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GSK-3β/Cu²⁺双靶向吡咯并吡啶化合物抑制胰腺癌的分子机制研究

申报人：李泽琪 申报日期：2026-03-13

基本情况

2026创新项目
GSK-3β/Cu²⁺双靶向吡咯并吡啶化合物抑制胰腺癌的分子机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
胰腺癌被称为“癌中之王”，五年生存率仅约8.5%，因早期诊断困难、进展迅速且极易耐药，单靶点药物难以应对其高度异质性。本项目聚焦两大关键致病机制：GSK-3β异常激活与铜离子代谢紊乱。前期基于TCGA数据库发现GSK-3β在胰腺癌中高表达，与不良预后显著相关；利用计算机辅助药物设计，优选出双靶向候选分子C83。预实验表明，C83可强效抑制GSK-3β活性（IC50 < 50 nM），并特异性螯合胞内游离Cu²⁺，显著降低铜的生物可利用水平。在MIA PaCa-2和AsPC-1细胞中，C83显著抑制增殖、克隆形成与迁移，诱导凋亡，其抗增殖效果优于单靶点抑制剂，且对正常细胞与小鼠主要脏器无明显毒性。由此提出GSK-3β/Cu²⁺双靶向协同抑癌假说。本研究拟综合CCK-8、流式细胞术、Trawell、Western blot、转录组测序、小鼠皮下瘤模型及胰腺癌类器官模型，阐明C83的分子机制，重点解析其对GSK-3β介导的NF-κB通路及Cu²⁺相关的TopBP1-ATR-Chk1 DNA损伤修复轴的调控。本项目将为胰腺癌提供“一药双靶”新策略，突破耐药瓶颈，奠定候选新药研发理论基础。
  参与省级课题LOXL2/HOXD9复合体转录激活CTTN促进肝细胞癌出芽及恶性演进的机制研究一项。
  指导老师现作为负责人主持山东省自然科学基金青年项目1项，山东省医药卫生科技发展计划项目1项，济宁医学院贺林院士新医学临床转化重点项目1项。
1. 对本项目提供设备、动物及部分经费等资源支持，并指导科学规划与规范使用；
2. 对本项目相关知识进行提前教学，围绕实验技术、数据处理和学术论文撰写开展专题培训，并并全过程中给予系统性指导与建议；
3. 制定开题、中期、结题分阶段目标与研究计划，明确任务与考核标准，并做好组织协调，确保项目有序推进；
4. 及时处理项目中出现的问题与难题，推荐参与学术会议、指导论文投稿与专利申请、组织创新创业赛事，促进成果转化；
5. 每周六下午固定召开课题组例会，围绕课题方案设计、实验操作规范、数据处理与分析等开展系统性指导。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
李泽琪 公共卫生学院 卫生检验与检疫（本科） 2025 项目统筹、细胞学实验
杜林林 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 分子功能学实验与数据分析
王谦辰 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 细胞学实验与数据分析
刘致垣 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 分子功能学实验与临床数据收集
李明娟 公共卫生学院 预防医学（本科） 2025 文献搜集与动物学实验
邢增镐 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 分子功能学实验与临床数据收集

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
寻情情 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

1. 研究目的
1.1 筛选新型吡咯并吡啶化合物C83，确证其对GSK-3β激酶及细胞内游离Cu²⁺的双重靶向干预能力，并系统评价其对胰腺癌细胞增殖、凋亡、周期阻滞、迁移侵袭的抑制作用。
1.2 基于细胞-动物-类器官三级模型，阐明C83通过抑制GSK-3β介导的NF-κB炎症通路及干扰Cu²⁺代谢相关的TopBP1-ATR-Chk1 DNA损伤修复轴、诱导铜死亡的分子机制，为开发“一药双靶”抗胰腺癌候选新药提供实验依据。
2. 研究内容
2.1 CCK-8活性筛选候选药物与确定胰腺癌细胞系
（1）药物与细胞准备：选取课题组已合成的三种代表性化合物（选择性GSK-3β抑制剂C22、C42及双靶向抑制剂C83）进行对比研究。选取四种胰腺癌细胞系：MIA PaCa-2（原发性高侵袭）、AsPC-1（转移性）、BxPC-3（中分化）和PANC-1（Wnt通路激活）进行预实验。
