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Brazilin靶向Efemp1调控“部分EndMT”促进血管新生的机制研究

申报人：鲁佳佳 申报日期：2026-03-16

基本情况

2026创新项目
Brazilin靶向Efemp1调控“部分EndMT”促进血管新生的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
药学类
学生自主选题
二年期
心肌梗死（Myocardial Infarction, MI）是一种由冠状动脉急性堵塞引起的、以心肌缺血坏死为特征的急症，是全球范围内导致心力衰竭的主要原因之一。促进梗死区域的血管新生，恢复血液供应，是改善MI后心脏功能、延缓心衰进程的核心治疗策略之一。内皮-间质转化（EndMT）是指内皮细胞获得间充质表型的过程，其在MI后血管新生中的具体调控机制尚不清楚。巴西苏木素（Brazilin）是中药苏木的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化及内皮依赖性的血管舒张作用，但其是否通过调控“部分EndMT”促进MI后血管新生，目前未见报道。本项目旨在探究EndMT来源间质细胞的功能特性及其在血管新生中的作用，以Brazilin为工具药，明确其是否通过调控“部分EndMT”过程增强血管新生与心脏修复。研究成果有望揭示“部分EndMT”调控血管新生的新机制，阐明Brazilin的药理新用途，为MI治疗提供新的理论依据和潜在靶点。
  在指导老师课题组中研读心血管方向文献，了解其验证思路及论文逻辑，实践中学习动物模型构建、Western Blot、免疫荧光、免疫组化等实验技术。依据科研成果参加学科竞赛，曾获全国大学生生命科学竞赛国家级一等奖，2025中国国际大学生省级铜奖。现阶段已学习组胚、生化、分子生物学等专业基础课程，为下一步本课题的实施奠定了理论基础。
  主要研究领域为心血管系统疾病发病机制及相关药理毒理学研究。主持国家自然科学基金面上项目（82073846）；主持国家自然科学基金青年项目（81800399）；主持中国博士后科学基金面上项目（2024M761149），主持山东省博士后创新项目（SDCX-ZG-202502106）；主持2项山东省自然科学基金联合基金项目（ZR2024LMB019, ZR2021LZY007）；主持创立山东省高等学校“青创团队计划”团队项目（2022KJ103）。
项目申请成功后，会全力支持此项目的开展，为后续申请其他项目奠定坚实基础。目前指导老师已为本项目购买Efemp1基因敲除鼠，HCAEC细胞及Efemp1抗体。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
鲁佳佳 药学院 临床药学（本科） 2024 形态学染色、超声
马文俊 药学院 临床药学（本科） 2022 动物建模、细胞培养
曹译文 药学院 药物制剂（本科） 2023 Real time-PCR
唐一匀 药学院 药物制剂（本科） 2024 免疫荧光实验、免疫组化实验
李培源 药学院 药物制剂（本科） 2023 成管实验、 划痕实验、Transwell实验
李沛霖 药学院 药物制剂（本科） 2024 Western blot、MTT及CCK8实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
秦玮 药学院 否

