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C3a/C3aR系统在阿霉素诱导化疗相关认知功能障碍中的作用和机制研究

申报人：鹿枫洋 申报日期：2026-03-16

基本情况

2026创新项目
C3a/C3aR系统在阿霉素诱导化疗相关认知功能障碍中的作用和机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目聚焦化疗相关认知功能障碍（CRCI）的发病机制与干预靶点，构建阿霉素诱导的小鼠认知功能障碍在体模型及脑微血管内皮细胞bEnd.3损伤离体模型，检测C3a/C3aR时序性表达。检测给予重组C3a是否诱发细胞线粒体功能障碍，探究其通过调控线粒体Ca2+稳态介导内皮细胞损伤的机制，C3a/C3aR异常表达是否为CRCI的发病机制之一。在体、离体模型中验证C3a/C3aR系统对阿霉素诱导的认知功能障碍、血脑屏障破坏及线粒体功能损伤的调控作用，对比C3aR抑制剂与线粒体Ca2+转运体抑制剂的干预效应。本研究旨在揭示C3a/C3aR系统在阿霉素致认知障碍中的核心作用及分子机制，为临床防治化疗相关认知功能障碍提供新的理论依据和潜在靶点。
负责人参与指导教师科研项目，具有一定的实验室工作基础。已掌握细胞培养、Western blot、水迷宫、旷场等实验技术。
承担山东省自然科学基金1项，指导国家级大学生创新训练计划项目1项、省级大学生创新训练计划项目2项，参与国家级、省市级课题多项。
指导教师多年来一直从事神经系统损伤与修复的相关研究，熟练掌握相关分子生物学实验技术、动物模型制备、行为学检测等技术，能够给予本研究小组足够的理论和技术指导。除本项目申请经费外，指导教师科研、教研项目经费也可用于本项目支出。指导教师所在实验室具备完成本项目所需的软硬件设备、条件。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
鹿枫洋 护理学院 护理学（四年制本） 2025 相关分子生物学实验、动物行为学检测
王小玮 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 小鼠模型制备、血脑屏障通透性检测
阿依则巴·阿布都热合曼 护理学院 护理学（四年制本） 2025 小鼠模型制备、血脑屏障通透性检测
高凡歌 护理学院 护理学（四年制本） 2025 相关分子生物学实验
李亦菲 护理学院 护理学（四年制本） 2025 相验关分子生物学实
刘锦雨 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 相关分子生物学实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
武菲 研究生处 否

