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基于相分离多肽凝聚体的递送KGN衍生物治疗骨关节炎的代谢重编程机制研究

申报人：时瑜婕 申报日期：2026-03-13

基本情况

2026创新项目
基于相分离多肽凝聚体的递送KGN衍生物治疗骨关节炎的代谢重编程机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
骨关节炎（OA）的软骨退变目前尚无有效疗法。小分子化合物KGN可促进软骨修复，但其水溶性和软骨穿透率亟待提高。本研究在前期合成筛选获得高水溶性KGN衍生物K4，构建多肽相分离凝聚体递送体系（K4@凝聚体），显著提升软骨穿透率，降低细胞ROS水平，促进基质合成并抑制分解。蛋白质组学显示，K4@凝聚体下调线粒体电子传递链复合物亚基，抑制氧化磷酸化通路。因此，本项目提出在OA关节腔低氧环境中， K4@凝聚体通过诱导软骨细胞代谢重塑，抑制过度氧化磷酸化以减少mtROS生成，阻抑软骨基质分解代谢；同时优化能量稳态，促进基质合成。本项目拟建立低氧软骨细胞模型，结合软骨外植体及OA动物，通过药理干预，系统评估K4@凝聚体对能量代谢及软骨基质代谢的影响；整合多组学揭示其调控代谢重塑的关键分子靶点。本研究旨在评价K4@凝聚体对OA的疗效并阐明其分子机制，为OA防治提供新递送治疗策略。
项目负责人以第二作者发表英文文章Haoxuan Ji, Naixin Yu, Yujie Shi, Caining Wen, Limei Xu1, Xiao Xu*, Yuanmin Zhang, Yujie Liang. Adipose-derived stem cell exosomes for skin wound healing: Exploring opportunities and challenges. BME Horiz. 2026;4:202533.项目负责人参加第十九届建设银行“挑战杯”获得省赛二等奖 ；参与大学生创新创业训练计划项目《富含PTH mRNA工程化外泌体的水凝胶微球促进关节软骨再生修复的研究》获校级立项；参加第十八届全国大学生节能减排社会实践与科技竞赛获校级三等奖。
项目组成员：
1.李旋科研基础扎实，综合绩点多次排名年级前5%，连续两年获评校一等奖学金及优秀学习标兵称号，另获二等奖学金一次。科研创新能力突出，曾参与主持校级重点大学生创新训练项目1项；积极参加“互联网+”、“挑战杯”等学科竞赛，曾获校级二等奖等荣誉。基于研究成果，参与发表中国科技核心期刊和SCI论文1篇。
2.项目成员张娜参加第十八届全国大学生节能减排社会实践与科技竞赛获校级三等奖；参加大学生创新创业训练计划项目《富含PTH mRNA工程化外泌体的水凝胶微球促进关节软骨再生修复的研究》获校级立项；2025年中国国际大学生创新大赛获校级三等奖
3.项目成员马英硕参加2025年中国国际大学生创新大赛获校级三等奖。项目成员张欣怡参加第十九届挑战杯获院级一等奖，参加第十八届全国大学生节能减排社会实践与科技竞赛获校级三等奖。
指导教师近年来主持承担省级自然科学基金面上项目两项，近年来已获得指导二位本科生获得国家级大学生创新训练计划项目，指导一位本科生获得省级大学生创新训练计划项目，相关成果已指导二位本科生以第一作者发表中科院二区论文二篇。
1.发表论文：第三作者论文
Haoxuan Ji, Naixin Yu, Yujie Shi, Caining Wen, Limei Xu1, Xiao Xu*, Yuanmin Zhang, Yujie Liang. Adipose-derived stem cell exosomes for skin wound healing: Exploring opportunities and challenges. BME Horiz. 2026;4:202533. ttps://doi.org/10.70401/bmeh.2026.0019
