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白纹伊蚊三种品系中铁调节蛋白基因表达量的分析

申报人：李思宇 申报日期：2026-03-13

基本情况

2026创新项目
白纹伊蚊三种品系中铁调节蛋白基因表达量的分析 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生自主选题
二年期
目的：通过分析白纹伊蚊（Aedes albopictus）三种品系中铁调节蛋白（Iron Regulatory Protein, IRP）基因的表达量，探讨其与抗药性之间的关系，进一步了解IRP基因在白纹伊蚊抗药性中的潜在机制，为开发靶向铁稳态通路的新型精准杀虫剂提供关键靶点和理论支持。方法：采用标准诱蚊诱卵器采集法捕捉济宁太白湖地区的白纹伊蚊并进行饲养，通过实时荧光定量PCR技术检测IRP基因在白纹伊蚊三种品系中的表达量，并使用2-ΔΔCt法进行统计学分析。
曾在实验室跟随老师做过一年多的科学实验；参与过小鼠肾缺血再灌注和急性胰腺炎的实验项目并利用此项目参加过第十九届挑战杯；曾参与过互联网＋项目《有膜有样—新型样品前处理技术应用于富集和分离人体尿液中6种磺胺类药物》；曾参与2024年大创项目《共价有机聚合物在新型样品前处理中的应用研究》并立项。
指导教师曾参与山东省高等学校青年骨干教师国内访问学者项目，参与雌激素受体在MCF-7乳腺癌细胞对他莫昔芬耐药中的作用的研究、RNA干扰及基因转染对耐药肝癌细胞株核糖体蛋白表达体系的研究.本项目指导教师研究铁代谢相关蛋白与淡色库蚊抗药性机制形成的关系，课题已经结题，以第一作者发表论著两篇，综述一篇。本项目指导教师参与致倦库蚊抗药性机制研究，以第二作者发表论著一篇。参与融合设计思维，优化《人体结构学》课程体系（教育部产学合作协同育人项目），指导四项大学生创新项目：山东省济宁市太白湖淡色库蚊对化学杀虫剂复配及生物杀虫剂的抗药性研究、AKR1C3抑制剂孕酮联合索拉非尼对肝癌细胞株生长的抑制作用及其机制研究、鱼鳔提取肝素物质对白癜风治疗作用的研究、慢性丙型肝炎铁调素表达下调与BMP/SMAD信号通路相关关系的研究，发表论文4篇。
指导老师可以提供本项目所需实验仪器、实验相关的试剂以及相关的研究技术和数据分析，指导项目负责学生完成课题研究和相关文章的发表。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
李思宇 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 设计并合成IRP基因引物
王常笑 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2024 使用诱蚊诱卵器捕捉蚊虫于实验室饲养繁殖
李钰航 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 设计IRP基因特异性引物并用qPCR进行定量检测
李潇展 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 用SPSS17.0软件进行数据分析
明月涵 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 PCR扩增IRP基因片段并进行测序
李彤 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 提取三种品系中总RNA