立项依据

1. 明确阿霉素诱导化疗相关认知功能障碍（‌Chemotherapy-Related Cognitive Impairment, CRCI）中C3a/C3aR系统的表达改变，及其表达改变对脑微血管内皮细胞损伤的作用；
2. 检测抑制C3a/C3aR能否改善阿霉素诱导的脑微血管内皮细胞损伤、动物模型认知功能障碍；
3. 探究C3a/C3aR系统在化疗相关认知功能障碍（CRCI）中的作用，筛选CRCI可能的治疗靶点，为开发针对性的防治策略提供一定的理论依据。
  1. 阿霉素诱发认知功能障碍模型构建与评估（在体、离体实验）
  （1）小鼠化疗相关认知功能障碍模型的构建与评估（在体实验）
  健康雄性C57BL/6小鼠，适应性饲养1周，饲养环境保持温度22±2℃、湿度50±5%，昼夜节律12h光照/12h黑暗，自由进食、饮水，每日观察小鼠精神状态、进食进水情况，剔除精神萎靡、体重异常、患病的小鼠，确保实验小鼠基线状态一致，减少实验误差。小鼠随机分为对照组、DOX 2.5mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg组。对照组腹腔注射等体积生理盐水，注射频率与处理组一致；DOX各组分别腹腔注射2.5、5、7.5 mg/kg DOX，每周一次，连续4周。自首次注射DOX之日起，每日监测并记录各组小鼠的相关指标，直至末次注射后1周，监测内容包括：
  精神状态：观察小鼠的活动量、反应灵敏度、毛发状态（是否光滑、有无脱毛）、有无嗜睡、烦躁、共济失调等异常表现，每日记录1次；进食进水情况：每日固定时间称量各组小鼠的进食量、饮水量，计算每只小鼠日均进食量、饮水量，对比各组差异，记录是否出现进食减少、饮水下降等情况；体重变化：每周称量3次小鼠体重，分别在注射前、注射24h、注射72h之后，记录每只小鼠的体重数据，计算体重增长率，观察不同剂量DOX对小鼠体重的影响，若小鼠体重下降超过20%，需及时记录并评估模型合理性。
  （2）构建阿霉素诱导的脑微血管内皮细胞损伤模型（离体实验）
  培养小鼠源脑微血管内皮细胞bEnd.3，进行DOX处理。设置DOX浓度梯度（0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L），分别于12、24、48小时采用CCK-8检测细胞存活率。数据统计分析，绘制DOX浓度-细胞存活率曲线，筛选出对细胞存活率有显著影响的DOX浓度，作为后续离体损伤模型的最佳处理浓度，验证离体模型构建效果。
  2. C3a/C3aR在阿霉素诱导的脑微血管内皮细胞损伤中的作用（离体实验）
  （1）检测离体模型中C3a及其受体C3aR的表达改变
  DOX处理细胞12、24、48小时后，Elisa检测细胞裂解样本中C3a水平，Western Blot检测细胞中C3aR表达水平，明确DOX是否引起C3a/C3aR时序性表达改变。
  （2）给予重组C3a、线粒体Ca2+转运体抑制剂，检测上调C3a能否诱发脑微血管内皮细胞损伤，探讨可能的机制
  小鼠重组C3a（1μg/mL）处理bEND.3细胞24小时，JC-1检测对照组与重组C3a处理组线粒体膜电位，Rhod-2 AM和Mito-Tracker Green染色检测各组线粒体Ca2+水平，CCK-8检测各组细胞存活率，探索直接给予高剂量C3a是否诱发细胞线粒体功能障碍，影响细胞存活率。
  给予线粒体Ca2+转运体抑制剂Ru360，对比检测重组C3a组、重组C3a + 抑制剂Ru360组，线粒体膜电位、线粒体Ca2+水平以及细胞存活率，探讨C3a是否影响线粒体Ca2+摄取，是否是其引起bEND.3细胞损伤的机制。
  （3）抑制C3a/C3aR能否改善阿霉素诱导的脑微血管内皮细胞损伤，探讨可能的机制
  C3aR抑制剂SB 290157处理细胞，设置对照组、溶剂对照组、DOX组、C3aR抑制剂SB 290157组、DOX+抑制剂SB 290157组、DOX+线粒体Ca2+转运体抑制剂Ru360组，CCK-8检测细胞存活率，相应试剂盒检测各组样本LDH、ROS、ATP、H2O2、总谷胱甘肽等，JC-1检测线粒体膜电位，Rhod-2 AM和Mito-Tracker Green染色检测线粒体Ca2+水平，通过上述实验检测各组细胞活力以及线粒体功能状态。Western Blot检测细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达水平。划痕实验、Transwell侵袭实验、Tube-formation检测细胞增殖和迁移。通过上述实验检测：