2.审稿中论文：：Extracellular Vesicles for Next-Gen Therapeutics and Drug Delivery. 杂志《Molecular Biomedicine》 已修回。（第三作者）
3. 审稿中论文：Herbal-Derived Extracellular Vesicles as Mediators of Indirect Pharmacology: A New Therapeutic Axis from Traditional Medicine.已在中科院一区杂志《Phytomedicine》审稿中，文章编号Ms. Ref. No.: PHYMED-D-26-01989。（第二作者）
指导教师将在项目选题、方案设计、技术路线制定等方面给予全方位指导与把关，确保研究方向的科学性与可行性。同时，指导教师将开放个人科研实验室及相关设备资源，全力支持学生开展实验研究，提供必要的实验耗材与经费补充。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
时瑜婕 康复医学院 康复工程（本科） 2024 承担项目总体实验设计与、实施方案编写、组织科研活动以及撰写报告等核心职责
张欣怡 康复医学院 康复工程（本科） 2024 治疗骨关节炎动物模型研究
张娜 康复医学院 康复工程（本科） 2024 体外软骨细胞炎症模型研究
马英硕 康复医学院 康复工程（本科） 2024 靶向递送验证
李旋 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 多肽相分离多肽凝聚体的构建

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
梁宇杰 康复医学院 否
张元民 康复医学院 否

立项依据

本项目旨在针对骨关节炎（OA）临床治疗中缺乏有效疗法的重大难题，开发一种全新的治疗策略。主要目的包括：
1.构建新型递送体系： 针对KGN水溶性差、递送困难的瓶颈，合成并筛选出具有良好水溶性和软骨保护功能的KGN衍生物K4。在此基础上，构建一种基于液-液相分离原理、组成明确、功能可控的多肽凝聚体递送系统（K4@凝聚体），实现对K4的高效包载与智能释放。
2.通过体外软骨细胞炎症模型、软骨外植体模型以及体内大鼠OA模型，系统评估K4@凝聚体穿透软骨屏障、促进软骨基质合成、抑制分解代谢的能力，并初步验证其生物安全性。
3.深入探究K4@凝聚体治疗OA的分子机制。核心是验证“K4@凝聚体通过诱导软骨细胞发生代谢重塑（抑制过度氧化磷酸化，降低线粒体ROS），从而恢复软骨代谢平衡”这一科学假说，为OA的靶向治疗提供新的理论基础。summernote-img
图1.本项目研究的示意图
本项目的研究内容主要分为以下六个部分：
1.构建与表征K4@凝聚体递送系统：合成系列KGN衍生物，筛选出促软骨合成代谢最佳且水溶性好的K4。设计并合成具有相分离能力的多肽（如WWKssKWW），通过分子动力学模拟优化其负载K4的能力。对形成的K4@凝聚体进行粒径、形态、载药量、体外释放动力学及生物相容性（细胞毒性、免疫原性）的系统表征。
2.在IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型中，比较K4单体与K4@凝聚体对软骨细胞表型（COL2， Aggrecan， SOX-9）、分解代谢酶（MMP-13）及细胞内活性氧（ROS）水平的影响，验证凝聚体递送的增效作用，体外评价K4@凝聚体对软骨细胞功能的影响。
3.利用离体软骨外植体模型，通过荧光示踪技术比较K4单体与K4@凝聚体穿透致密软骨基质的能力。同时，在巨噬细胞炎症模型中，评价K4@凝聚体对巨噬细胞表型极化的影响，探讨其潜在的免疫调控作用。