（2）CCK-8法活性初筛：采用CCK-8法测定不同浓度化合物对上述四种细胞增殖的抑制作用。通过梯度稀释药物，培养 48-72 小时后检测吸光度（OD值），绘制生长曲线并计算半数抑制浓度（IC50）。
（3）细胞系确立：根据筛选结果，确定对药物最敏感的细胞系。预期结果：数据证实双靶向抑制剂C83在纳摩尔级别对GSK-3β具有强抑制力，且在微摩尔级别对MIA PaCa-2（IC50 ≈ 2.50 μM）和AsPC-1细胞表现出显著优于单靶点药物的抗增殖活性，确立MIA PaCa-2为原位癌核心模型，AsPC-1为转移耐药模型。
2.2 C83的细胞功能验证
（1）细胞增殖与克隆形成能力检测
a. 长期增殖抑制（CCK-8法）：采用CCK-8法进一步验证C83对胰腺癌细胞的生长抑制动力学。通过设置C83的梯度浓度处理细胞24 h、48  h、72  h，绘制生长曲线，精确计算半数抑制浓度（IC50），量化C83的体外抗肿瘤活性。
b. 克隆形成实验（Colony Formation）：评估C83对胰腺癌细胞群体依赖性和长期增殖潜能的影响。将低密度细胞接种于6孔板，给予不同浓度C83处理 10-14 天，待克隆形成后进行结晶紫染色计数。
（2）细胞凋亡与周期阻滞的流式分析
利用流式细胞术（Flow Cytometry）从细胞表型层面解析C83诱导细胞死亡的机制：
a. 细胞凋亡分析：采用Annexin V-FITC/PI双染法，定量检测C83处理后早期与晚期凋亡细胞的比例。结合Western Blot（WB）检测凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3）的表达变化，明确C83是否通过线粒体途径诱导细胞凋亡。
b. 细胞周期分布分析：采用PI染色法，检测C83对细胞周期进程的阻滞作用（如G0/G1期或G2/M期阻滞）。同步通过WB检测周期调控蛋白（Cyclin- D1、CDK4/6）的表达下调情况，从分子层面解释周期阻滞的原因。
（3）细胞迁移、侵袭与EMT机制研究
a. 划痕愈合与Transwell实验：通过划痕实验观察C83对细胞水平迁移能力的抑制作用；通过Matrigel基质胶Transwell实验评估C83对细胞垂直侵袭能力的抑制效果。
b. EMT标志物检测：利用WB技术检测上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达变化。重点观察上皮标志物（E-cadherin）的上调及间质标志物（N-cadherin、Vimentin）的下调，明确C83通过抑制EMT过程阻断胰腺癌转移的分子机制。
2.3 C83对双靶向GSK-3β/Cu²⁺的机制研究
为探究双靶向GSK-3β/Cu²⁺抑制剂，抑制胰腺癌的具体分子机制，我们进行Wnt/β-catenin、NF-kB、DNA损伤修复通路（TopBP1-ATR-Chk1）、铜死亡通路、MAPK通路这些通路的蛋白检测。
（1） C83调控GSK-3β依赖的信号通路网络
a. C83调控GSK-3β活性拮抗Wnt/β-catenin信号轴。采用Western Blot及免疫荧光检测C83处理后GSK-3β双重磷酸化水平（p-GSK-3β Tyr216与Ser9）、β-catenin Ser33/37/Thr41磷酸化水平、胞质总β-catenin及非磷酸化活性β-catenin表达变化，并检测下游靶基因c-Myc和Cyclin D1的表达水平。
b. C83靶向GSK-3β/IκBα轴抑制NF-κB通路活化。采用Western Blot检测C83处理后IκBα Ser32磷酸化水平、总IκBα蛋白表达、p65 Ser536磷酸化水平及总p65蛋白表达变化，明确C83对GSK-3β/IκBα/NF-κB轴的调控作用。
c. C83废除TopBP1-ATR-Chk1修复级联诱导DNA损伤积累。采用Western Blot检测C83处理后TopBP1表达、ATR Ser428磷酸化、Chk1 Ser345磷酸化及γH2AX Ser139表达水平，评估C83对DNA损伤修复通路的影响。
（2） C83 介导的铜离子双功能调控：诱导铜死亡与阻断增殖信号
a. C83对铜死亡通路的调控。采用Western Blot检测C83处理后铜死亡关键调控蛋白FDX1、DLAT寡聚化水平及LIAS的表达变化。
b. C83靶向MEK-ERK信号轴抑制MAPK通路。采用Western Blot检测C83处理后MEK1/2 Ser217/221磷酸化水平、ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平及总MEK1/2蛋白表达。
（3）C83对细胞内铜离子稳态的干扰机制