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
陆靖 基础医学院 否

立项依据

白纹伊蚊作为登革热、塞卡病毒病、基孔肯雅热等多种蚊媒传染病的主要传播媒介，对全球公共卫生安全构成持续威胁。当前，化学杀虫剂仍是蚊虫防控的核心手段，但长期大规模的杀虫剂使用已导致蚊虫种群抗药性水平普遍提高，传统化学杀虫剂在蚊虫防控中的效力受限，亟需对抗性机制相关的新型分子靶标进行深入研究。已有研究表明，铁稳态失衡是蚊虫抗药性产生的机制之一。铁作为蚊虫生长发育、能量代谢及免疫应答的必需微量元素，其稳态调控紊乱回直接影响解毒酶活性、氧化应激水平及病原体感染能力，进而参与抗药性的形成和发展。IRP作为细胞内铁稳态的核心调控因子，通过靶向结合铁反应元件，精准调控铁摄取、储存及利用相关基因的表达，是连接铁代谢与抗药性通路的关键节点。然而，目的针对IRP基因在白纹伊蚊三种品系中的表达特征及其与抗药性的关联研究尚属空白。基于此，本项目聚焦于铁代谢核心调控因子--IRP，以实验室抗性品系、敏感品系及太白湖现场采集品系为研究对象，通过定量分析IRP基因在三种品系中的表达量差异，系统探究IRP基因与白纹伊蚊抗性机制之间的关系，为开发以IRP基因为靶标的新型蚊虫防控技术、实现精准高效的蚊媒传染病防控提供重要的理论依据与分子基础。
1.实验材料
1.1主要试剂
氯氰菊酯、模板核酸、引物、酶与dNTPs、缓冲液、TRIzol法总RNA提取所需试剂（氯仿、异丙醇、DEPC水、75%乙醇等）、5xTBE缓冲液、三硼酸、LEDTA、动物组织RNA提取试剂盒、
逆转录所需试剂、DNA琼脂糖凝聚电泳所需试剂（琼脂糖粉、TAE溶液、缓冲液等）、PCR产物切胶回收、纯化所需试剂（虾碱性磷酸酶（SAP）、核酸外切酶I（EXO I）、牛肠碱性磷酸酶(CIP)）、荧光定量PCR所需试剂。
1.2供试蚊虫
太白湖现场采集白蚊伊蚊幼虫：在太白湖区用标准诱蚊诱卵器采集法捕捉，操作步骤：将诱蚊诱卵器置于太白湖附近的绿化带、草丛、树荫等蚊虫栖息地，在光线较强的阴凉地面或离地不超过一米高的位置间隔50m至100m放置一个诱蚊诱卵器，连续放置4d,第4d检查、收集诱到的幼虫及蚊卵并于实验室喂养繁殖，饲养温度为25±2℃，相对湿度为（80±5）%，饲养光照时间为12h，产卵传代以鼠血喂养，羽化后根据形态特征鉴定为白蚊伊蚊。白纹伊蚊抗性品系是山东省寄生虫病防治研究所提供。
器具：诱蚊诱捕器（结构参见如图）、白色滤纸、冰包
2.实验内容
2.1引物设计
利用Primer Premier 5设计白纹伊蚊IRP基因引物并合成，IRP引物设计选择的核酸序列为同源性比较高的致倦库蚊的一段保守区域，根据GenBank序列号为AY445078.1的埃及伊蚊的铁调节蛋白核酸序列设计引物，同源性比对选择高度保守区域，同源性比对结果如下：summernote-img
                        图1 埃及伊蚊铁调节蛋白基因同源性比对结果
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                                           表1 铁调节蛋白引物
2.2 序列比对
采用TRIzol 法分别提取三种品系（抗性品系、敏感品系、太白湖现场采集品系）白纹伊蚊成蚊总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）检测RNA的完整性；逆转录合成cDNA，普通PCR扩增IRP片段，通过AGE检测IRP的扩增情况；PCR产物（IRP片段）进行切胶回收、纯化测序、测序结果进行序列比对。
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                                       图2 铁调节蛋白PCR反应
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                                                     表2 电泳体系

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                                                 表3 逆转录反应体系
2.3定量分析
根据测序结果利用白纹伊蚊内参基因β-actin高度保守序列设计IRP基因特异性引物，使用qPCR对目的基因进行定量分析；
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                                                表4 qPCR反应体系