立项依据

  心肌梗死（Myocardial Infarction, MI）是全球范围内导致心力衰竭和死亡的主要原因之一。2025年6月发布发表在《中国循环杂志》的《中国心血管健康与疾病报告2024概要》一文中指出，心血管病在我国城乡居民疾病死亡构成比中居首位。MI后，梗死区域遭到破坏，导致心肌细胞缺血坏死，进而引发心功能下降。促进梗死区域的血管新生，恢复血液供应，是改善MI后心脏功能、延缓心衰进程的核心治疗策略之一[1]。内皮-间质转化（Endothelial-to-Mesenchymal Transition, EndMT）是指内皮细胞失去其特异性标志物（如CD31、VE-cadherin），获得间质细胞表型（如表达α-SMA、Vimentin）的过程。EndMT在心脏发育、心脏瓣膜形成以及心血管疾病（如心肌纤维化、动脉粥样硬化）中扮演重要角色[2]。近年研究发现，EndMT并非一个“全或无”的过程，“部分EndMT”（partial EndMT）状态在生理性血管生成中至关重要[3]。在这种状态下，内皮细胞处于一种中间态。“部分EndMT”来源的间质细胞具有更强的迁移能力、细胞外基质重塑能力和旁分泌能力，它们可以围绕新生血管芽，为内皮细胞的迁移和管状结构的形成提供物理支持和引导，从而促进血管新生。然而，这些EndMT来源的细胞在MI后血管新生中的具体功能、调控机制以及作为治疗靶点的潜力，目前尚不明确。巴西苏木素（Brazilin）是从传统中药苏木中分离得到的主要活性化合物之一。现代药理研究表明，Brazilin具有抗炎、抗氧化、血管舒张等多种生物活性[4]。已有报道指出Brazilin提取物对大鼠胸主动脉具有内皮依赖性的血管舒张作用[5]，提示其可能对血管功能具有调节作用。但Brazilin是否能通过调控“部分EndMT”，进而促进MI后血管新生，其具体机制如何，至今未见报道。一种分泌型糖蛋白Efemp1，广泛表达于心血管系统、肝脏、肾脏等多种组织器官中，主要功能是参与细胞外基质的构建、调控细胞增殖、迁移、分化和表型转化。先前课题组已有研究发现，Efemp1能够促进“部分EndMT”，我们将继续探究Efemp1是否为Brazilin发挥作用的关键靶点。本项目旨在探究“部分EndMT”来源的间质细胞的功能特性，明确其在血管新生过程中的作用。并以Brazilin为工具药，深入研究其是否通过靶向Efemp1介导“部分EndMT”过程，增强“部分EndMT”来源细胞的功能，从而促进MI后血管新生和心脏修复。
【参考文献】
[1] Wu X, Reboll MR, Korf-Klingebiel M, Wollert KC (2021). "Angiogenesis after acute myocardial infarction." Cardiovascular Research 117(5): 1257-1273.
[2] Kovacic JC, Dimmeler S, Harvey RP, Finkel T, Aikawa E, Krenning G, Baker AH (2019). "Endothelial to Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease: JACC State-of-the-Art Review." Journal of the American College of Cardiology. 73,2: 190-209.
[3] Fang, Z., et al. (2024). "GTF2H4 regulates partial EndMT via NF-κB activation through NCOA3 phosphorylation in ischemic diseases." Innovation (Camb) 5(2): 100565.
[4] Vij T, Anil PP, Shams R, Dash KK, Kalsi R, Pandey VK, Harsányi E, Kovács B, Shaikh AM. (2023). "A Comprehensive Review on Bioactive Compounds Found in Caesalpinia sappan." Molecules 28(17): 6247.
[5] Y W Xie, D S Ming, H X Xu, H Dong, P P But. (2000). "Vasorelaxing effects of Caesalpinia sappan: Involvement of endogenous nitric oxide." Life Sciences 67(15): 1913-1918.
1.明确Brazilin可促进MI及HLI模型小鼠血管新生、调控“部分EndMT”进程
  MI动物水平探究Brazilin对血管新生及心肌损伤的改善作用：构建小鼠MI模型，分为sham组、MI组、MI+Brazilin低剂量组、MI+Brazilin高剂量组。通过小动物心脏超声检测各组小鼠心功能相关指标，评估Brazilin对MI小鼠心脏收缩、舒张功能的改善效果；制备小鼠心脏组织切片，通过HE及Masson染色观察心肌梗死区病理形态及新生血管数量和心肌胶原沉积与纤维化损伤程度；采用CD31、α-SMA免疫荧光双染技术，分析心肌组织中小血管数量，明确Brazilin对心肌血管新生的促进作用。
  HLI动物水平探究Brazilin对血管新生及EndMT的调控作用：构建小鼠HLI模型，设置溶剂对照组与Brazilin给药组，动态监测两组小鼠术前、术后、给药3d、7d（溶剂组）及给药3d、7d、10d（Brazilin组）的下肢血流灌注情况，超声多普勒系统量化分析下肢血液供应恢复水平。取各组小鼠缺血腓肠肌组织制备石蜡切片，通过CD31、α-SMA免疫荧光双染检测组织中EndMT发生情况；制备腓肠肌冰冻切片，采用α-SMA、Vimentin免疫组化单染，分析间质标志物表达水平。提取各组小鼠缺血腓肠肌组织总蛋白，通过Western Blot实验检测内皮标志物（CD31、VE-cadherin）及间质标志物（α-SMA、Vimentin）的蛋白表达差异，从组织层面验证Brazilin对HLI模型血管新生与EndMT的调控作用。