  a. DOX对脑微血管内皮细胞线粒体功能、细胞屏障、增殖、迁移及管腔形成的影响；
  b. 抑制C3a受体能否阻断DOX的损伤作用；
  c. 对比抑制C3a受体和抑制线粒体Ca2+转运体对DOX诱发的细胞损伤的效应。
  3. C3a/C3aR在阿霉素诱导小鼠认知功能障碍模型中的作用（在体实验）
  （1）检测在体模型中C3a及其受体C3aR的表达改变：
  根据第1部分结果，后续动物实验选择DOX 5mg/kg腹腔注射1次/周，连续4周，Elisa检测对照组、DOX处理组实验动物血清C3a表达水平，免疫荧光染色双染血管内皮细胞标记物CD31、C3a受体C3aR，明确在体模型中DOX是否引起C3a/C3aR时序性表达改变。
  （2）抑制C3a/C3aR能否改善阿霉素诱导的动物模型认知功能障碍
  设置对照组、溶剂对照组、DOX组、C3aR抑制剂SB 290157组、DOX+抑制剂SB 290157组、DOX+线粒体Ca2+转运体抑制剂Ru360组，比较各组小鼠行为学改变，进行神经功能评分、新事物识别任务、社交识别任务、水迷宫，通过上述实验检测：抑制C3a受体能否阻断DOX诱发的认知功能障碍，对比抑制C3a受体和抑制线粒体Ca2+转运体对DOX损伤的效应。
  （3）抑制C3a/C3aR能否改善阿霉素诱导的血脑屏障和细胞线粒体功能损伤
  设置对照组、溶剂对照组、DOX组、C3aR抑制剂SB 290157组、DOX+抑制剂SB 290157组、DOX+线粒体Ca2+转运体抑制剂Ru360组，伊文思蓝检测各组血脑屏障通透性，免疫荧光染色双染血管内皮细胞标记物CD31与紧密连接蛋白ZO-1或Occludin，相应试剂盒检测各组样本ROS、ATP、H2O2、总谷胱甘肽等，Western blot检测各组Cytochrome C、cleaved Caspase-3。通过上述实验检测DOX是否导致血脑屏障通透性增加、线粒体功能损伤，而抑制C3a受体和抑制线粒体Ca2+转运体能否逆转DOX的效应，探讨DOX诱发的脑微血管内皮细胞线粒体功能障碍是否是其导致血脑屏障通透性增加、认知功能障碍的机制，C3a/C3aR介导DOX诱发的线粒体功能损伤，抑制C3a/C3aR能否逆转DOX损伤。
  1. 化疗相关认知功能障碍与阿霉素临床应用
  化疗是临床肿瘤治疗的重要方法之一，在提高患者生存率的同时，也存在一定的副作用。化疗相关认知功能障碍（chemotherapy-related/induced cognitive impairment，CRCI或CICI）又称“化疗脑”（chemobrain）或“化疗雾”（chemofog），是肿瘤患者在化疗后常见的中枢神经系统并发症，认知功能障碍可表现为记忆功能、执行功能、注意力及信息处理速度下降等[1]。
  阿霉素（Doxorubicin，DOX）是从波赛链霉菌变种链霉菌发酵液提取的糖苷类抗生素，是蒽环类抗肿瘤药物的典型代表，在癌症化疗领域占据着不可或缺的地位。DOX通过嵌入肿瘤细胞DNA双链，抑制拓扑异构酶Ⅱ的活性，干扰DNA复制与转录过程，从而对多种实体瘤（如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等）和血液系统恶性肿瘤（如白血病、淋巴瘤等）展现出强大的杀伤作用，成为肿瘤化疗方案中的常用药物[2,3]。
  2. DOX诱发CRCI的可能机制
  DOX在发挥抗肿瘤功效的同时，也伴随着一系列副作用，其中就包括CRCI。CRCI的发生率在接受阿霉素治疗的患者中高达60%，且这种认知损伤可能在治疗后长期存在，甚至逐渐加重，成为阻碍癌症患者长期生存与生活质量提升的重要因素[4]。目前，CRCI的发病机制尚未完全明确，这极大地限制了CRCI防治策略及有效治疗靶点的开发。已有研究提示，氧化应激、神经炎症、细胞凋亡等多种病理过程可能参与其中[5]，但这些机制仍无法全面解释CRCI的发生发展。
  3. C3a/C3aR系统
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  图1. C3a/C3aR系统及已开发C3aR抑制剂示意图[8]