4.建立大鼠内侧半月板失稳（DMM）的OA模型，通过关节腔注射给予K4@凝聚体。利用活体成像示踪其在关节腔内的滞留时间，结合步态分析、MRI影像学、组织学染色（番红固绿、HE）及OARSI评分，系统评估其对软骨退变的治疗效果。同时，通过对主要脏器的组织学观察，评价其体内安全性。
5.采用Seahorse实时代谢分析技术，检测K4@凝聚体处理后软骨细胞的耗氧率（OCR）和胞外酸化率（ECAR），明确解析K4@凝聚体调控软骨细胞能量代谢的分子机制，阐明其对氧化磷酸化与糖酵解代谢转换的调控作用。通过检测ATP水平、线粒体膜电位，并结合前期蛋白质谱结果（发现NDUFA9、NDUFS1、COX5A等复合物亚基下调），定位关键的代谢调控节点。
6.运用遗传学（敲低/过表达关键蛋白Cox5a/Ndufa9/Ndufs1）和药理学（使用氧化磷酸化特异性抑制剂）手段，干预线粒体呼吸链功能，观察是否能模拟或阻断K4@凝聚体引起的软骨细胞表型变化。整合转录组学与代谢组学数据，构建“K4@凝聚体-关键靶点-代谢重塑-软骨功能”的调控网络。
OA的核心病理是关节软骨的不可逆磨损。现有疗法（消炎镇痛、物理治疗）仅能缓解症状，无法实现软骨再生。终末期的关节置换术存在假体寿命和感染风险。再生医学技术（如细胞移植）在修复组织的功能与长期稳定性上仍不及天然软骨。如何突破软骨自我修复的生物学限制，是实现OA治疗突破的关键。
 KGN能诱导干细胞成软骨分化，是潜在的OA治疗小分子，但其水溶性差、关节腔滞留时间短，严重限制了其疗效。现有递送策略（如外泌体）虽能提高生物利用度，但面临载药量低、助溶剂毒性、规模化生产质控难等问题。因此，从源头设计具有适度水溶性的KGN衍生物，并构建安全、高效的递送载体，是重要的研究方向。
基于液-液相分离原理形成的多肽凝聚体，作为一种新型生物材料，具备动态响应性（智能释放）、功能可编程性（力学适配组织）、高效递送（突破细胞膜）以及组成明确、批次一致等优势，在理论上可克服现有载体（脂质体、外泌体）的诸多局限。其动态特性尤其适配关节软骨这类复杂组织的修复需求。
 相分离多肽凝聚体在OA治疗中的应用尚未见报道。本项目组前期研究发现，K4@凝聚体可显著下调软骨细胞线粒体呼吸链复合物亚基（NDUFA9, NDUFS1, COX5A）的表达，提示其可能通过调控能量代谢发挥作用。然而，K4@凝聚体是否通过诱导代谢重塑来治疗OA，以及其相分离特性在此过程中的协同作用，是亟待深入研究的科学问题。
本项目具有以下四个方面的创新与特色：
1.跳出传统递送载体的思维定势，率先将基于液-液相分离原理的多肽凝聚体应用于小分子药物（K4）的递送。该体系具有组成明确、功能可控、生物相容性高、工艺稳定的独特优势，为突破现有递送技术的瓶颈提供了变革性思路。
2.深度融合了相分离多肽凝聚体的“治疗-载体”一体化平台优势与K4的生物学功能优势，创建了“K4@凝聚体”这一新疗法。该疗法协同实现了更高效的软骨穿透、智能化的药物释放和更优的软骨保护效果，具有较高的临床应用前景。
3.首次提出并验证“K4@凝聚体通过诱导软骨细胞代谢重塑（抑制过度氧化磷酸化，降低线粒体ROS）来治疗OA”的新假说。这一研究将药物递送、能量代谢与软骨再生有机联系起来，为理解OA的发病机制和治疗策略提供了全新的理论框架。
技术路线：
1.体系构建：化学合成K4 + 设计合成相分离多肽（如WWKssKWW） 、 构建K4@凝聚体 、表征其理化性质、载药释药特性及生物相容性。
2.体外评价：利用IL-1β诱导的软骨细胞模型，评估K4@凝聚体对细胞表型、分解代谢、氧化应激的影响；利用软骨外植体模型评估其穿透能力；利用巨噬细胞模型评估其免疫调控功能。
3.体内验证：建立大鼠DMM模型，关节腔注射K4@凝聚体、 通过活体成像、影像学（MRI）、组织病理学、步态分析等手段综合评价其疗效与安全性。
4.机制解析：采用Seahorse、代谢流、线粒体功能检测等方法验证“代谢重塑”假说 、通过遗传/药理学干预，验证关键靶点（NDUFA9, NDUFS1, COX5A）的功能 、整合转录组、代谢组数据，构建调控网络。summernote-img