2.缺氧微环境下Brazilin介导HCAEC发生“部分EndMT”、增强血管新生能力
  以人心脏冠状动脉内皮细胞（HCAEC）为研究对象，设置con组、缺氧组、缺氧+Brazilin低剂量组、缺氧+Brazilin高剂量组，探究缺氧条件下Brazilin对EndMT进程的调控效应。通过CCK8实验检测各组HCAEC细胞活性，验证Brazilin可有效逆转缺氧诱导的内皮细胞凋亡、改善细胞存活状态。利用qRT-PCR与Western Blot技术，分别检测各组细胞中CD31、VE-cadherin、α-SMA、Vimentin的mRNA及蛋白表达水平；采用CD31/α-SMA、VE-cadherin/Vimentin免疫荧光双染实验，分析各组细胞荧光强度及双阳性细胞比例，证实Brazilin可诱导HCAEC发生“部分EndMT”。管形成实验检测各组HCAEC的血管成管能力，评估内皮细胞血管重构功能；划痕实验与Transwell侵袭实验，检测Brazilin对缺氧状态下HCAEC迁移、侵袭能力的调控效果；利用主动脉环出芽实验，体外验证Brazilin可显著促进血管出芽新生。同时通过Western Blot实验检测各组HCAEC中血管新生关键蛋白MMP9的表达水平以探索细胞外基质重塑能力。
3.揭示Brazilin靶向Efemp1调控非经典Wnt通路、介导血管新生的分子机制
（1）Brazilin通过上调Efemp1参与缺血后血管新生
  动物水平验证Brazilin对缺血组织Efemp1表达的调控作用：基于sham组、MI组、MI+Brazilin低剂量组、MI+Brazilin高剂量组小鼠模型，取小鼠心脏组织与缺血腓肠肌组织制备切片，通过CD31、Efemp1免疫荧光双染实验，分析血管内皮区域Efemp1的表达变化，明确Brazilin可上调缺血模型血管内皮中Efemp1的表达水平。
  细胞水平验证Brazilin靶向调控Efemp1及下游通路：以con组、缺氧组、缺氧+Brazilin低剂量组、缺氧+Brazilin高剂量组HCAEC为研究对象，通过qRT-PCR、Western Blot、细胞免疫荧光实验，检测各组细胞中Efemp1的mRNA、蛋白表达水平及细胞定位表达差异。通过分子对接技术预测Brazilin与Efemp1蛋白的结合位点，结合热位移实验验证二者的直接结合作用，证实Brazilin可靶向结合并稳定Efemp1蛋白、促进其表达。进一步通过Western Blot实验检测各组HCAEC中非经典Wnt通路下游关键蛋白的表达变化，明确Efemp1介导的下游信号通路激活机制。
（2）Efemp1是Brazilin促进血管生成及调控“部分EndMT”的关键靶点
  基因沉默技术验证Efemp1的核心调控作用：在HCAEC中通过siRNA沉默Efemp1表达，设置缺氧组、缺氧+Brazilin组、缺氧+Brazilin+si Efemp1组、缺氧+Brazilin+si NC组。通过Western Blot检测各组细胞EndMT标志物蛋白表达；通过免疫荧光双染分析标志物荧光强度及双阳性细胞比例；通过划痕、Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力；通过Western Blot检测血管新生关键蛋白MMP9表达，明确沉默Efemp1可显著逆转Brazilin介导的部分EndMT及促血管新生效应，证实Efemp1是Brazilin发挥作用的核心靶点。
4.探索“Brazilin靶向Efemp1”作为抗缺血治疗新策略的可能性，利用Efemp1基因敲除小鼠验证Brazilin的治疗特异性
  使用Efemp1杂合（Efemp1+/-）鼠构建MI模型，分为WT+MI组、WT+MI+Brazilin组、Efemp1+/-+MI+Brazilin组。各组小鼠连续7d腹腔注射Brazilin干预后，通过小动物心脏超声检测小鼠心功能指标，评估心脏损伤修复效果；制备小鼠心脏冰冻切片，通过HE及Masson染色观察心肌病理损伤、统计新生血管数量，并观察胶原沉积情况；采用CD31/α-SMA、VE-cadherin/Vimentin免疫荧光双染，检测心肌组织EndMT及血管新生水平。提取心脏组织总蛋白，通过Western Blot检测Efemp1及下游非经典Wnt通路相关蛋白表达，从体内层面证实Brazilin通过Efemp1/Wnt通路改善MI后心肌损伤、促进血管新生。
  采用Efemp1全敲（Efemp1-/-）鼠构建HLI模型，设置WT+HLI组、WT+HLI+Brazilin组、Efemp1-/-+HLI+Brazilin组。通过超声多普勒成像动态检测各组小鼠下肢血流灌注恢复情况；制备缺血腓肠肌冰冻切片，通过CD31/α-SMA免疫荧光双染量化新生血管数量，α-SMA、Vimentin免疫单染分析间质活化水平。提取腓肠肌组织总蛋白，通过Western Blot检测内皮、间质标志物及Efemp1蛋白表达，明确敲除Efemp1后Brazilin促缺血下肢血管新生的效应显著被阻断，最终从体内层面完整验证Brazilin靶向Efemp1调控血管新生、治疗缺血性损伤的核心机制。
  MI后，缺血区心肌细胞的死亡和功能性血管的丧失是导致心力衰竭的根本原因。据统计，因急性心肌梗死入院的患者中心衰的发病率达14%-36%，其发生与大血管阻塞、微血管功能障碍、心肌顿抑和重构、炎症和神经激素激活等密切相关[1]。在心脏损伤与修复过程中，细胞表型的可塑性，尤其是EndMT，已成为调控心脏纤维化、血管新生及心功能恢复的关键机制。深入理解EndMT来源的间质细胞的功能及其在血管新生中的作用，对于开发心衰治疗新策略具有重要的理论与临床价值。
  对于促进治疗性血管新生（Therapeutic Angiogenesis）一直是心血管再生医学研究的热点和难点。血管生成是从已存在的血管中形成新血管的复杂过程，涉及多重调控机制（图1）包括基底膜降解、内皮细胞迁移增殖及新生血管壁的形成[2]。在MI后的心脏功能恢复中，强大的血管生成反应至关重要，它可以改善梗死边界区的内皮功能，减轻心肌重构[3]。

