，促进其嵌入细胞膜并加剧脂质过氧化，从而驱动铁死亡，是铁死亡过程中的关键调节蛋白。我们的免疫组化结果显示，FB预处理可显著降低ACSL4的表达。提示，FB可能通过抑制肝细胞铁死亡发挥对APAP诱导肝损伤的保护作用。鉴于Keap1-Nrf2通路是肝细胞应对APAP所致氧化应激的核心防御机制，本研究拟以该通路为切入点，深入探讨FB调控铁死亡保护肝损伤的具体分子机制（图3）。同时，结合RNA-seq技术开展转录组学分析，探索其潜在的新型调控通路。
参考文献：
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(11) Zeng, Y.; Wu, R.; Wang, F.; Li, S.; Li, L.; Li, Y.; Qin, P.; Wei, M.; Yang, J.; Wu, J.; Chen, A.; Ke, G.; Yan, Z.; Yang, H.; Chen, Z.; Wang, Z.; Xiao, W.; Jiang, Y.; Chen, X.; Zeng, Z.; Zhao, X.; Chen, P.; Gong, S. Liberation of Daidzein by Gut Microbial β-Galactosidase Suppresses Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in Mice. Cell Host Microbe 2023, 31 (5), 766-780.e7. https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.04.002.
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(13) He, Y.; Lin, Y.; Song, J.; Song, M.; Nie, X.; Sun, H.; Xu, C.; Han, Z.; Cai, J. From Mechanisms to Medicine: Ferroptosis as a Therapeutic Target in Liver Disorders. Cell Commun. Signal. CCS 2025, 23 (1), 125. https://doi.org/10.1186/s12964-025-02121-2.
(14) Mishima, E.; Nakamura, T.; Doll, S.; Proneth, B.; Fedorova, M.; Pratt, D. A.; Friedmann Angeli, J. P.; Dixon, S. J.; Wahida, A.; Conrad, M. Recommendations for Robust and Reproducible Research on Ferroptosis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2025, 26 (8), 615–630. https://doi.org/10.1038/s41580-025-00843-2.
(15) Luo, Q.; Li, X.; Huang, J.; Zhao, L.; Liu, L.; Huang, S.; Xu, Y.; Qiu, P.; Li, C. Shenqi Pill Alleviates Acetaminophen-Induced Liver Injury: A Comprehensive Strategy of Network Pharmacology and Spectrum-Effect Relationship Reveals Mechanisms and Active Components. Phytomedicine Int. J. Phytother. Phytopharm. 2024, 135, 156050. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2024.156050.
(16) Tang, Z.; Yang, X.; Zhang, M.; Yang, B.; Li, H. Schisandrin B Alleviates APAP-Induced Hepatocyte Ferroptosis via the GPX4 Axis: Insights from Human iPSC-Derived Hepatic Organoids and Rat Models. Phytomedicine Int. J. Phytother. Phytopharm. 2026, 156, 158241. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2026.158241.
(17) Pu, R.; Cui, Q.; Xing, Z.; Liu, L.; Xiao, W.; Xiao, Q. Scutellarin Modulates Nrf2 to Alleviate Inflammation, Pyroptosis, and Ferroptosis in Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity. Phytomedicine Int. J. Phytother. Phytopharm. 2026, 155, 158107. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2026.158107.
(18) Li, Y.; Deng, X.; Hu, Q.; Chen, Y.; Zhang, W.; Qin, X.; Wei, F.; Lu, X.; Ma, X.; Zeng, J.; Efferth, T. Paeonia Lactiflora Pall. Ameliorates Acetaminophen-Induced Oxidative Stress and Apoptosis via Inhibiting the PKC-ERK Pathway. J. Ethnopharmacol. 2024, 329, 118107. https://doi.org/10.1016/j.jep.2024.118107.
(19) Ge, B.; Sang, R.; Wang, W.; Yan, K.; Yu, Y.; Kong, L.; Yu, M.; Liu, X.; Zhang, X. Protection of Taraxasterol against Acetaminophen-Induced Liver Injury Elucidated through Network Pharmacology and in Vitro and in Vivo Experiments. Phytomedicine Int. J. Phytother. Phytopharm. 2023, 116, 154872. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2023.154872.
(20) Tao, M.; Shi, J.; Zhang, Y.; Zheng, Y.; Zhao, Y.; Ma, H.; Li, L. Berbamine Attenuates Acetaminophen-Induced Liver Injury by Engaging GCLC and Enhancing Ferroptosis-Regulatory Antioxidant Pathways. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2026, 1872 (4), 168154. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2026.168154.
(21) Zhang, Y.; Lu, Q.; Yan, Y.; Zhang, J.; Liu, T.; Yu, L.; Fan, Q.; Wei, K. Artemisia Keiskeana Miq. Alleviates Oxidative Stress and Ferroptosis in APAP-Induced Liver Injury by Mediating Nrf2/GPX4/NF-κB Signaling Pathway through ESR1. Phytomedicine Int. J. Phytother. Phytopharm. 2025, 148, 157436. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2025.157436.
(22) Su, Y.; Zeng, Y.; Zhou, M.; Liao, M.; Qin, P.; Wu, R.; Han, J.; Liang, X.; Wang, Z.; Jiang, J.; Yu, Z.; Huang, X.; Ding, K.; Guo, P.; He, Y.; Du, Y.; Duan, T.; Yuan, H.; Ge, Y.; Chen, A.; Xiao, W. Natural Polyphenol-Mediated Inhibition of Ferroptosis Alleviates Oxidative Damage and Inflammation in Acute Liver Injury. Biomater. Res. 2025, 29, 0167. https://doi.org/10.34133/bmr.0167.
(23) Deng, Y.; Chu, X.; Li, Q.; Zhu, G.; Hu, J.; Sun, J.; Zeng, H.; Huang, J.; Ge, G. Xanthohumol Ameliorates Drug-Induced Hepatic Ferroptosis via Activating Nrf2/xCT/GPX4 Signaling Pathway. Phytomedicine Int. J. Phytother. Phytopharm. 2024, 126, 155458. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2024.155458.
(24) Zhang, L.; Lang, F.; Feng, J.; Wang, J. Review of the Therapeutic Potential of Forsythiae Fructus on the Central Nervous System: Active Ingredients and Mechanisms of Action. J. Ethnopharmacol. 2024, 319, 117275. https://doi.org/10.1016/j.jep.2023.117275.
(25) Wang, Y.; Chen, Y.; Lu, J.; Xiao, Q.; Li, G.; Wang, R.; Chen, R.; Zhang, D.-Q. Forsythoside B Ameliorates Neuroinflammation via Inhibiting NLRP3 Inflammasome of Glial Cells in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mice. Brain Res. Bull. 2025, 220, 111182. https://doi.org/10.1016/j.brainresbull.2024.111182.
(26) 刘吉瑛. 连翘酯苷B对野百合碱诱导的肺动脉高压的保护作用及机制研究. 硕士学位论文, 西南医科大学, 2025. https://doi.org/10.27215/d.cnki.glzyu.2024.000079.
(27) 吕昌洋. 连翘酯苷B通过Nrf2与NF-κB/MAPK通路缓解金黄色葡萄球菌诱导乳腺炎的作用研究. 硕士学位论文, 山东农业大学, 2025. https://doi.org/10.27277/d.cnki.gsdnu.2025.000697.
(28) S, L.; Y, L.; L, H.; L, T.; F, G. Forsythoside B Alleviates Osteoarthritis through the HMGB1/TLR4/NF-κB and Keap1/Nrf2/HO-1 Pathways. J. Biochem. Mol. Toxicol. 2024, 38 (1). https://doi.org/10.1002/jbt.23569.
(29) Chen, S.; Hu, X.; Chen, F.; Liu, J.; Su, J.; Chen, R.; Wei, W.; Yuan, Z.; An, S.; Ye, L.; Liang, H.; Jiang, J. Forsythoside B Activates Siglec-14 to Inhibit HIV-1 Replication via the JAK1/STAT1 Pathway. Int. J. Biol. Macromol. 2025, 303, 140632. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.140632. 
创新点：
1. 本研究发现FB对药物性肝损伤具有显著保护作用，拓展了该天然产物在肝病治疗领域的研究范畴，为其应用于DILI防治提供了新的实验依据。
2. 机制研究方面，本研究从铁死亡调控角度为天然产物干预药物性肝损伤提供了新的作用靶点与理论依据。