拟解决的关键科学问题：
1.KGN物理化学性质的局限问题： 通过化学修饰获得水溶性好且活性高的K4。
2.现有关节腔给药系统
送效率低、安全性不足的问题： 通过构建人源化短肽相分离凝聚体，实现高效、安全的递送。
3.OA保守治疗的瓶颈问题： 通过K4@凝聚体疗法，实现从症状缓解向软骨再生的转变。
4.K4@凝聚体治疗OA分子机制不明的问题： 通过系统研究，阐明其通过调控能量代谢（代谢重塑）发挥治疗作用的分子机制。
预期成果：
1.建立一套基于相分离多肽凝聚体递送K4治疗OA的新体系；首次阐明K4@凝聚体通过诱导软骨细胞代谢重塑治疗OA的分子机制。
2.提供一种安全、高效的OA软骨病损治疗新策略；申请国家发明专利1项。
3.学术成果： 发表高水平学术论文1篇，参加国内外学术会议2次。
第一年（2027年1月 - 2027年12月）：
深入研究K4@凝聚体在软骨细胞内的药物释放效率。
评估K4@凝聚体对软骨细胞代谢和巨噬细胞极化的影响。
整理数据，申请国家发明专利1项。
利用OA软骨外植体模型，示踪荧光标记的K4@凝聚体在软骨组织内的分布。
第二年（2028年1月 - 2028年12月）：
建立DMM诱导的OA大鼠模型，利用活体成像示踪K4@凝聚体在关节腔内的分布与滞留情况。
整理实验数据，撰写并投稿学术论文1-2篇。
深入评价K4@凝聚体对大鼠OA模型的治疗效果。
完成对主要脏器的组织学分析，全面评估K4@凝聚体的体内生物安全性。
整理实验数据，撰写并投稿学术论文1-2篇。
深入解析分子机制：完成线粒体功能验证（代谢表型、膜电位、能量代谢转换）、遗传/药理学干预实验。整理所有实验数据，撰写并投稿学术论文1-2篇，完成项目总结。
项目组已为本研究打下了扎实的前期工作基础：
1.成功构建了相分离多肽凝聚体递送平台： 筛选获得具有相分离能力的多肽WWKssKWW，证实其能形成动态可逆的液滴，可高效包裹小分子，并在还原条件下解离释放药物，具备作为递送载体的核心特性。
2.成功筛选并获得核心效应分子K4： 合成并鉴定了一系列KGN衍生物，从中筛选出K4。与KGN相比，K4水溶性显著提高，且在维持软骨细胞表型（促进COL2表达）方面效果更优。
3.初步验证了K4@凝聚体的疗效与安全性： 体外实验证明，K4@凝聚体能高效穿透细胞膜进入软骨细胞，并能穿透软骨外植体屏障；可显著促进软骨基质合成（COL2， Aggrecan），抑制分解代谢（MMP-13）和氧化应激（ROS）。初步的体内外安全性评价显示其具有良好的生物相容性。
4.获得了关键的机制线索： 蛋白质谱分析发现，K4@凝聚体处理显著下调了软骨细胞线粒体呼吸链复合物的多个亚基（NDUFA9， NDUFS1， COX5A），并抑制了“氧化磷酸化”通路，为本项目提出的“代谢重塑”假说提供了直接的科学依据和潜在的研究靶点。
5.深厚的外泌体递送与OA研究积累： 申请人团队长期从事细胞外囊泡治疗OA的研究，在靶向递送KGN、miRNA及基因编辑工具方面取得了系列高水平成果（发表于Biomaterials, Theranostics等期刊，多篇入选ESI高被引），对OA的病理机制和药物递送挑战有深刻理解，为本项目的顺利开展提供了坚实的理论、技术和人才储备。
6.具备完善的研究条件与可行性：项目依托单位拥有先进的科研平台和实验设备，研究团队人员结构合理、技术娴熟，确保了项目实施的可行性。
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
1.1 与本项目直接相关的工作基础：相分离多肽凝聚体递送KGN衍生物的前期工作
1. 1.1相分离多肽凝聚体的制备，为本项目研究提供递送载体