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图1 MI后心脏血管新生（angiogenesis）机制图[3]
  尽管血管内皮生长因子（VEGF）等促血管生成因子在临床前研究中显示出巨大潜力，但在临床试验的效果却不尽如人意[2]。究其原因，主要在于新生血管的成熟度和稳定性不足，且存在血管渗漏、炎症等副作用。这表明，仅仅促进内皮细胞的增殖是不够的，理解并调控血管新生的复杂细胞过程，特别是细胞间的相互作用和表型转换，对于开发更有效的促血管生成策略至关重要。
  内皮细胞作为覆盖于血管内表面的扁平上皮细胞，是维持血管壁通透性和血管稳态的核心[4]。在生理和病理条件下，内皮细胞展现出显著的表型可塑性，其中最为关键的转变之一即为EndMT。这一过程表现为内皮细胞丧失其典型特征，如CD31、VE-cadherin等内皮标志物下调，获得间质细胞表型，表达α-SMA、FSP-1等成纤维细胞标志物（图2）。EndMT最初被认为是导致心脏纤维化和瓣膜疾病的有害过程[5]。在心脏病理重构中，EndMT来源的间质细胞（即活化的成纤维细胞）扮演着核心致病角色。
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图2 EndMT过程示意图[4]
  心力衰竭以间质纤维化、心室重塑和心室顺应性降低为主要特征，MI后心衰的发生与大血管阻塞、微血管功能障碍、心肌顿抑和重构、炎症和神经激素激活等密切相关[6]，其病理基础正是心脏成纤维细胞的过度激活[7]。研究表明，活化的心脏成纤维细胞在心脏损伤后的重塑过程中至关重要[8]，这些成纤维细胞部分来源于内皮细胞通过EndMT转变而来，大量沉积细胞外基质蛋白，加速心力衰竭的进展[7]。然而，这一传统观点在近年来受到了挑战。越来越多的证据表明，EndMT是一个动态可逆的过程，其“部分”或“暂时”的激活对于正常的发育和损伤修复至关重要。例如，在胚胎发育过程中，心脏心内膜垫的形成就依赖于EndMT。在成体中，研究发现在肿瘤血管生成和伤口愈合过程中，部分EndMT来源的细胞可以作为“周细胞样”细胞，为新生血管提供覆盖和支持，从而促进血管的稳定和成熟[9,10]。在心肌缺血模型中，亦观察到了EndMT的发生，但其确切角色——有害还是有益，仍存在争议。近期研究进一步揭示，部分EndMT可能是解释这一矛盾的关键。Fang等人发现，GTF2H4通过NCOA3磷酸化激活NF-κB通路，调控缺血性疾病中的部分EndMT过程，为理解部分EndMT的动态调控提供了新视角（图3）。这表明，部分EndMT并非全或无的过程，细胞可能停留在中间状态，兼具内皮和间质特征，这种状态可能在血管新生中发挥独特作用。我们提出假说：适度、可控的“部分EndMT”可能在MI早期触发了一种修复性血管新生反应，其产生的间质样细胞是促进血管生成的关键细胞群体。明确这群细胞的功能及其调控机制，有望开辟促血管新生的新方向。
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图3 GTF2H4在缺氧诱导的“部分EndMT”中作用机制图[10]
  EndMT来源的间质细胞促进血管新生的机制主要体现在两个方面：一方面，这些细胞具有旁分泌功能，可分泌多种促血管生成因子，如VEGF、FGF、PDGF等，营造有利于血管新生的微环境[11]；另一方面，这些细胞可以转化为周细胞样细胞，通过与内皮细胞的直接接触，为新生血管提供结构支持和成熟信号[12]。心脏成纤维细胞作为松散结缔组织的主要细胞成分，在细胞外基质重塑和血管生成中发挥着至关重要的作用[11]。EndMT来源的间质细胞继承了成纤维细胞的这些功能，同时又保留了部分内皮细胞的特性，使其在纤维化与血管新生之间扮演着动态调节的角色。研究表明，这些细胞可以通过分泌基质金属蛋白酶（MMPs）重塑细胞外基质，为内皮细胞的迁移创造空间，同时通过沉积新的基质蛋白为血管新生提供支架[13]。此外，EndMT来源的细胞还参与调控血管新生过程中的炎症反应。适度的炎症信号有助于血管新生，而过度的炎症则导致血管渗漏和功能障碍。这些细胞可以通过分泌趋化因子和细胞因子，招募免疫细胞并调节其功能，间接影响血管新生[14]。
  苏木作为一种传统活血化瘀药，在中医临床上长期用于治疗瘀血阻滞之证。其活性成分Brazilin的药理活性研究日益受到关注，该分子结构式已被测定（图4）。