项目特色：
1. 本项目采用体内外相结合的多层次研究策略，综合运用基因报告系统、Western blot、免疫组化等多种技术手段，系统阐明FB通过抑制铁死亡通路减轻药物性肝损伤的作用，为天然产物的肝保护应用提供了可靠实验依据。
2. 本研究创新性地将天然产物活性与铁死亡调控相结合，深入解析FB调控铁死亡的分子机制，既揭示了铁死亡在药物性肝损伤中的病理意义，也为靶向该通路的药物研发提供了理论支撑。 
技术路线：
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拟解决的关键科学问题：
1. 探究FB在药物性肝损伤中的保护作用及其与铁死亡的关联：
铁死亡（ferroptosis）作为一种新型程序性细胞死亡形式，其在药物性肝损伤中的调控机制尚未完全阐明。FB虽已报道具有抗炎、抗氧化及清除自由基等重要作用，但其在药物性肝损伤中的具体作用机制，尤其是调控铁死亡减轻药物性肝损伤，目前尚缺乏系统研究。
2. 揭示FB通过调控铁死亡发挥肝保护作用的具体机制：
Keap1-Nrf2信号通路是细胞抗氧化防御的核心调控轴，但FB能否通过该通路调控铁死亡关键分子（如xCT、GPX4）进而发挥肝保护作用，其具体机制仍需深入解析。