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                                    图3 铁调节蛋白基因荧光定量布板
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                       图4 铁蛋白基因荧光定量反应程序设置
2.4 qPCR数据分析
以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCt法计算IRP基因相对表达量，每个品系设3个生物学重复，结果以“均值±标准差”表示。
用SPSS17.0进行统计分析：两组比较用t检验，三组比较用单因素方差分析；P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2.5相关性分析
将IRP基因表达量与抗性水平（死亡率或LC50）进行Pearson相关性分析，评估两者关联强度。
2.6图表绘制
用GraphPad Prism绘制柱状图（表达量比较）和散点图（相关性分析），标注显著性。
3.前期结果
3.1总RNA提取
白纹伊蚊IV龄幼虫总RNA提取结果
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                                           图5 白纹伊蚊RNA提取结果
3.2铁调节蛋白基因扩增结果
根据GenBank序列号为AY445078.1的埃及伊蚊的铁调节蛋白核酸序列设计引物，同源性比对选择高度保守区域设计引物，上游引物5'-GTTGCTGCCCGAGGTTAT-3'，下游引物5'-CGATTTGTCTGCCGAAGG-3’，产物长度为264bp，电泳经DNAMarker比对后证实扩增产物在250bp处有明显扩增条带，即为铁调节蛋白基因部分片段扩增产物。
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                                   图6 白纹伊蚊铁调节蛋白扩增产物
3.3铁调节蛋白基因264 bp测序结果
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                           图7 白纹伊蚊铁调节蛋白基因部分片段测序峰 
蚊虫属于昆虫纲，种类繁多，疟疾、丝虫病、登革热等虫媒疾病严重危害人类生命健康，其中登革热的主要传播媒介之一白纹伊蚊（Aedes aibopictus)[1]俗称“花蚊子”或“亚洲虎蚊”，是双翅目蚊科伊蚊属的一种昆虫[2]，身体和足部有明显的黑白相间条纹,胸部有一条银白色的纵纹。其主要孳生场所是湖水边、污水沟等积水处[3]，活动高峰期一般在早晨和黄昏[4]，现有相关文献调查表明幼蚊和成蚊密度于6—9月达到峰值[5]。据调查发现白纹伊蚊在济宁地区的活动高峰期主要集中在7—8月，此阶段温度高、降水量多，为白纹伊蚊的繁殖提供了适宜的条件。
目前主要依靠化学手段对蚊虫进行防控，化学防治的核心是杀虫剂，其短期效果明显且能防治各种蚊虫，适用范围广，是防治蚊虫的普遍手段[6]。但是在使用杀虫剂的同时也产生了一系列问题，例如污染环境、危害人类健康和蚊虫抗性水平的提升等[7]，其中抗性问题日益凸显，蚊虫抗药性指蚊虫通过遗传变异或生理适应，对原本致死剂量的杀虫剂产生耐受能力，导致防治效果显著下降的现象，其本质是蚊虫种群在杀虫剂选择压力下的适应性进化。已知的蚊虫抗药性机制包括靶点抗药性、代谢抗药性、表皮抗药性和行为抗药性[8]。靶点抗药性主要是由Vgsc基因突变引起的，其可以编码电压门控钠离子通道，Vgsc基因内的三个单点突变可赋予其产生抗药性[9]；代谢抗药性指蚊虫体内杀虫剂代谢相关的酶活性升高，对杀虫剂的解毒作用增强的现象，参与杀虫剂代谢相关的酶有细胞色素P450氧化酶(cytochromeP450，P450)、羧酸酯酶(carboxylesterase，COE)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathioneS-transferase，GST)[10]；表皮抗药性一般指在受到外部压力或者外部刺激的情况下进化出更厚的表皮或者是改变表皮成分以减弱杀虫剂的渗透强度,如德国小蠊在跗节I、胫节、中胸腹板、背板处表皮的增厚增强了削弱了杀虫剂的渗透强度[11]，目前用于蚊虫控制的杀虫剂主要有四类：有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类，其中拟除虫菊酯类杀虫剂最为常用，长期使用杀虫剂对蚊虫有驱避作用，这种作用会改变蚊虫的行为，即行为抗药性[12]。目前国内外关于蚊虫抗药性机制的研究集中于靶标抗性，例如XixiLi等人[13]研究的MiR-4448通过靶向CYP4H31参与淡色库蚊对拟除虫菊酯的抗药性，miR-4448在溴氰菊酯抗性品系（DR品系）中呈下调表达，而CYP4H31在溴氰菊酯敏感品系中呈下调表达。CYP4H31的表达可被miR-4448识别并结合其3'非翻译区（3'UTR）所抑制。功能验证实验表明，miR-4448的过表达导致CYP4H31表达量降低。向DR品系蚊子体内注射miR-4448 模拟物（mimic）后，蚊虫的死亡率高于对照组。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验显示，CYP4H31在体外水平下降低了细胞对溴氰菊酯的抗性；而在体内干扰 CYP4H31表达后，DR品系蚊子的死亡率显著升高。赵明惠等人[14]对蚊虫抗性相关的钠离子通道和乙酰胆碱酯酶基因进行了研究，研究发现钠离子通道是拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标,此类杀虫剂通过控制钠通道的失活而使昆虫出现兴奋状态或中毒症状，乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。在一些抗性品系蚊虫的乙酰胆碱酯酶分子中发现单氨基酸替换现象,这些突变使乙酰胆碱酯酶对杀虫剂不敏感程度上升,从而产生抗药性。吕海燕等人[15]对AMPKα基因介导白纹伊蚊对四氟甲醚菊酯抗药性进行了研究，研究发现，AalAMPKα基因在抗性白纹伊蚊中高表达，将该基因沉默后，抗性白纹伊蚊的LD50从7.876ng/头下降到2.631ng/头，抗性倍数从22.25下降到7.43，抗药性明显减弱，表明AalAMPKα基因在白纹伊蚊的抗药性中发挥着重要作用。而国内外对行为抗药性的研究较少。