前期发现含有独特间隔和贴标序列的分子，包括多肽，可以形成相分离凝聚体，用于药物的包裹和胞内递送。因此选择了各种肽间隔（KssK和RssR）和贴标（FF，FW，WF，WW）氨基酸序列进行化学合成。在不同缓冲液条件下（PBS和DMEM），在生理温度（37⁰C）下，我们从一个多肽库中筛选到WWKssKWW多肽能够形成类似液滴的凝聚体。通过光学显微镜观察到液滴的形成。而其他类似的氨基酸序列形成了固相聚集体或非均匀液滴。WWKssKWW液滴在75秒的时间跨度内表现出动态融合特性，说明其在常温下的相分离行为。WWKssKWW液滴还可以通过液-液相分离封装荧光标记的药物，比如核酸分子。此外，在不同的还原条件处理下（还原性的谷胱甘肽1、5和10 mM）下对WWKssKWW凝聚体液滴发生分散，说明二硫键的还原可以导致相分离液滴的解离。因此，在细胞内液滴可以离散而释放出包裹的药物 (图2)。summernote-img
图2. 相分离多肽的筛选
（A）相分离多肽的图示。(B) 相分离多肽WWKssKWW在PBS中形成液滴。(C) 时间分辨显微镜显示多肽凝聚体液滴在DMEM缓冲液中的融合。(D) 多肽凝聚体液滴对荧光标记的小分子的富集，以及荧光漂白后修复。 (E) 多肽凝聚体液滴的尺径测量。（F）在还原条件下，多肽二硫键的断裂的化学反应。（G）还原条件下多肽二硫键断裂的HPLC追踪。
1.1.2 KGN衍生物的合成、鉴定及筛选：为本项目研究提供效应分子
(1) KGN衍生物（K1至K9）的合成: 均基于芳酐与氨基联苯类化合物在乙酸溶剂中的缩合反应，通过调整反应底物（如不同取代的邻苯二甲酸酐或萘酐以及不同取代的联苯胺）来获得结构多样的目标产物；反应条件根据底物活性有所差异，如K1的合成需加热至60℃促进溶解与反应，而其余衍生物在室温下进行。反应结束后，通过过滤收集析出的固体粗产物，并依次用乙酸和水洗涤以去除杂质，最后冻干获得纯品。
(2) KGN衍生物的结构鉴定：化合物的结构通过核磁共振氢谱（1H NMR）和高分辨质谱（HRMS）进行确证，特征性的化学位移和精确的分子离子峰与理论计算值高度吻合，验证目标分子的成功合成。summernote-img
图3. KGN衍生物的合成和鉴定
A. KGN衍生物（K1-K9）的结构示意图; B．KGN衍生物（K1-K9）的质谱鉴定结果。
（3）KGN衍生物（K4）可较好维持软骨细胞表型
利用KGN衍生物与经IL-1β刺激的软骨细胞共培养24小时后，收集细胞RNA，通过实时定量PCR检测II型胶原mRNA的表达水平。结果发现K4刺激后II型胶原mRNA显著性升高（图4 ）。因此选择K4进行后续实验。summernote-img
图 4. 实时定量PCR检测KGN衍生物刺激软骨细胞24小时 II型胶原mRNA表达水平
1.1.3相分离多肽凝聚体可有效递送K4进入软骨细胞，促进软骨基质合成代谢，抑制软骨基质分解代谢，该工作为本项目进一步研究K4@凝聚体治疗OA提供了关键的实验依据
WWKssKWW多肽凝聚体递送负载荧光标记的药物分子与软骨细胞共孵育后，利用流式细胞仪和confocal检测K4@凝聚体进入软骨细胞的情况,显示多肽凝聚体具有很高的穿膜效率（图5A，5B），提示相分离多肽 WWK 载体系统可有效递送 KGN 和 K4进入软骨细胞。WWKssKWW多肽凝聚体递送负载荧光标记的药物分子与软骨外植体共孵育后，冰冻切片结果显示多肽凝聚体有很好的穿透软骨屏障能力（图5C）。
K4、KGN、多肽相分离凝聚体、以及多肽相分离凝聚体分别递送KGN和K4刺激软骨细胞48小时后，收集细胞蛋白，通过Western blot检测蛋白的表达水平。结果发现，与相分离多肽凝聚体递送KGN相比，相分离多肽凝聚体递送K4 刺激后，II型胶原、SOX-9和Aggrecan蛋白水平均显著升高，抑制MMP-13表达，降低ROS表达水平（图6 ），提示相分离多肽凝聚体递送KGN衍生物（K4）可有效维持软骨细胞表型。summernote-img
图5.相分离多肽凝聚体递送K4穿透屏障进入细胞情况