a.  细胞内游离铜离子检测，利用特异性铜离子荧光探针（如Coppersensor-3），通过荧光显微镜或流式细胞术检测C83处理后细胞内游离Cu²⁺浓度的变化，验证C83的铜离子螯合能力。
b.  铜代谢相关蛋白表达检测，采用Western Blot检测铜离子转运蛋白CTR1及外排蛋白ATP7A/ATP7B的表达变化。
2.4 动物体内抑瘤实验及铜离子免疫组化验证
（1）建立胰腺癌小鼠皮下移植瘤模型，将双靶向GSK-3β/Cu²⁺的吡咯并吡啶化合物药物通过腹腔注射，设置对照组与实验组，定期测量肿瘤体积和重量变化，观察化合物的抑瘤效果，验证C83在体内的抗肿瘤效果及对肿瘤微环境中铜离子分布的影响。
（2）荷瘤模型建立与给药：将MIA PaCa-2细胞接种于BALB/c裸鼠皮下，建立胰腺癌移植瘤模型。待肿瘤长至约100 mm³时，将小鼠随机分为对照组、阳性药组（如吉西他滨）及C83不同剂量组，通过腹腔注射给药。
（3）肿瘤生长监测：定期使用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积（V = 0.5 × a × b²），绘制生长曲线。记录小鼠体重变化以评估药物毒性。
（4）免疫组化与铜离子检测：处死小鼠取瘤体组织，进行免疫组化染色。重点检测：
a. GSK-3β及其磷酸化位点（p-Y216、p-S9）的表达。
b. 利用特异性铜离子探针或抗体，观察肿瘤组织中铜离子的蓄积情况及分布变化，验证药物在体内对“GSK-3β/Cu²⁺轴”的双重调控作用。
2.5 人源胰腺癌类器官（PDO）模型构建与药效评估
（1）类器官培养：获取胰腺癌患者肿瘤组织样本，利用基质胶包埋法进行三维培养，建立稳定的胰腺癌类器官模型（PDO）。
（2）药敏试验：将C83作用于类器官模型，通过显微镜观察类器官形态变化（如出芽减少、坏死），并利用CC8K-法检测类器官的存活率。
（3）用药评估：在类器官模型上测试C83与临床一线药物（如吉西他滨）的联合用药效果，计算联合用药指数（CI），为临床克服化疗耐药提供实验依据。胰腺癌作为恶性程度最大的肿瘤之一，传统治疗方法（如手术切除、化疗、传统药物等）效果甚微，且有副作用大、复发率高、耐药性强等问题，亟需新型治疗靶点和策略。
3. 国内、外研究现状和发展动态
3.1 胰腺癌的临床治疗现状与关键挑战
  近年来，全球范围内胰腺癌的发病趋势呈现出持续上升的特点。在欧美等发达国家，胰腺癌的发病率在各类恶性肿瘤中位列第十位左右，而其致死率则高居第四至五位[1]。随着我国人口老龄化进程不断加快以及居民生活方式的转变，国内胰腺癌的发病率同样呈现逐年增高的趋势。该病的高发人群主要为40岁以上的中老年人，男性发病风险略高于女性，且城市地区的发病率显著高于农村地区。目前放射治疗临床上针对胰腺癌的治疗方式主要包括手术治疗、化学治疗、靶向治疗以及免疫治疗等多种手段[2]。手术切除仍是当前唯一有可能实现根治胰腺癌的治疗方案，但仅有10%至20%的患者在确诊时符合根治性手术的指征。化疗方面，吉西他滨与氟尿嘧啶是临床一线常用药物，然而此类治疗方案为患者带来的生存获益较为有限，接受治疗后患者的中位生存期仅为6至12个月。放疗可作为手术的辅助治疗方式，或是用于缓解局部晚期胰腺癌的相关临床症状，但其应用效果往往受到肿瘤位置、体积大小以及周围正常组织耐受情况等多种因素的限制。由于胰腺癌具有高度的肿瘤异质性，且肿瘤微环境结构复杂，当前靶向治疗与免疫治疗在胰腺癌的临床应用中整体疗效并不理想。一方面，肿瘤的异质性导致靶向药物难以实现精准有效的作用；另一方面，肿瘤细胞的免疫逃逸及免疫抑制微环境，也极大限制了免疫治疗的效果[3]。在此背景下，能够同时作用于多条致癌信号通路、有效降低耐药风险的多靶点药物，逐渐成为胰腺癌相关研究的重点方向。相关研究表明，GSK-3β与铜离子（Cu²⁺）均在胰腺癌的发生及进展过程中发挥着关键的调控作用[4][5]，但目前仍缺乏可同时靶向这两个靶点的治疗药物。因此，研发新型的双靶点抑制剂，对于胰腺癌的基础研究与临床治疗均具有十分重要的价值。
3.2 GSK-3β的分子结构及其生物学功能
  （1）糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）属于糖原合成酶激酶-3家族，在哺乳动物体内主要存在GSK-3α与GSK-3β两种同工酶。这两种亚型的氨基酸序列具有高度同源性，其中催化结构域的同源性可高达98%[6]。GSK-3β由420个氨基酸构成，整体结构主要分为N端结构域、催化结构域及C端结构域。其中，N端结构域上Ser9位点的磷酸化修饰能够显著抑制GSK-3β的激酶活性，催化结构域主要承担底物磷酸化的功能，而C端结构域则在底物识别与结合过程中发挥重要作用[7]。