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  图2. 衰老模型中C3a/C3aR系统功能亢进损伤血脑屏障，加重免疫反应[9]
 
  补体系统（Complement System）是一种生物级联反应体系，能被众多因素激活发生级联酶促反应。普遍认为补体激活通过三种途径，即经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素途径。三种激活途径生成的C3转化酶裂解补体C3生成小片段C3a，C3a是补体系统的活化片段之一。经检测，C3a广泛存在于血液和组织液中。已有报道C3a是一种强过敏性毒素，参与过敏性哮喘、同种异体移植排斥、神经退行性疾病和癌症等的病例生理机制。C3a的受体（C3aR）是一种G蛋白偶联受体，主要表达于免疫细胞（肥大细胞、嗜碱性粒细胞等）和非免疫细胞（如内皮细胞、神经元等）。C3a/C3aR系统是补体介导的炎症与免疫调节的关键通路，在感染、自身免疫、神经系统等疾病中发挥重要作用，是具有潜力的研究对象（图1）。
  有相关研究表明，在新辅助化疗后血浆中的C3水平较前明显升高[6]。其他相关文献指出HBMECs中C3a诱导浓度依赖性细胞旁屏障破坏，并增加了跨细胞通透性[7]。衰老时，C3a结合C3aR使皮层和海马中内皮细胞内Ca2+水平升高，进而损伤紧密连接蛋白VE-Cadherin，造成血脑屏障渗漏，活化的白细胞、炎性因子等从血管穿过血脑屏障进入脑组织间隙（图2），加重神经系统免疫反应。上述结果对本研究有一定提示。
  因此，本研究以经典补体成分C3a/C3aR为研究靶点，探索CRCI发病机制，并探讨C3a/C3aR能否成为CRCI治疗靶点。