预期研究成果：
1. 明确FB对APAP诱导肝损伤的保护作用及铁死亡调控机制。
通过体内外实验证实FB可显著改善APAP诱导的肝损伤（降低ALT/AST水平、减轻肝组织病理损伤），并阐明其通过抑制铁死亡核心特征（铁过载、脂质过氧化及GSH耗竭）发挥保护作用，为临床转化提供实验依据。
2. 揭示FB调控Keap1-Nrf2/xCT/GPX4信号轴的分子机制。
阐明FB通过激活Keap1-Nrf2通路、上调xCT/GPX4表达，进而抑制铁死亡的级联调控机制，为铁死亡相关疾病（如肿瘤、心血管系统疾病）的治疗提供潜在靶点。
3. 发表高水平学术论文，建立天然产物调控铁死亡的理论模型。
基于系统的机制解析和多维度技术验证，预期在国内外权威期刊发表学术论文1-2篇，为天然产物的精准药物开发提供新的研究思路与理论模型。

1. 2026.07-2026.12：明确FB对APAP诱导肝损伤的保护作用
（1）建立APAP诱导的药物性肝损伤体内外模型，确定FB的给药剂量与时间。
（2）FB干预对APAP损伤小鼠生存率、血清转氨酶（ALT/AST）水平、肝组织病理学改变及肝细胞凋亡（TUNEL染色）的影响。
（3）初步检测肝组织中氧化应激（SOD、MDA）及铁死亡（GSH、Fe²⁺）相关指标的変化。

2. 2027.01-2027.06：确证铁死亡在FB肝保护中的关键作用
（1）体内实验：检测FB对APAP模型小鼠肝组织铁死亡核心指标（MDA、LPO、Fe²⁺含量）的抑制作用；采用Western blot及免疫组化检测Nrf2、GPX4、xCT、4-HNE等关键蛋白的表达与定位。
（2）体外验证：在APAP或Erastin诱导的HepaRG细胞损伤模型中，利用FerroOrange探针、C11-BODIPY染色及流式细胞术，检测FB对细胞内Fe²⁺水平及脂质过氧化的影响，验证其对铁死亡的直接调控作用。