  （2）作为一类功能广泛的丝氨酸/苏氨酸激酶，GSK-3β参与调控多条关键细胞信号通路。在经典Wnt/β-catenin通路中，GSK-3β可与APC、Axin等蛋白共同形成复合物，促进β-catenin发生磷酸化并被降解，进而抑制该信号通路的异常激活[8]。而在胰岛素信号通路中，胰岛素可通过PI3K/AKT通路介导GSK-3β的Ser9位点发生磷酸化，使其激酶活性受到抑制，从而解除对糖原合成酶的抑制作用，推动糖原合成过程[9]。除此之外，GSK-3β还广泛参与细胞周期进程、细胞凋亡、分化及迁移等多种生物学行为，对维持细胞正常生理状态具有重要意义。
3.3 GSK-3β在胰腺癌发生发展中的作用
  （1）在胰腺癌进程中，GSK-3β 作为细胞内重要的信号枢纽分子，参与调控 Wnt/β-catenin、NF-κB、PI3K/Akt 等多条核心致癌通路，在细胞增殖、凋亡、分化、迁移等生理过程中发挥关键作用[6]。传统观点认为 GSK-3β 肿瘤抑制因子，而近年来国内外研究证实，其在胰腺癌中呈异常过度激活状态，胰腺癌细胞系中普遍存在 GSK-3β Y216 位点磷酸化水平升高、S9 位点磷酸化水平下降的特征性修饰，持续激活的 GSK-3β 驱动肿瘤细胞增殖、侵袭转移及化疗抵抗表型的形成，成为胰腺癌治疗的潜在靶点[10]。
  （2）目前国内外已开发多种 GSK-3β 抑制剂，主要包括ATP 竞争性抑制剂、非ATP 竞争性抑制剂及双重抑制剂等，部分抑制剂在胰腺癌临床前研究中显示出一定活性，且 GSK-3β 抑制剂与吉西他滨等标准化疗药物联合使用时，可显著逆转化疗耐药、提升疗效，其机制与阻断 DNA 损伤修复通路、抑制上皮 - 间质转化（EMT）相关[11]。Elraglusib 等药物在胰腺癌中的临床研究已取得突破性进展，有望成为首个获批用于胰腺癌的 GSK-3β 抑制剂[12]，但GSK-3β靶向药单药对胰腺癌等实体瘤的抑制作用较弱，且部分ATP 竞争性抑制剂存在靶点选择性问题，易对 CDKs 等激酶产生抑制作用，其临床应用仍有待进一步优化。
3.4 铜离子（Cu²⁺）代谢紊乱在胰腺癌中的病理意义
  （1）铜离子作为生物体必需的微量元素，参与酶催化、电子传递及氧化还原平衡，而肿瘤微环境中铜离子的异常积累已成为多种癌症的共同特征，胰腺癌组织中 Cu²⁺含量显著高于正常胰腺组织，尤其是线粒体内铜池蓄积明显[13]。国内外研究表明， Cu²⁺可激活 PI3K/AKT、MAPK/ERK 等促增殖生存通路，作为 HIF-1α 转录共激活因子驱动肿瘤血管生成，还能上调 MMPs 家族表达、调节 EMT 相关蛋白，促进癌细胞迁移侵袭，同时通过影响药物转运蛋白功能、增强抗氧化防御体系，加剧胰腺癌化疗耐药[14]。
  （2）“铜死亡”机制的发现为胰腺癌治疗开辟了全新赛道，其核心为细胞内过量 Cu²⁺在线粒体内累积引发线粒体功能障碍和蛋白质毒性应激，胰腺癌因代谢异常活跃、化疗耐药性强，成为铜死亡疗法最具潜力的应用领域[14]。目前国内外已研发出多类靶向铜离子的药物，包括多配体铜配合物、受体靶向型铜配合物、铜离子载体及铜离子螯合剂等，其中双硫仑、伊利司莫、青霉胺等已上市，CuPhTh2、FA4-Cu 等处于临床前研究阶段，这类药物可通过诱导铜死亡、氧化应激、细胞凋亡等发挥抗胰腺癌作用，部分还能实现靶向递送，在提高疗效的同时降低全身毒性，为铜离子靶向治疗胰腺癌提供了多种策略[15]。
3.5 GSK-3β与铜离子（Cu²⁺）在胰腺癌中的交互作用及其联合靶向潜力
  （1）现有研究已揭示GSK-3β与Cu²⁺在胰腺癌发生发展中均发挥关键作用[4][5]，且二者存在功能交叉，铜离子参与的氧化还原反应可调节GSK-3β的活性，为胰腺癌双靶向治疗提供了理论基础，但目前国内外针对 GSK-3β/Cu²⁺ 双靶点的抗胰腺癌药物研发仍处于起步阶段，尚未有专门的双靶向抑制剂进入临床研究，现有研究多为单一靶点药物的探索，缺乏对二者协同调控机制及双靶向药物的系统研究。
  （2）吡咯并吡啶类化合物是抗肿瘤药物研发的重要骨架，其杂环结构与ATP 嘌呤碱基类似，可有效结合激酶ATP结合位点，多为ATP竞争性抑制剂，能靶向 HER2/EGFR、CDK、Met 等多种激酶[16][17]，吡咯替尼、CDK8 抑制剂 22 等衍生物已在乳腺癌、结直肠癌等肿瘤研究中显示出良好的抗肿瘤活性，部分已上市或进入临床研究阶段[18]。此外，吡咯并吡啶化合物还可靶向代谢酶、微管蛋白等发挥抗肿瘤作用[19]，但其在胰腺癌中的研究主要集中于单一激酶靶向，尚未有将其作为GSK-3β/Cu²⁺双靶向抑制剂的相关研究，其通过双靶向调控胰腺癌的作用机制、二者的协同效应及具体调控网络均尚未阐明，存在较大的研究空白。