主要参考文献：
[1] Lange M, Licaj I, Clarisse B, Humbert X, Grellard JM, Tron L, Joly F. Cognitive complaints in cancer survivors and expectations for support: Results from a web-based survey. Cancer Med. 2019 May;8(5):2654-2663. doi: 10.1002/cam4.2069. Epub 2019 Mar 18. PMID: 30884207; PMCID: PMC6536919.
[2] Zhang S, Xu HF, Zhang ZX, Wang Y, Zhu SH. Research on Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity Mechanism and Its Forensic Application. Fa Yi Xue Za Zhi. 2025 Apr 25;41(2):120-126. English, Chinese. doi: 10.12116/j.issn.1004-5619.2024.440404. PMID: 40813079.
[3] Patel S, Sprung AU, Keller BA, Heaton VJ, Fisher LM. Identification of yeast DNA topoisomerase II mutants resistant to the antitumor drug doxorubicin: implications for the mechanisms of doxorubicin action and cytotoxicity. Mol Pharmacol. 1997 Oct;52(4):658-66. doi: 10.1124/mol.52.4.658. PMID: 9380029.
[4] McAlpin BR, Mahalingam R, Singh AK, Dharmaraj S, Chrisikos TT, Boukelmoune N, Kavelaars A, Heijnen CJ. HDAC6 inhibition reverses long-term doxorubicin-induced cognitive dysfunction by restoring microglia homeostasis and synaptic integrity. Theranostics. 2022 Jan 1;12(2):603-619. doi: 10.7150/thno.67410. PMID: 34976203; PMCID: PMC8692908.
[5] Kim HG, Rashid MA, Poleschuk M, Ullah F, Lee SH, Kim SH, Qin B, Zheng XFS, Jang MH. Cognitive dysfunction in chemobrain: Molecular mechanisms and therapeutic implications. Biomed Pharmacother. 2025 Sep 24;192:118581. doi: 10.1016/j.biopha.2025.118581. Epub ahead of print. PMID: 40997625.
[6] Abu-Humaidan AH, Ismail MA, Ahmad FM, Al Shboul S, Barham R, Tadros JS, Alhesa A, El-Sadoni M, Alotaibi MR, Ababneh NA, Saleh T. Therapy-induced senescent cancer cells exhibit complement activation and increased complement regulatory protein expression. Immunol Cell Biol. 2024 Apr;102(4):240-255. doi: 10.1111/imcb.12727. Epub 2024 Jan 24. PMID: 38265162.
[7] Wolf HN, Guempelein L, Schikora J, Pauly D. C3a Mediates Endothelial Barrier Disruption in Brain-Derived, but Not Retinal, Human Endothelial Cells. Int J Mol Sci. 2024 Oct 19;25(20):11240. doi: 10.3390/ijms252011240. PMID: 39457022; PMCID: PMC11508547.
[8] Buelli S, Imberti B, Morigi M. The Complement C3a and C5a Signaling in Renal Diseases: A Bridge between Acute and Chronic Inflammation. Nephron. 2024;148(10):712-723. doi:10.1159/000538241
[9] Bhatia K, Ahmad S, Kindelin A, Ducruet AF. Complement C3a receptor-mediated vascular dysfunction: a complex interplay between aging and neurodegeneration. J Clin Invest. 2021;131(1):e144348. doi:10.1172/JCI144348
  1. 创新点
  （1）揭示CRCI新的发病机制点：化疗相关认知功能障碍（CRCI）是亟待解决的肿瘤心理学热点问题，与患者预后及生活质量密切相关，但其发病机制和防治措施尚未解决。本研究聚焦经典补体成分C3a/C3aR，其在CRCI中的作用尚未见相关报道，有望揭示CRCI发病的全新分子机制。
  （2）探索C3a/C3aR能否成为CRCI新的治疗靶点：明确C3a/C3aR在CRCI中对认知功能、血脑屏障功能的作用，为开发针对性的防治策略提供关键的理论依据和潜在的药物靶点，对于改善癌症患者的预后、提高其生活质量具有重要的科学意义和临床应用价值。
  2. 项目特色
  转化优势突出：C3aR为G蛋白偶联受体，已开发出稳定的抑制剂，实现临床转化应用具有可操作性和应用价值。相比较C3aR抑制剂，针对线粒体Ca2+转运体的抑制剂Ru360稳定性差，储存条件严格，配制后有效期短，易失效，限制了其进一步开发应用。依托C3aR抑制剂研发基础和临床前研究基础，无需从头开发药物，可快速推进临床前有效性/安全性评价，缩短从基础到临床的转化周期，应用价值明确。
  临床应用价值强：项目指导教师在临床工作中注意到CRCI在乳腺疾病化疗患者中的表现具有特异性，具体表现为记忆力减退、注意力不集中、思维迟缓、执行功能下降、定向力障碍等，这些认知功能损伤会直接影响患者的日常生活能力——年轻患者难以正常工作、照顾家庭，老年患者则可能出现生活自理能力下降，无法准确遵医嘱完成后续复查、服药等治疗相关事宜，进而降低治疗依从性，间接影响肿瘤治疗效果与长期预后。同时，认知功能的异常还会给患者带来沉重的心理负担，多数患者会因自身认知下降产生焦虑、抑郁、自卑等负面情绪，丧失治疗信心，甚至拒绝进一步治疗，加剧生存质量的恶化。因此，改善乳腺疾病化疗患者的CRCI症状，不仅能直接缓解患者的认知痛苦、改善心理状态，帮助患者更好地回归家庭与社会，还能提高患者的治疗依从性，降低复发风险、改善长期预后。目前，从临床实践来看，针对CRCI尚无明确有效的防治手段，因此开展相关研究对填补临床治疗空白、优化乳腺疾病患者全周期治疗管理、提升患者生存质量具有重要的临床实用价值与社会意义。
技术路线：
1.体内外DOX诱导CRCI模型的构建，高水平C3a诱导脑微血管内皮细胞损伤（在体、离体实验）
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2.C3a/C3aR在阿霉素诱导的脑微血管内皮细胞损伤中的作用（离体实验）
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3.C3a/C3aR在阿霉素诱导小鼠认知功能障碍模型中的作用（在体实验）
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拟解决的关键问题：
1. 阿霉素是否会激活C3a/C3aR系统；
2. C3a/C3aR功能亢进是否诱发微血管内皮细胞损伤，细胞线粒体功能、屏障功能如何；
3. C3a/C3aR激活后是否会加重脑血管内皮损伤，进而导致认知障碍；
4. C3a/C3aR在疾病模型中对小鼠行为学的影响。
预期成果：
培养本科生5人，发表实验相关论文1篇。参加大学生科技创新竞赛，争取获得校级以上奖励。
2026.03-2026.06：在体、离体CRCI模型的构建与验证，检测C3a、C3aR表达水平；重组小鼠源C3a处理bEND.3细胞，检测细胞存活率、线粒体功能等。
2026.07-2026.12：离体模型中给予C3aR抑制剂及线粒体Ca2+转运体抑制剂，检测细胞存活率、线粒体功能、细胞增殖与迁移、细胞屏障等。
2027.01-2027.06：在体模型给予C3aR抑制剂，检测线粒体功能、血脑屏障通透性、微血管密度，进行水迷宫等各项行为学检测。
2027.07-2027.12：完善在体模型行为学检测。数据整理，论文撰写。
2028.01-2028.06：论文撰写与发表。
  （1）实验技术：本团队成员通过前期预实验，已经掌握体内外模型制备、细胞培养、Western blot、CCK-8、免疫荧光染色等关键实验技术。已完成重要实验步骤、条件的梳理，为后续实验打好了基础。
  （2）已有结果：目前已完成在体、离体模型构建的验证，Elisa检测证实C3a高表达。
  1.已具备的条件：
  实验技术及设备支撑：本研究采用的Western blot、免疫荧光、细胞培养、动物行为学实验等技术均为神经科学领域的常规实验技术，本项目指导教师团队长期从事相关研究，具备扎实的技术操作基础，能指导学生完成各项实验操作，确保实验结果的可靠性。实验室配备了激光共聚焦显微镜、蛋白印迹电泳系统、流式细胞仪、水迷宫实验系统等实验仪器，所有设备均处于正常运行状态，能满足本研究各项实验需求。
  团队成员可行性：小组成员包括2025级、2024级临床医学、护理学专业学生，能分工协作完成各项研究任务。团队成员接受过系统的科研技能培训，熟练掌握本研究涉及的各项实验技术，如细胞培养、动物行为学检测、分子生物学检测技术等，在前期预实验中已成功完成部分关键实验，验证了团队的技术能力。
  2.尚缺少的条件及解决方法：
  目前本团队尚不掌握动物模型检测血脑屏障通透性的实验方法，如伊文思蓝染色法，计划通过查阅文献、查看线上演示视频进行学习和预实验。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 10000.00 10000.00
1. 业务费 5000.00 无 0.00 5000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 5000.00 无 0.00 5000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 版面费 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 15000.00 实验动物及试剂 10000.00 5000.00
结束

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