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图4 Brazilin的化学结构如图所示[17]
  已有研究证实，Brazilin具有抗炎、抗氧化和血管舒张等多种生物活性。Vij等人对苏木中的生物活性化合物进行了全面综述，系统总结了其药理作用[15]。Xie等人发现苏木提取物可通过内源性一氧化氮途径发挥血管舒张作用[16]。最新研究发现，Brazilin对人成纤维细胞具有保护作用，可减轻蓝光诱导的细胞损伤[17]。然而，Brazilin是否能作用于内皮细胞，调控其发生部分EndMT，进而影响血管新生，目前尚无任何报道。将传统中药的现代药理研究与细胞表型转化的前沿科学问题相结合，是本项目的一大特色。Efemp1（也称为Fibulin-3）是一种细胞外基质糖蛋白，属于Fibulin家族。它在多种生物学过程中发挥作用，包括弹性纤维组装、细胞粘附和迁移[18]。近年来，Efemp1在血管生物学中的作用逐渐被认识。本项目通过蛋白质组学分析发现Efemp1可能是Brazilin的潜在靶点，这将为揭示Efemp1在“部分EndMT”和血管新生中的新功能提供重要契机。
  本项目旨在探讨“部分EndMT”来源的间质细胞促进MI后血管新生的机制，以Brazilin为干预手段，以Efemp1为潜在靶点，系统研究其调控内皮细胞“部分EndMT”及促进血管新生的分子机制，为阐明“部分EndMT”在心脏修复中的双面性提供了新的理论视角，为开发基于“调控细胞表型转换”的心衰治疗新策略提供理论支撑，具有重要的应用价值与临床意义。
【参考文献】
[1] Khawaja Hassan Akhtar, Muhammad Shahzeb Khan, Suzanne J Baron, Shelley Zieroth, Jerry Estep, Daniel Burkhoff, Javed Butler, Marat Fudim. (2024). "The spectrum of post-myocardial infarction care: From acute ischemia to heart failure." Progress in Cardiovascular Diseases, 82, 15-25.
[2] Eelen G, Treps L, Li X, Carmeliet P. (2020). "Basic and Therapeutic Aspects of Angiogenesis Updated." Circulation Research 127(2): 310-329.
[3] Wu X, Reboll MR, Korf-Klingebiel M, Wollert KC (2021). "Angiogenesis after acute myocardial infarction." Cardiovascular Research 117(5): 1257-1273.
[4] Piera-Velazquez S, Jimenez SA. (2019). "Endothelial to Mesenchymal Transition: Role in Physiology and in the Pathogenesis of Human Diseases." Physiological Reviews 99(2): 1281-1324.
[5] Kovacic JC, Dimmeler S, Harvey RP, Finkel T, Aikawa E, Krenning G, Baker AH. (2019). "Endothelial to Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease: JACC State-of-the-Art Review." Journal of the American College of Cardiology 73(2): 190-209.
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[8] Guangyu Wang, Ana Sofia Cruz, Keith Youker, Hernan G Marcos-Abdala, Rajarajan A Thandavarayan, John P Cooke, Guillermo Torre-Amione, Kaifu Chen, Arvind Bhimara (2021). "Role of Endothelial and Mesenchymal Cell Transitions in Heart Failure and Recovery Thereafter." Frontiers in Genetics 11.
[9] Eric Ubil, Jinzhu Duan, Indulekha C L Pillai, Manuel Rosa-Garrido, Yong Wu, Francesca Bargiacchi, Yan Lu, Seta Stanbouly, Jie Huang, Mauricio Rojas, Thomas M Vondriska, Enrico Stefani, Arjun Deb (2014). "Mesenchymal–endothelial transition contributes to cardiac neovascularization." Nature 514(7524): 585-590.
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[12] Wenyan Dong, Yue Zhao, Daqiang Wen, Yingjiong Lin, Chui Zeng, Jingkai Gu, Fan Liao, Ruiqi Li, Xu Zhang, Dianliang Wang, Wenqian Cai, Jinzhu Duan (2022). "Wnt4 is crucial for cardiac repair by regulating mesenchymal-endothelial transition via the phospho-JNK/JNK." Theranostics 12(9): 4110-4126.
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[18] Youwen Zhang, Lihua Y Marmorstein (2010). "Focus on molecules: fibulin-3 (EFEMP1)." Experimental Eye Research 90(3): 374-375.
1.摒弃EndMT“促纤维化”负面作用的传统观念，提出“部分EndMT来源的间质细胞在MI后血管新生中发挥关键积极作用”的新方向。
2.探究“部分EndMT”来源细胞的功能特性，特别是其在迁移、侵袭、基质重塑及作为“支架细胞”支持血管新生方面的具体作用，深化了对血管新生细胞机制的理解。
3.发现传统中药活性成分Brazilin能够诱导“部分EndMT”，验证其关键靶点Efemp1，揭示中药单体调控细胞表型转化的新机制。
4.阐明Efemp1在“部分EndMT”和血管新生过程中的作用及其下游信号通路，为MI治疗提供了一个全新的、可干预的分子靶点。
【技术路线】