当前成蚊抗药性检测技术存在操作复杂、定量分析不足等局限性，导致我国成蚊抗性评价体系尚不完善。现有研究多聚焦于传统抗性基因的定性分析，亟需对新型分子靶标进行深入研究。近年来，IRP作为新型靶标分子在蚊虫抗药性研究中受到广泛关注。本组同学以IRP作为研究靶点，首次系统比较了白纹伊蚊三种品系中IRP基因表达量的差异，进一步分析IRP和白纹伊蚊抗性的关系，旨在了解白纹伊蚊对杀虫剂耐药情况和潜在机制。通过干扰IRP功能，为开发出针对蚊虫抗药性的新型杀虫剂提供新思路。
参考文献
[1]罗林峰,吴能简,吴崧霖,等.深圳坪山新区白纹伊蚊对常用杀虫剂抗药性研究[J].现代预防医学,2016,43(06):1089-1091.
[2]杨罗菊.中山市白纹伊蚊对拟除虫菊酯类虫剂的抗药性及抗性机制的研究[D].广东药科大学,2021.DOI:10.27690/d.cnki.ggdyk.2021.000030.
[3]马喆,郑宇婷,杨锐,等.云南省普洱市思茅区2020年白纹伊蚊的密度、孳生习性及对杀虫剂抗性状况研究[J].中国媒介生物学及控制杂志,2022,33(03):360-365.
[4]刘永为,李秀忠,陈长华.白纹伊蚊北方分布边界调查及密度监测分析[J].医学动物防制,2009,25(05):324-327.
[5]李宇斯,胡雅劼,李观翠,等.2015—2018年四川省登革热媒介白纹伊蚊生态习性分析[J].中华卫生杀虫药械,2024,30(03):258-261+267.DOI:10.19821/j.1671-2781.2024.03.015.
[6]刘玉娥.蚊虫防治研究进展[J].农技服务,2011,28(07):1008-1009.
[7]邓惠,段金花,李乐扬,等.广东省2023年白纹伊蚊成蚊抗药性研究[J].中国热带医学,2024,24(10):1194-1199.DOI:10.13604/j.cnki.46-1064/r.2024.10.07.
[8]Namias A, Jobe NB, Paaijmans KP, Huijben S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. Elife. 2021 Aug 6;10:e65655. doi: 10.7554/eLife.65655. PMID: 34355693; PMCID: PMC8346280.
[9]Hancock PA, Lynd A, Wiebe A, Devine M, Essandoh J, Wat'senga F, Manzambi EZ, Agossa F, Donnelly MJ, Weetman D, Moyes CL. Modelling spatiotemporal trends in the frequency of genetic mutations conferring insecticide target-site resistance in African mosquito malaria vector species. BMC Biol. 2022 Feb 15;20(1):46. doi: 10.1186/s12915-022-01242-1. PMID: 35164747; PMCID: PMC8845222.
[10]彭荟,刘宏美.细胞色素P450介导蚊虫代谢抗性及防治应用的相关研究进展[J].中国热带医学,2022,22(01):79-83.DOI:10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.01.17.
[11]蔡彤.昆虫表皮蛋白Bgicp37基因的克隆及参与德国小蠊高效氯氰菊酯抗性机制[D].山东师范大学,2021.DOI:10.27280/d.cnki.gsdsu.2021.001910.
[12]周静妮.kdr介导的驱避行为及机制的初步研究[D].南方医科大学2023.DOI：10.27003/d.cnki 10.27003/d.cnki.gojyu.2023.000883.
[13]Li X, Hu S, Yin H, Zhang H, Zhou D, Sun Y, Ma L, Shen B, Zhu C. MiR-4448 is involved in deltamethrin resistance by targeting CYP4H31in Culex pipiens pallens. Parasit Vectors. 2021 Mar 16;14(1):159.doi:10.1186/s13071-021-04665-x. PMID: 33726813; PMCID: PMC7962327.
[14]赵明惠,李春晓,赵彤言.蚊虫两种靶标抗性机制的研究进展[J].寄生虫与医学昆虫学报,2014,21(02):138-146.
[15]南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2025，56（3）：853-861ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp://nfnyxb.xml-journal.netDOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2025.03.016
 