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科学假说图 C83双靶向GSK-3β/Cu²⁺协同抑制胰腺癌的分子机制
  基于国内外研究现状，GSK-3β在胰腺癌中异常激活且与不良预后密切相关，Cu²⁺代谢紊乱亦在肿瘤进展中发挥关键作用，但二者协同调控机制及双靶向干预策略尚属空白。本项目前期基于TCGA数据库证实GSK-3β在胰腺癌组织中高表达（***P <0.001），且高表达与患者生存率显著负相关（Log-rank **P <0.01）；通过计算机辅助药物设计成功合成系列吡咯并吡啶化合物，优选出双靶向候选分子C83；体外激酶活性检测显示C83对GSK-3β抑制率高达98.2%（1.0 μM），IC50<50 nM，且对10种其他激酶选择性优异；CCK-8、克隆形成、Transwell及流式细胞术预实验结果表明，C83在MIA PaCa-2和AsPC-1细胞中呈浓度依赖性抑制增殖（IC50分别为2.50 μM和11.33 μM）、克隆形成、迁移并诱导凋亡，效果显著优于单靶点抑制剂C22和C42（**P <0.01）；同时高剂量（1000 mg/kg）小鼠体内安全性评价显示C83对主要脏器无明显毒性。基于此，我们提出如下科学假说：新型吡咯并吡啶化合物C83通过同时抑制GSK-3β激酶活性与螯合细胞内游离Cu²⁺，实现对胰腺癌的“双靶向”协同抑制作用。具体而言，C83一方面阻断GSK-3β介导的NF-κB炎症通路与Wnt/β-catenin信号轴，另一方面干扰Cu²⁺代谢相关的TopBP1-ATR-Chk1 DNA损伤修复轴，并诱导铜死亡，从而协同抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭，诱导细胞凋亡与周期阻滞，最终克服单靶点药物的耐药性，实现高效低毒的抗胰腺癌效果（假说图）。
参考文献
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4. 创新点与项目特色
4.1 项目创新点
（1）科学现象创新：首次发现胰腺癌对GSK-3β促癌信号与Cu²⁺代谢紊乱存在双重脆性依赖，提出联合阻断通路与铜代谢的协同致死新现象，突破单靶点耐药瓶颈。
（2）作用机制创新：创制双功能小分子C83，在同一分子内实现GSK-3β抑制与Cu²⁺螯合，揭示双靶干预在周期阻滞、凋亡及转移抑制中的交互对话，填补协同调控机制空白。
（3）临床转化创新：构建“细胞-动物-人源类器官”三级评价平台，利用PDO模型保留肿瘤异质性与微环境特征，提升临床前药效预测准确性，加速候选分子临床转化。
4.2 项目特色
（1）提出“双靶协同、减毒增效”干预策略：双重阻断GSK-3β与Cu²⁺，协同增强抗肿瘤效力并降低毒性，拓展治疗安全窗。
（2）提供自主知识产权候选分子：核心分子C83结构新颖、成药性明确，为抗胰腺癌一类新药开发提供实体依据。
（3）构建“机制-筛选-验证”转化闭环：整合分子机制、类器官筛选与动物模型，形成完整证据链，提升临床转化价值。
5. 技术路线、拟解决的问题及预期成果
5.1 技术路线
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5.2 拟解决的问题
  化合物的靶向性和有效性问题：明确新型吡咯并吡啶化合物能否特异性靶向GSK-3β/Cu²⁺，以及对胰腺癌细胞的抑制效果，解决化合物作用靶点不明确、抑制活性不确定的问题 。
  作用机制不明问题：系统阐明化合物通过双靶向GSK-3β/Cu²⁺抑制胰腺癌的分子机制，解析双靶点之间的协同作用关系及其下游调控的关键信号通路，拓展人们的认识。
  临床转化基础问题：通过动物模型和类器官模型验证化合物的体内抗肿瘤活性和药代动力学特性，为化合物进一步向临床应用转化提供必要的实验数据和理论基础，解决从实验室研究到临床应用的过渡问题。
5.3 预期成果
本研究计划有望取得以下成果：
  筛选出 1-2 种对胰腺癌细胞敏感的新型吡咯并吡啶化合物。阐明化合物通过双靶向 GSK-3β/Cu²⁺抑制胰腺癌细胞增殖、诱导凋亡、阻滞周期、抑制迁移侵袭的分子机制，明确下游关键信号通路,深入揭示化合物在胰腺癌发生发展中的作用机制。
  培养学生提高其阅读文献能力、写作能力和相关实验技能。
  发表本专业高水平论文一篇。
6. 项目研究进度安排
2026/6-2026/9:
（1）文献调研：分析GSK-3β/Cu²⁺双靶向抑制剂及吡咯并吡啶类化合物的研究进展
（2）预实验：测定化合物活性浓度范围（CCK-8法）
2026/10-2027/4:
（1）细胞水平药效研究：检测药物对胰腺癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响（CCK-8/划痕实验等）。