1.验证MI模型构建后发生“部分EndMT”，并研究Brazilin作用

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2.单侧下肢缺血实验，证明Brazilin促进“部分EndMT”增加血管形成

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3.培养HCAEC细胞，进行细胞实验证明缺氧和Brazilin靶向Efemp1促进细胞“部分EndMT”的发生

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4.探究Brazilin促进血管新生的下游分子调控机制

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【拟解决的问题】
1.MI后，梗死边缘是否发生了“部分EndMT”？这种“部分EndMT”与血管新生是否存在正相关？
2.Brazilin能否在体内外诱导内皮细胞发生“部分EndMT”？这种转化是否能增强内皮细胞的迁移、侵袭和管形成能力，从而促进缺血后的血管新生？
3.Efemp1是否是Brazilin诱导“部分EndMT”的关键分子？其调控“部分EndMT”及促进血管新生的机制是什么？

【预期成果】
1.明确Brazilin对EndMT相关标志物（CD31、VE-cadherin、α-SMA、Vimentin）的调控模式，并证实Brazilin在血管生成中的积极作用。
2.通过动物及细胞实验，筛选Brazilin调控的关键靶点蛋白Efemp1，揭示Brazilin调控“部分EndMT”的核心信号通路。
3.本课题预期在国际重要学术刊物上发表SCI论文1-2篇，参加国内学术会议1-2次。


时间
项目进度
2026年6月-2027年5月
完成动物实验。在构建的Efemp1+/-基因敲减鼠的MI模型中，取小鼠心脏组织切片，进行Western Blot实验检测Efemp1蛋白及EndMT相关标志物蛋白的表达水平，并对梗死区进行免疫荧光染色检测CD31和α-SMA的表达情况。在构建的Efemp1-/-基因敲减鼠的HLI模型中，通过激光多普勒成像检测下肢血流灌注情况，Western Blot实验检测缺血腓肠肌中EndMT相关标志物蛋白及Efemp1蛋白的表达，同时通过免疫组化及免疫荧光实验进行论证，探究Brazilin的下游分子机制，证明Brazilin靶向Efemp1促进部分EndMT增加血管形成。
2027年6月-2027年12月
完成细胞实验。使用HCAEC细胞，通过成管实验、划痕实验、Transwell侵袭实验验证Brazilin对细胞迁移侵袭能力的作用。检测缺氧条件下及Brazilin给药后HCAEC细胞中Efemp1表达水平。并通过质粒转染HCAEC细胞沉默Efemp1基因的表达，通过免疫荧光检测细胞中EndMT相关标志物蛋白情况，探究沉默Efemp1基因后对细胞的影响。再检测HCAEC细胞中非经典Wnt通路相关蛋白水平，从而在细胞水平验证药物的有效性并进一步探究Brazilin靶向Efemp1的分子调控机制。
2028年1月-2028年6月
整理实验数据，撰写论文，发表SCI论文1-2篇。