  创新点：本研究聚焦于IRP基因，系统检测其在白纹伊蚊三种不同品系中的表达水平，旨在阐明IRP基因在白纹伊蚊抗药性形成过程中的潜在调控机制，为蚊虫抗药性相关分子机制研究提供新的切入点。
  项目特色：
  （1）本研究采用实时荧光定量PCR技术，精准测定IRP基因在白纹伊蚊三种品系中的表达量，并结合2-ΔΔCt法等统计学方法定量分析，明确铁调节蛋白基因作为蚊虫防治新型分子靶标的可行性。
  （2）通过对比分析白纹伊蚊不同品系中IRP基因的表达差异，深入解析其与抗药性的关联机制，可为研发靶向蚊虫抗药性的新型杀虫剂提供理论依据与新思路，对虫媒传染病的综合防控具有重要理论价值与现实意义。
  （3）研究依托学校毗邻太白湖畔、气候湿润、白纹伊蚊自然孳生丰富的地域优势，实验样本来源充足；项目组在指导教师指导下已系统掌握相关实验技术与研究方法，实验方案科学可行，研究基础扎实。 
  1.项目主体路线图

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  2.拟解决问题
  （1）受季节与气候影响，实验周期可能与白纹伊蚊自然活动高峰期不完全匹配，需在实验正式开展前完成野外诱集与实验室驯化饲养，储备足量标准化实验蚊株。
  （2）严格落实生物安全防护：实验所用白纹伊蚊具备疾病传播风险，整个实验过程须严格遵循生物安全操作规范，全程穿戴隔离防护装备，杜绝蚊虫逃逸与人员暴露。
  （3）针对实验蚊株在人工饲养过程中可能出现的批量死亡、传代困难等问题，通过扩大种群基数、依据白纹伊蚊生物学特性优化饲养方案、分组饲养与定期杂交扩繁等措施，保障实验种群稳定。
  3.预期成果
  （1）三种品系白纹伊蚊IRP的表达量存在差异，且具有统计学意义，表明IRP可能参与白纹伊蚊抗药性机制，推测IRP通过调控铁代谢相关蛋白的表达，影响白纹伊蚊的抗氧化能力或解毒机制，进而产生抗药性。
  （2）预计发表核心文章1-2篇。
2026年6月至2026年8月
1.实地研究蚊子习性并利用诱蚊诱卵器法捕获当地白蚊伊蚊成蚊及其虫卵于实验室内饲养繁殖。
2.饲养一段时间后进行预实验；
2026年9月至2028年6月
1.利用Primer Premier 5设计白纹伊蚊IRP基因引物并合成。
2.采用TRIzol 法分别提取三种品系（抗性品系、敏感品系、太白湖现场采集品系）白纹伊蚊成蚊总RNA，通过AGE检测RNA的完整性
3.普通PCR扩增IRP片段，通过AGE检测IRP的扩增情况。
4.PCR产物（IRP片段）进行切胶回收、纯化测序、测序结果进行序列比对。
5.根据测序结果利用内参基因β-actin设计qPCR引物，作为对照基因进行qPCR定量分析。
6.将qPCR所得数据SPSS17.0软利用件进行分析。
2027年10月至2028年6月
1.整理相关材料和数据。
2.撰写论文并结题。 
本项目指导教师研究铁代谢相关蛋白基因与淡色库蚊抗药性机制形成关系的研究，课题已结题并以第一作者发表论著两篇，综述一篇；本项目指导教师参与致倦库蚊抗药性机制研究，以第二作者发表论著一篇。本项目在此基础上研究白蚊伊蚊三种品系中IRP基因表达量的分析。
 
（1）项目组成员已学习相关《人体寄生虫学》、《生物化学与分子生物学》、《生理学》等相关课程，熟悉实验操作的基本流程和注意事项，为进一步进行实验奠定技术基础。
（2）本实验将依托济宁医学院基础医学院形态学实验室来完成，该实验室具备实验所需的实时荧光定量PCR仪、紫外-可见分光光度计或荧光计、离心机、微量移液器及吸头和PCR管或96孔板等设备。
（3）该实验室指导教师在蚊虫抗药性方面有丰富的研究经验，曾发表过《昆虫miRNA与抗药性关系研究进展》、《淡色库蚊敏感和抗氯氰菊酯品系铁调节蛋白基因表达量的分析》、《铁代谢相关蛋白基因与淡色库蚊抗药性机制形成关系的研究》、《淡色库蚊抗性种群和敏感品系中铁蛋白基因表达量的分析》等多篇文章，并指导学生参加各类竞赛，有丰富的带教经验，足以胜任指导工作。
（4）济宁医学院校图书馆资源丰富，支持访问PubMed、CNKI、万方数据等数据库，满足项目成员对文献检索的需求。
（5）校区临近太白湖，该地气候湿润，易于蚊虫繁殖，有利于实验样本白纹伊蚊的获取。
（6）实验期间白纹伊蚊未必处于活动高峰期，实验样本不一定易得：提前在白纹伊蚊活跃期（6—8月）捕获一定数量的实验样本。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 16000.00 无 8000.00 8000.00
1. 业务费 5000.00 无 2000.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 1000.00 分析所得数据 1000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 1000.00 检索文献 1000.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 用于论文发表的版面费 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 5000.00 实验耗材 3000.00 2000.00
4. 材料费 6000.00 用于各种生物化学试剂的购买 3000.00 3000.00
结束

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