A．流式细胞和Confocal检测WWKssKWW多肽凝聚体递送荧光标记的药物分子进入软骨细胞情况；B. Confocal检测WWKssKWW多肽凝聚体递送荧光标记的药物分子进入软骨细胞情况；C. 利用软骨外植体检测多肽凝聚体递送药物穿透软骨屏障的情况。summernote-img
图6.相分离多肽凝聚体递送K4对软骨细胞表型和ROS的影响
A．Western blot检测软骨细胞表型相关蛋白的表达水平；B. Image J 分析WB条带灰度值;
C. 活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测ROS的水平。
1.1.4 体内外实验结果提示：相分离多肽凝聚体递送K4具有良好的生物相容性，该结果初步验证了其应用于OA治疗的安全性潜力
为了评价关节腔注射相分离多肽凝聚体递送K4治疗OA的生物安全性，分别通过CCK-8、活/死细胞染色和动物实验进行初步验证。CCK-8检测结果（图6A）显示，KGN与K4在24、48及72小时均能将细胞活力维持在85%以上，表明其无显著细胞毒性，证实了它们在细胞应用中的安全性。活/死细胞染色结果（图7B）与此一致，即使在较高浓度肽处理下，仍以绿色染色的活细胞为主，仅观察到极少量红色染色的死细胞。经关节腔注射相分离多肽 WWK 载体系统递送的 KGN 和 K4 八周后，对心、肝、脾、肺、肾组织进行 HE 染色检测。结果（图7C）显示，实验组与对照组之间无显著统计学差异，表明相分离多肽载体系统具有良好的生物安全性。summernote-img
图7.相分离多肽凝聚体递送K4治疗OA的生物安全性初步评价
A．CCK8检测结果；B.活/死细胞染色结果；C.动物实验组织切片HE染色。
1.1.5 蛋白质谱结果分析提示：K4@凝聚体显著降低体液免疫反应，抑制软骨细胞线粒体的氧化磷酸化，为本项目深入解析K4@凝聚体治疗OA的分子机制提供了研究靶点
如图8A所示，火山图结果显示Ｋ４与处理组（K4@凝聚体）的蛋白质表达谱存在显著差异。与对照组相比，处理组共有65个蛋白质发生显著变化，其中10个显著上调（图中右侧红色点群），55个显著下调（图中左侧绿色点群）。
气泡图（图8B）显示，显著富集的GO-BP术语主要集中在两大聚类：免疫球蛋白介导的免疫反应（Immunoglobulin-mediated immune response）和B淋巴细胞介导的免疫应答B cell mediated immunity。这提示多肽相分离凝聚体递送K４可显著降低体液免疫反应。
GSEA分析结果如图8C所示。我们以归一化富集分数（NES）作为主要参考，并采用 NOM p-val < 0.01 作为显著富集的阈值。结果显示，与对照组相比，处理组中显著变化的3个基因集主要包括‘氧化磷酸化’通路。图8D进一步对氧化磷酸化’通路进行分析。其富集图显示，折线图在基因排序列表的左侧急剧下降，并在列表前部达到一个负向的峰值，表明该通路下的蛋白整体表达趋势是在对照组中高表达，即该通路在处理组中被显著抑制。图中部的‘条形码’区域显示了‘氧化磷酸化’通路各成员在排序列表中的分布。可以直观地看到，这些成员主要集中在列表的右侧（与实验组负相关区域），这与负向的富集分数相符。图下部展示了所有蛋白基于其表达变化的排序值分布，整体形态反映了实验组与对照组之间的表达差异谱。
通过Leading Edge分析，我们进一步提取了对‘氧化磷酸化’通路富集信号贡献最大的核心基因。这些基因（Cox5a;Ndufa9;Ndufs1）在排序列表中紧密聚集于富集峰值的周围，它们是该通路在处理组中的关键执行者，可作为后续验证的候选分子。summernote-img
图8. 蛋白质谱结果分析