（1）购进基因敲除鼠，杂交后得其子代进行实验
  为保障实验进行，验证目标靶点，我们购买C57BL/6鼠（WT）、Efemp-/-和Efemp+/-小鼠，由鼠尾鉴定结果可知，已获得Efemp1+/-及Efemp1-/-的基因鼠（图5），为后续实验的开展奠定基础。
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图5 杂交鼠基因型鉴定结果
（2）Brazilin可以通过促进梗死区的血管新生改善MI
  为了探究Brazilin对MI小鼠是否有治疗作用，我们对C57BL/6J小鼠进行了左前降支冠状动脉结扎手术，构建MI动物模型。造模成功后使用超声检测小鼠心脏心功能指标。超声心动图结果显示（图6A），MI导致小鼠心脏功能受损，表现为射血分数、短轴缩短率显著下降，收缩末期左室内径、舒张末期左室内径扩大，心输出量降低及左室壁厚度变薄；Brazilin治疗可以恢复心脏收缩功能并减轻心室扩张，表现为射血分数、短轴缩短率显著升高，收缩末期左室内径、舒张末期左室内径缩小，心输出量升高。此外，我们对MI小鼠心脏切片进行HE染色（图6B）、Masson染色（图6C）观察心脏胶原面积，结果发现与MI组相比，Brazilin处理后心脏组织中胶原含量降低且心脏中新生小血管数量明显增加，证实了Brazilin能促进梗死区血管新生改善MI。通过激光多普勒成像技术，我们检测HLI小鼠在Brazilin给药后后肢血流恢复情况，发现HLI术后，注射生理盐水小鼠血流恢复缓慢，而Brazilin治疗后血流灌注明显改善（图6D）。这些结果表明，Brazilin对缺血性疾病具有治疗作用。
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图6 Brazilin促进血管新生改善心肌梗死
A.小鼠心脏超声心动图及心功能相关指标定量分析。B.小鼠心脏组织的HE染色及血管数量的分析。C.小鼠心脏组织的Masson染色及胶原面积分析。D.小鼠下肢血流灌注情况的多普勒成像检测结果。
（3）Brazilin可通过调控“部分EndMT”过程进而促进血管新生
  近年研究发现，EndMT可促进新生血管的延展和组织重建，其产生的间质样细胞有助于新生血管的成熟与稳定。为验证Brazilin能否通过调控“部分EndMT”过程改善MI，我们提取HLI小鼠缺血腓肠肌组织蛋白，Western Blot检测内皮间质标志物蛋白的表达，结果显示，与HLI组相比，Brazilin治疗后，缺血腓肠肌组织中CD31和VE-cadherin表达下调，但仍保留内皮特性，α-SMA和Vimentin表达上调（图7A），说明Brazilin促进了“部分EndMT”的发生。此外，我们对梗死区进行免疫荧光染色，结果显示与对照组相比，Brazilin治疗后CD31⁺α-SMA⁺双阳性细胞比例升高，且CD31阳性细胞中α-SMA总荧光强度增强，α-SMA主要呈环状分布于CD31阳性细胞血管内皮腔外侧，且梗死区小血管数量显著增加（图7B）。接着对HLI小鼠的缺血腓肠肌进行免疫荧光双染VE-cadherin和Vimentin，结果显示，与HLI组相比，腓肠肌组织中VE-cadherin⁺Vimentin⁺双阳性细胞比例升高，且VE-cadherin阳性细胞中Vimentin总荧光强度增强，同样说明Brazilin促进了EndMT发生，同时缺血区小血管数量显著增加（图7C）。
  为在细胞层面验证Brazilin的作用，我们购买了HCAEC细胞，并评估不同浓度下Brazilin对细胞的毒性作用。CCK-8结果显示，在0-40μM范围内，10μM和20μM Brazilin处理后细胞存活率最高且10μM、20μΜ Brazilin对HCAEC细胞活性无影响（图7D），因此，后续实验选用10μM和20μM Brazilin。为模拟MI缺血血氧微环境，将HCAEC细胞置于严格控制的缺氧条件（1% O2）及无血清培养环境24 h。Western Blot实验结果显示，与Hypoxia组相比，Brazilin干预后，间质标志物Vimentin、α-SMA蛋白表达上调，内皮标志物VE-cadherin、CD31蛋白表达显著下调，但未完全消失，提示细胞发生了“部分EndMT”（图7E）。这些结果表明，Brazilin可以促进“部分EndMT”的发生，使缺血区小血管数量增加，促进血管新生。
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图7 Brazilin介导“部分EndMT”促进血管新生
A.Western Blot检测缺血腓肠肌中VE-cadherin、CD31、Vimentin、α-SMA蛋白水平。B.免疫荧光双染心脏组织检测CD31和α-SMA的表达。C.免疫荧光双染缺血腓肠肌组织检测VE-cadherin和Vimentin的表达。D.CCK-8实验检测Brazilin对细胞活性影响。E.Western Blot检测HCAEC细胞中VE-cadherin、CD31、Vimentin、α-SMA蛋白水平。
（4）Brazilin靶向Efemp1介导“部分EndMT”发生