3. 2027.07-2027.12：深入解析FB调控铁死亡的分子机制
（1）靶点验证：在细胞模型中，联合应用Nrf2特异性抑制剂（ML385）及Western blot技术，验证Keap1-Nrf2/xCT/GPX4信号轴在FB抑制铁死亡中的作用。
（2）机制探索：对FB处理后的细胞样本进行转录组测序（RNA-seq），通过KEGG富集分析筛选差异表达基因及潜在信号通路；利用RNA干扰技术对筛选出的关键分子进行功能验证，探寻除Nrf2通路外的新调控机制。

4. 2028.01-2028.06：成果整理与结题
（1）系统整理实验数据，进行统计学分析及图表绘制。
（2）撰写研究论文，计划投稿1-2篇SCI或中文核心期刊。
（3）准备项目结题报告、经费决算及相关成果证明材料，完成结题。 
与本项目有关的研究积累和已取得的成绩


1.1本项目的前期工作基础

1.1.1 明确连翘酯苷B在APAP诱导的肝损伤中的作用。
  为了初步验证连翘酯苷B对APAP诱导的药物性肝损伤的保护作用，我们基于前期优化的造模条件，设计如下动物实验：选用6周龄雄性C57BL/6小鼠，于动物房适应性饲养1周后，随机分为4组（n=6）：对照组（Control）、连翘酯苷B单独给药组（FB）、模型组（APAP）、连翘酯苷B干预组（APAP+FB）。所有小鼠禁食12 h后，FB组及APAP+FB组经尾静脉注射连翘酯苷B（40 mg/kg）；1 h后，APAP组及APAP+FB组腹腔注射APAP（400 mg/kg）建立肝损伤模型（图4）。对照组给予相应溶剂对照。于造模后24 h收集血清及肝组织样本，用于后续指标检测。
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图4. 小鼠实验流程图。
    研究结果表明连翘酯苷B可以保护APAP诱导的药物性肝损伤。具体实验结果如下：
    (1) 与模型组相比，连翘酯苷 B 可显著提高 APAP诱导的 DILI小鼠的生存率。
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图 5. 连翘酯苷 B 提高 FB诱导的 DILI小鼠的生存率。*P<0.05
    （2）与模型组相比，连翘酯苷B干预可显著降低APAP诱导的肝损伤小鼠血清中ALT和AST的水平。
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图6. 小鼠血清中ALT、AST水平。***P<0.001。
    （3）与模型组相比，连翘酯苷B干预可显著改善APAP诱导的药物性肝损伤小鼠肝脏的充血情况。
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图7. 小鼠肝脏组织照片。
    （4）HE结果显示，连翘酯苷B干预可显著改善APAP诱导的药物性肝损伤小鼠肝脏组织病理损伤，肝脏组织充血、坏死显著减少。
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图8. 小鼠肝脏组织HE染色结果，放大倍数分别为100倍和200倍。
    （5）Tunel染色结果显示，连翘酯苷B可显著减少APAP诱导的药物性肝损伤小鼠肝脏细胞的凋亡。
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图9. 小鼠肝脏组织Tunel染色结果，放大倍数分别为100倍和200倍。
    （6）QPCR及ELISA结果表明，连翘酯苷B可显著降低APAP诱导的药物性肝损伤小鼠肝脏及血清中炎性细胞因子的表达。
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图10. 小鼠肝脏和血清中炎性细胞因子的表达。A. 小鼠肝脏中IL-6、IL-12、TNF-α的mRNA水平表达；B. 小鼠血清中炎性细胞因子IL-6、IL-12/p40的表达水平。**P<0.01，***P<0.001。