A.火山图中横坐标表示差异倍数（以2为底的对数变换），纵坐标表示显著性水平（以10为底的负对数变换）。每一个点代表一个检测到的蛋白。设定筛选标准为 |Log2FC| ≥ 1 且 P-value < 0.05，图中两条垂直虚线（通常位于x = -1 和 x = 1 处）以及一条水平虚线（位于y = -log10(0.05) 处）圈定了显著差异表达分子的范围. B. GO-BP富集分析展示了显著性排名前8的生物学过程术语。纵坐标代表具体的生物学过程，横坐标代表富集基因比例，圆圈的颜色代表显著性水平（P值），圆圈大小代表富集到的基因数目。C. 基因集富集分析（GSEA）基于所有蛋白根据其差异表达倍数（Log2FC）排序的列表，评估预先定义的基因集（如KEGG通路、GO术语）是否在该排序列表的顶端（实验组中高表达）或底端（对照组中高表达）显著富集。D. 以‘氧化磷酸化’通路为例进行分析。
针对KGN水溶性差的技术瓶颈，本团队前期自主设计合成了一系列新型KGN衍生物。通过系统的体外软骨细胞表型维持能力筛选（检测了关键基因Col2表达），成功获得候选分子K4，其促软骨基质合成代谢的活性较KGN显著提升且具有良好的水溶性，为本项目提供了理想的核心效应分子。
在前期研究中，团队基于液-液相分离理论，成功设计并构建了新型的无膜囊泡的相分离多肽凝聚体，用于小分子的高效递送。该凝聚体提高了K4的高效包载（K4@凝聚体），显著提高了K4的生物利用度，更为其高效穿透细胞膜进入软骨细胞提供了关键保障，解决了效应分子胞内递送的瓶颈问题。
为评估临床转化潜力，我们通过体内外实验初步建立了K4@凝聚体的生物安全性评价体系。更重要的是，利用软骨外植体模型，我们已初步验证了K4@凝聚体穿透致密软骨基质屏障的能力。这一发现为本项目后续在完整关节微环境中修复病损软骨的研究，提供了关键的可行性支撑。
本课题的依托单位是济宁医学院，其拥有高水平科研平台，质谱仪、激光共聚焦显微镜（双光子系统、μCT、小动物超声、活细胞工作站、流式分选系统、流式细胞仪、小动物活体成像系统、LC-MS/MS、GC-MS、激光显微切割机、CD 光谱仪、等温滴定量热仪、高压细胞破碎仪、快速蛋白纯化系统、双向电泳系统、全自动电泳系统、梯度基因扩增仪、紫外可见分光光度计、红外光谱分析仪、酶标仪、人类染色体遗传分析系统、真核细胞培养优化系统、落地式高速冷冻离心机、生物信号采集处理系统、全自动生化分析仪、台式动物手术显微镜、血气分析仪、膜片钳放大器系统、组织包埋机、全密封式组织脱水机、组织切片机、冰冻切片机、全自动时间分辨荧光分析仪、SPF动物房等，能满足本项目所需的工作条件。
公共科研面积8000平方米，专用实验设备3000多万元，包括细胞培养层流室（1000级），免疫学实验室，分子生物学实验室和药理学实验室。可供使用的设备包括超高速冷冻离心机，Nanosight检测仪、流式细胞分选仪、激光共聚焦显微镜、活细胞工作站、超速离心机、荧光定量PCR仪、冰冻切片机、凝胶成像分析系统、病理图像分析系统、化学发光和荧光扫描仪、化学发光和荧光检测仪等大型设备，以及各种PCR仪、显微镜、电泳装置、冰箱、细胞培养和细菌培养等常用的细胞与分子生物学设备,可满足项目所需的研究工作条件。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 17000.00 无 7000.00 10000.00
1. 业务费 12000.00 无 2000.00 10000.00
（1）计算、分析、测试费 1000.00 无 1000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 1000.00 无 1000.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 10000.00 无 0.00 10000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 5000.00 无 5000.00 0.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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