（2）分子机制研究：通过生物信息学分析（如RNA-seq）筛选关键通路，并用WB/qPCR验证。
（3）体内药效评价：建立裸鼠移植瘤模型，腹腔注射药物后监测肿瘤体积/转移。Western Blot检测靶蛋白表达水平。
2027/5-2027/12:
（1）构建人胰腺癌类器官模鉴定：收集临床样本构建胰腺癌类器官（PDO），通过HE染色及标志物免疫荧光/组化鉴定，确立体外模型。
（2）药敏测试与机制确证：开展C83单药及联合用药的浓度梯度干预，利用活死染色评估抑瘤活性；结合Western blot/qPCR检测通路蛋白与基因表达，在类器官水平验证双靶向分子机制。
2028/1-2028/6:
实验查缺补漏、数据处理与分析、论文撰写。
7.1 与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
7.1.1  研究基础和积累
  团队在前期研究中，紧密围绕胰腺癌（PDAC）治疗难点，针对GSK-3β 靶点及铜离子（Cu²⁺）代谢异常两大关键科学问题，开展了系统性的生物信息学挖掘、药物分子设计、合成化学优化及体外药效评价工作。目前已完成从靶点确证到先导化合物筛选的全链条预实验，积累了详实的实验数据和坚实的理论基础，具体总结如下：
（1）基于TCGA数据库分析GSK-3β在胰腺癌中的差异表达及预后意义
  为探究GSK-3β在胰腺癌中的差异表达及其与患者预后的关系，我们利用The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库分析了GSK-3β mRNA在胰腺癌组织与正常组织中的表达水平，并评估其与生存期的关联。结果显示，与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中GSK-3β mRNA表达水平极显著高于正常胰腺组织（***P <0.001），差异倍数达3.5倍以上；Kaplan-Meier生存分析表明，生存概率下降更快，整体预期生存率显著低于低表达患者，提示GSK-3β高表达与胰腺癌患者的不良预后密切相关（Log-rank **P <0.01，图1A-B）。此外，文献调研与前期预实验证实，胰腺癌细胞内存在铜离子（Cu²⁺）异常蓄积，且Cu²⁺可通过激活MAPK/mTOR等促癌通路协同GSK-3β推动肿瘤恶性进展。上述结果为本项目提出“GSK-3β/Cu²⁺双靶向协同抑制”策略提供了数据支持与理论依据。
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图 1. TCGA数据库中GSK-3β在胰腺癌中的表达及生存率
A. 用箱线图呈现GSK-3β在正常胰腺组织与胰腺癌组织的显著表达差异。横轴分为Normal（正常胰腺组织）和Tumor（胰腺癌组织）两组；纵轴用Log₂(FPKM+1)标准化，表示GSK-3β的表达水平。B. 用KM生存曲线显示GSK-3β表达水平与胰腺癌患者的生存率关系，横轴表示患者的生存时间；纵轴表示患者的生存概率。
（2）吡咯并吡啶类GSK-3β/Cu²⁺双靶向抑制剂的设计与分子对接验证
  为探究吡咯并吡啶衍生物与GSK-3β的相互作用模式及结合位点，我们基于课题组在构效关系方面的前期积累，通过计算机辅助药物设计技术对先导化合物进行结构修饰，重点引入铜离子螯合功能基团，成功构建并合成了一系列新型吡咯并吡啶衍生物。经理化性质表征与纯度检测（HPLC纯度>98%），优选出三个代表性候选分子：高选择性GSK-3β抑制剂C22、C42，以及双靶向抑制剂C83。进一步采用分子对接模拟评估各化合物与GSK-3β的结合模式。结果显示，C83不仅保留了与关键氨基酸残基（如Asp133、Val135）形成的氢键网络，其侧链修饰基团还额外产生了疏水堆积作用，从结构生物学角度预示了其潜在的高亲和力与高选择性（图2）。
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图 2. 吡咯并吡啶类型化合物的结构以及与GSK-3β结合的位点
图2从左至右依次为C22、C42、C83三个化合物的二维化学结构式（上方）及其与GSK-3β蛋白的三维结合模式（下方）。二维结构式展示了核心骨架与可变修饰位点；三维结合模式以虚线标示化合物与GSK-3β关键氨基酸残基之间的氢键，呈现结合口袋及相互作用方式。
（3）吡咯并吡啶类化合物对GSK-3β 激酶的选择性谱型分析