1.1.2 探索铁死亡在连翘酯苷B保护APAP诱导的药物性肝损伤中的作用
   在APAP诱导的AILI中铁死亡扮演着重要角色，其中ACSL4通过催化多不饱和脂肪酸活化，促进其嵌入细胞膜并加剧脂质过氧化，从而驱动铁死亡，是铁死亡过程中得关键调节蛋白。因此我们通过免疫组化检测了肝脏组织中ACSL4的表达。发现明连翘酯苷B处理可显著减少肝脏组织中ACSL4的表达。提示连翘酯苷B可能通过调控铁死亡保护APAP诱导的药物性肝损伤。
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图11. 小鼠肝脏组织免疫组化ACSL4染色结果，放大倍数分别为100倍和200倍。
   基于以上前期实验结果，并结合国内外相关文献分析，我们提出研究假说：连翘酯苷B可能通过抑制肝细胞铁死亡，从而减轻APAP诱导的药物性肝损伤。为验证该假说，后续拟以肝细胞铁死亡为切入点，深入探究连翘酯苷B调控铁死亡保护肝损伤的分子机制。该假说既有前期实验数据支撑，亦与现有研究报道相符，具有充分的理论依据，确保研究目标的可行性与创新性。

1.2项目负责人及其团队成员的科研积累

1.2.1团队负责人及其成员的研究积累
 团队配合默契，投入充足，已完成充分文献调研及前期实验筹备，能够高效、稳妥推进项目研究，保障顺利结题。
（1）负责人专业基础扎实，为医学专业高年级本科生，系统掌握了病理学、生物化学等核心学科知识，长期关注药物肝脏损伤与保护相关研究，具备良好的文献检索、实验设计与数据分析能力。同时具有出色的项目统筹与团队协调能力，科研态度严谨、执行力强，能全程把控研究进度、实验实施与成果总结。
（2）负责人科研经历丰富，作为核心成员参与2025年国家级大学生创新训练计划项目1项，深度完成相关研究；作为核心成员参加第十届全国大学生生命科学竞赛（创新创业类），荣获国家级二等奖。作为核心成员参与第十一届全国大学生生命科学竞赛（科研探究类）、十二届全国大学生医学创新大赛暨“一带一路”国际竞赛。以主要作者身份参与2篇SCI论文投稿（1篇中科院2区论文已接受，1篇中科院1区论文外审中）展现出较强的科研产出能力。
Wang,L.；Yan,F.；Zhang,T.；Zhong,Z.；Yan,S.；Sun,X；Liu,Z.；Li,Y.；Zhang,J.；Li,C.；Ya,B.；Chen,S.；Xiong,B.；Zhang,H. The Natural Compound Cornuside Protects Against Acute Liver Failure Induced by Lipopolysaccharide and D-galactosamine. Drug Design Development and Therapy (已接收)
Yan,S.; Yan,F.; Sun,X.; Chen,S.; Zhong,Z.; Zhang,T.; Wang,L.; Yu,Q.; Xu,P.; Zhang,X.; Li,J.; Zhang,J.; Li,C; Xiong,H.; Liu,J.; Zhang,H. Forsythoside B alleviates concanavalin A–induced autoimmune hepatitis in mice via suppressing hepatocyte death and inflammatory responses. Food Science and Human Wellness.(外审中)
（3）团队由医学专业大一、大二、大三学生跨年级、跨专业组成，形成“经验传承—能力互补—分工闭环”的良性梯队结构，确保科研经验的有效沉淀与持续迭代。全员自大一即进入济宁医学院“泰山学者”海外特聘专家实验室，接受系统科研训练。大二、大三成员均具有学科竞赛、大学生创新创业训练计划、全国大学生生命科学竞赛、全国大学生医学创新大赛暨“一带一路”国际竞赛参赛及获奖经历、以及参与SCI论文投稿的经历，熟悉完整科研流程、实验规范及材料撰写，具备扎实的实操能力与成熟的科研思维；大一成员学习积极性高，主要负责文献整理及基础辅助工作，能快速融入团队科研节奏，为项目持续注入活力。
（4）全体成员具备医学专业理论基础，经过前期系统科研训练，已熟练掌握以下关键实验技术：动物饲养与疾病模型构建、细胞培养与操作、蛋白免疫印迹、氧化应激指标检测、流式细胞术及ELISA等，能够独立支撑项目全流程实验需求。