  Efemp1是一种分泌型糖蛋白，广泛表达于心血管系统、肝脏、肾脏等多种组织器官中，参与细胞外基质的构建、调控细胞增殖分化。已有研究发现，Efemp1能够促进EndMT。为研究Efemp1是否为Brazilin作用靶点，及二者相互作用关系，我们首先通过分子对接预测Brazilin的作用靶点，检测Brazilin与Efemp1的结合能力，结果显示Brazilin可稳定结合于Efemp1的结合口袋，最佳结合能为-8.282 kcal/mol，提示二者具有较强的结合亲和力（图8A-B）。随后取小鼠心脏和缺血腓肠肌组织切片，免疫荧光双染CD31和Efemp1的，发现心脏（图8C）和缺血腓肠肌组织（图8D）中，与sham组相比，MI或HLI后组织中CD31阳性细胞中Efemp1荧光强度表达升高，且CD31⁺Efemp1⁺双阳性细胞比例升高，说明Brazilin可促进Efemp1的上调。此外，我们在细胞层面进行了验证，免疫荧光染色HCAEC细胞，结果显示，缺氧条件下HCAEC细胞中Efemp1表达稍微上调，而Brazilin给药后，Efemp1的荧光强度明显增加，其中20μM剂量Brazilin处理的HCAEC细胞中Efemp1的荧光强度最显著（图8E）；Western Blot实验检测HCAEC细胞中Efemp1蛋白表达情况，发现Brazilin可以促进Efemp1蛋白表达上调，与荧光实验结果一致（图8F）。接着使用质粒转染HCAEC细胞沉默Efemp1基因的表达，Western Blot实验检测HCAEC细胞中内皮和间质标志物蛋白表达水平，发现Brazilin能使VE-cadherin和CD31表达下调，α-SMA和Vimentin表达上调。沉默Efemp1后显著逆转了上述变化，表现为内皮标志物表达升高，间质物表达下调（图8G）。这些结果表明，Efemp1是Brazilin诱导“部分EndMT”发生的关键下游分子。
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图8 Efemp1是Brazilin的作用靶点
A.配体-靶点相互作用二维示意图。B.Beazilin与Efemp1结合的三维视图及Efemp1蛋白的三维结构，展示了配体在蛋白中的结合区域。C.免疫荧光双染检测心脏梗死区CD31和Efemp1的表达及荧光强度分析。D.免疫荧光双染检测缺血腓肠肌中CD31和Efemp1的表达及荧光强度分析。E.免疫荧光染色检测HCAEC细胞中Efemp1的表达及荧光强度分析。F.Western Blot检测HCAEC细胞中Efemp1蛋白表达水平。G.使用质粒转染HCAEC细胞沉默Efemp1基因的表达，及Western Blot检测HCAEC细胞中VE-cadherin、CD31、Vimentin和α-SMA蛋白的表达。
（5）利用基因敲除鼠体内实验验证Efemp1介导Brazilin改善心肌缺血性梗死
  为在体内进一步确认Efemp1在Brazilin促进血管新生以及治疗缺血损伤的作用，我们构建MI模型小鼠（图9A），术后连续7d腹腔注射给Brazilin(10mg/kg)后，心脏超声检测小鼠心功能，结果显示，Brazilin改善WT小鼠心功能，但对Efemp1+/-小鼠无明显作用，WT小鼠中射血分数、短轴缩短率显著上调，心输出量升高及左室壁厚度变厚，而Efemp1+/-小鼠中，射血分数、短轴缩短率显著下调，说明Brazilin治疗无法逆转Efemp1基因敲减造成的心功能损伤（图9B）。通过HE和Masson染色，结果显示与WT鼠相比，Efemp1+/-小鼠心脏组织中血管生成数量减少（图9C），瘢痕面积增多（图9D）。心脏组织的Western Blot实验结果显示，发现与WT+MI组相比，Brazilin给药后VE-cadherin和CD31表达下调，α-SMA和Vimentin表达上调，证明Brazilin在梗死心脏中发生部分EndMT，而在Efemp1+/-+MI+Brazilin组小鼠中，Brazilin诱导的内皮标志物下调和间质标志物上调均被抑制（图9E）。这些结果表明，Brazilin治疗无法逆转Efemp1基因敲减造成的心损伤，Efemp1是Brazilin的作用靶点，只有在该基因表达时Brazilin才能发挥治疗作用。
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图9 Brazilin靶向Efemp1改善心肌梗死
A.小鼠造模示意图。8周龄雄性C57BL/6J小鼠（WT及Efemp1+/-基因型）进行左前降支冠状动脉结扎建立MI模型，设置分组为：WT+MI组、WT+MI+Brazilin（10mg/kg）组、Efemp1+/-+MI+Brazilin（10mg/kg）组，术后连续给药处理，7d后进行超声心动图检查后处死小鼠取材。B.小鼠心脏超声心动图及心功能相关指标定量分析。C.小鼠心脏组织的HE染色及血管数量的分析。D.小鼠心脏组织的Masson染色及胶原面积分析。E.Western Blot实验检测心脏组织中VE-cadherin、CD31、Vimentin和α-SMA蛋白表达水平。
  该项目依托药学院药理研究中心，有一支基础研究与临床紧密结合的学术队伍，建立了先进的实验技术支撑条件和良好的学术氛围。实验室拥有动物实验中心，拥有先进的仪器设备，包括Real time-PCR系统、冰冻切片机、石蜡切片机、倒置荧光显微镜、Western blot等本课题需要的仪器，为本课题的顺利实施和完成提供有力保障。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 14600.00 5400.00
1. 业务费 5700.00 无 300.00 5400.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 300.00 购买实验材料的交通工具费 300.00 0.00
（3）会议、差旅费 1400.00 参加该实验相关的学术会议 0.00 1400.00
（4）文献检索费 0.00 Pubmed及校内图书馆可解决 0.00 0.00
（5）论文出版费 4000.00 发表论文 0.00 4000.00
2. 仪器设备购置费 1000.00 购买本实验必需的实验设备 1000.00 0.00
3. 实验装置试制费 2000.00 实验过程中的耗材等费用 2000.00 0.00
4. 材料费 11300.00 购买实验动物、细胞等费用 11300.00 0.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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