  为确证化合物的体外靶点活性，我们采用放射性同位素标记法及高灵敏度的Lance Ultra均相检测技术，经化合物处理后，红框内GSK-3α/β 的柱状高度均接近0，活性几乎被完全抑制，而对于其他所有被测试的激酶，大部分活性都保持在对照组的70%以上，说明C22、C42、C83对于GSK-3β 激酶的特异性抑制作用。系统评价了候选化合物对GSK-3β 的抑制效力及对其他相关激酶的选择性。
  选择性谱分析：激酶谱筛选数据显示，在1.0μM测试浓度下，双靶向化合物C83对GSK-3β的抑制率高达98.2%，而对包括CDK5、CK1、AKT在内的10种结构相近的激酶抑制率均低于10%，表现出卓越的靶标选择性，极大降低了脱靶毒性的风险（图3）。
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图 3. 吡咯并吡啶类型化合物对GSK-3β激酶选择性评价
图3柱状图展示了三种吡咯并吡啶化合物（C22、C42、C83）对GSK-3β及其他10种激酶选择性评价结果。横轴表示激酶类型（包括目标激酶GSK-3α/β，以及 AMPK、CDK 系列、CHK1、CK2、MAPK、PKA等多种常见激酶），纵轴表示经化合物处理后，激酶活性相对于空白对照组的百分比，用于展示化合物对不同激酶的选择性评价结果。
（4）候选化合物对GSK-3β激酶的抑制效力（IC50）评价
  为评估所合成的吡咯并吡啶类化合物对GSK-3β激酶的抑制活性，我们采用激酶活性检测方法，测定了候选化合物的半数抑制浓度（IC₅₀）。结果显示，三个代表性化合物对GSK-3β均表现出纳摩尔级别的强效抑制活性，IC₅₀值分别为0.37 nM、0.39 nM、0.23 nM及0.51 nM，其中活性最优者IC₅₀低至0.23 nM。上述结果表明，该类吡咯并吡啶衍生物对GSK-3β具有高效抑制作用，为后续双靶向抑制剂的优化奠定了药理学基础（图4）。
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图 4. 吡咯并吡啶类型化合物对GSK-3β激酶的抑制效果评估
图4通过剂量-效应曲线展示了三种吡咯并吡啶类化合物（C22、C42、C83）对 GSK-3β 激酶的抑制活性评估结果。横轴为化合物浓度，纵轴表示激酶抑制率。
（5）高活性GSK-3β 胰腺癌细胞系的筛选与确认
  为筛选出适合本研究的体内外药效评价模型，我们选取四种具有不同遗传背景及GSK-3β磷酸化特征的胰腺癌细胞系（PANC-1、MIA PaCa-2、BxPC-3、AsPC-1），采用Western Blot检测各细胞系中GSK-3β的激活状态。结果显示，MIA PaCa-2细胞（原位癌模型）呈现mTORC1-GSK-3β交叉激活特征（p-GSK-3β-S9低、p-Y216高）；AsPC-1细胞（转移癌模型）受炎症微环境诱导呈GSK-3β持续激活；BxPC-3细胞因PI3K/AKT通路失活导致GSK-3β去抑制；PANC-1细胞Wnt通路异常激活但药效响应波动较大。上述四种细胞系GSK-3β均处于高活性状态，适合作为本项目中GSK-3β/Cu²⁺双靶向抑制剂的验证模型（图5）。
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图5. GSK-3β高度激活的胰腺癌细胞系
A. 四种胰腺癌细胞系（PANC-1、MIA PaCa-2、BxPC-3、AsPC-1）的临床相关性及GSK-3β激活分子机制；B. 各细胞系形态图。
（6）不同胰腺癌细胞系对吡咯并吡啶类化合物的剂量-效应响应
  为评价所合成的吡咯并吡啶类化合物对不同胰腺癌细胞系的抗增殖活性，我们采用CCK-8法检测了C83、C22、C42在MIA PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3及PANC-1细胞中的剂量-效应关系。结果显示，MIA PaCa-2细胞对各化合物最为敏感。双靶向抑制剂C83在该细胞中的IC₅₀值为2.50 ± 0.01 μM，较单靶点化合物C22（3.81 μM）活性提升52%，较C42（>10 μM）提升超过150%（**P < 0.01）（图6A）。在AsPC-1转移性模型中，C83同样表现最优（IC₅₀ = 11.33 μM），优于C22（16.59 μM）及C42（>20 μM）（图6B）。BxPC-3细胞敏感性较低（IC₅₀ = 9.09 μM），PANC-1细胞药效波动较大，缺乏稳健性（图6C-D）。因此，我们确立MIA PaCa-2作为原位癌核心研究模型，AsPC-1作为转移耐药辅助模型。上述结果证实“GSK-3β/Cu²⁺”双靶向策略具有显著的协同增效作用，尤其在GSK-3β高度激活的细胞背景下更为突出。