1.2.2指导教师关于本项目有关的研究积累
  本项目指导教师及其所在团队长期进行肝损伤相关研究，申请了多项相关研究课题，并且发表了多篇相关研究成果，能够给予相应的指导。近几年在肝损伤方面的相关研究成果如下：
(1) Zhang, H.; Gao, M.; Wang, H.; Zhang, J.; Wang, L.; Dong, G.; Ma, Q.; Li, C.; Dai, J.; Li, Z.; Yan, F.; Xiong, H. Atractylenolide I Prevents Acute Liver Failure in Mouse by Regulating M1 Macrophage Polarization. Sci Rep 2025, 15 (1), 4015. https://doi.org/10.1038/s41598-025-86977-x.
(2) Yan, F.; Li, W.; Sun, X.; Wang, L.; Liu, Z.; Zhong, Z.; Guo, Z.; Liu, Z.; Gao, M.; Zhang, J.; Wang, C.; Dong, G.; Li, C.; Chen, S.; Xiong, H.; Zhang, H. Sappanone A Ameliorates Concanavalin A-Induced Immune-Mediated Liver Injury by Regulating M1 Macrophage Polarization. Inflammation 2025, 48 (4), 2274–2291. https://doi.org/10.1007/s10753-024-02189-x.
(3) Wang, L#.; Yan, F#.; Zhang, J.; Xiao, Y.; Wang, C.; Zhu, Y.; Li, C.; Liu, Z.; Li, W.; Wang, C.; Liu, J.; Zhang, H.; Xiong, H.; Shi, D. Cornuside Improves Murine Autoimmune Hepatitis through Inhibition of Inflammatory Responses. Phytomedicine 2023, 120, 155077. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2023.155077.
(4) Wang, H.; Li, X.; Dong, G.; Yan, F.; Zhang, J.; Shi, H.; Ning, Z.; Gao, M.; Cheng, D.; Ma, Q.; Wang, C.; Zhao, M.; Dai, J.; Li, C.; Li, Z.; Zhang, H.; Xiong, H. Toll-like Receptor 4 Inhibitor TAK-242 Improves Fulminant Hepatitis by Regulating Accumulation of Myeloid-Derived Suppressor Cell. Inflammation 2021, 44 (2), 671–681. https://doi.org/10.1007/s10753-020-01366-y.
(5) Yan, F.; Cheng, D.; Wang, H.; Gao, M.; Zhang, J.; Cheng, H.; Wang, C.; Zhang, H.; Xiong, H. Corilagin Ameliorates Con A-Induced Hepatic Injury by Restricting M1 Macrophage Polarization. Front Immunol 2021, 12, 807509. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.807509. 
  项目组成员已熟练掌握APAP诱导的药物性肝损伤模型的构建方法，并具备完成本项目所需的核心实验技术，包括组化、免疫荧光、QPCR、ELISA、Western blot等，能够满足体内外研究的需求。本项目组指导教师所在的实验室为济宁医学院“泰山学者”海外特聘专家实验室，依托山东省细胞生物医疗技术重点实验室，山东省教育厅批准成立的免疫学和分子医学研究所，以及济宁市免疫学重点实验室，配备开展免疫学、细胞生物学及分子生物学研究所需的各类关键仪器设备，如流式细胞仪、倒置荧光显微镜、荧光定量PCR仪、化学发光成像系统、全波长酶标仪、高速冷冻离心机、超低温冰箱及标准细胞培养间等。此外，学校设有SPF级动物实验设施，可满足动物模型构建及体内实验需求。综上，现有实验条件已完全满足承担和完成本项目的要求。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 发表论文版面费，购买ELISA试剂盒，Western Blot抗体，细胞培养等试验试剂，耗材及购买实验动物 12000.00 8000.00
1. 业务费 3000.00 无 0.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 发表论文版面费 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 17000.00 购买ELISA试剂盒，Western Blot抗体，细胞培养等试验试剂，耗材及购买实验动物 12000.00 5000.00
结束

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