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图6. C22，C42和C83对ASPC-1、MIA-PACA-2、BXPC-3、PANC-1细胞增殖的影响
A-D. 我们采用CCK-8法检测C83、C22、C42在各细胞系中的抗增殖活性。分别展示了三种 GSK-3β 抑制剂（C22、C42、C83）在四种 GSK-3β 高活性胰腺癌细胞系中，对肿瘤细胞增殖的抑制效果。横轴表示化合物浓度，纵轴表示细胞存活率。
（7）C83对胰腺癌细胞迁移能力的抑制作用
  为探究双靶向抑制剂C83对胰腺癌细胞迁移能力的影响，我们采用Transwell迁移实验，检测不同浓度C83处理后MIA PaCa-2细胞的定向迁移能力。结果显示，对照组穿膜细胞数量最多，细胞迁移活跃；随着C83浓度增加（1/4 IC₅₀、1/2 IC₅₀、IC₅₀），迁移至下室的细胞数目呈浓度依赖性减少，IC₅₀浓度下迁移抑制最为显著（图7）。上述结果表明，C83可有效抑制胰腺癌细胞的迁移能力，为其抗肿瘤活性提供了体外细胞学证据。
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图7. C83 对 MIA PaCa-2 胰腺癌细胞迁移能力的影响
图7 Transwell法检测C83对MIA PaCa-2 胰腺癌细胞不同浓度（0、1/4 IC₅₀、1/2 IC₅₀、IC₅₀）处理后的迁移、侵袭能力的影响（**P <0.01***P <0.001，****P <0.0001）
（8）基于平板克隆形成实验验证C83对胰腺癌细胞株的增殖抑制作用
  为评估双靶向抑制剂C83对胰腺癌细胞长期增殖能力的影响，我们采用平板克隆形成实验，检测不同浓度C83处理后MIA PaCa-2（原位癌）及AsPC-1（转移癌）细胞的克隆形成能力。结果显示，C83对两种细胞系的克隆形成均呈浓度依赖性抑制作用。结晶紫染色显示，对照组形成大量密集克隆；1/4 IC₅₀处理后克隆数量显著减少；1/2 IC₅₀时克隆形成几乎完全抑制；IC₅₀浓度下未见可见克隆。定量分析表明，AsPC-1细胞中1/4 IC₅₀组与对照组差异显著（**P <0.01），1/2 IC₅₀ 及IC₅₀ 组与对照组差异极显著（****P <0.0001）；MIA PaCa-2细胞更为敏感，各浓度组与对照组差异均极显著（****P <0.0001）（图8）。上述结果从长期增殖角度证实C83可强效抑制胰腺癌细胞克隆形成能力，且MIA PaCa-2细胞对C83更为敏感。
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图8. C83 处理后AsPC-1细胞克隆现象及克隆形成率
A. C83处理后AsPC-1细胞克隆形成（结晶紫染色）；B. C83处理后AsPC-1细胞克隆形成现象及定量统计。C83浓度梯度为0、1/4 IC₅₀、1/2 IC₅₀、IC₅₀（**P <0.01，****P <0.0001）。
（9）C83对胰腺癌细胞凋亡的诱导作用
  为探究双靶向抑制剂C83是否诱导胰腺癌细胞凋亡，我们采用Annexin V-FITC/PI双染联合流式细胞术，检测不同浓度C83处理后MIA PaCa-2、AsPC-1细胞的凋亡率。结果显示，C83可浓度依赖性诱导细胞凋亡。与对照组相比，1/2 IC₅₀处理组早期及晚期凋亡细胞比例显著增加；IC₅₀组凋亡率进一步升高；2 IC₅₀组凋亡最为显著，总凋亡率较对照组升高3倍以上（图9）。上述结果表明，C83可有效诱导胰腺癌细胞凋亡，为其抗肿瘤机制提供了细胞学证据（**P <0.01，****P <0.0001）。
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图9. C83 对 MIA PaCa-2胰腺癌细胞凋亡能力的影响
图9 C83浓度为0、1/2 IC₅₀、IC₅₀、2 IC₅₀，处理24 h后，凋亡细胞比例随浓度升高而增加。
（9）C83 对铜离子的特异性螯合筛选及细胞内铜稳态的调控验证
  为明确化合物C83的金属离子靶向选择性，我们首先采用紫外-可见吸收光谱法（UV-Vis），系统考察了C83与多种生理及病理相关金属离子（Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Al³⁺）的相互作用。结果显示，加入Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺及Zn²⁺后，C83的特征吸收峰位置及吸光度均未发生显著变化，表明其对上述离子缺乏亲和力；而引入Cu²⁺与Al³⁺时，C83的光谱出现明显红移及增色效应，吸收峰形剧烈改变。该体外化学实验结果初步证实，C83对Cu²⁺具有高度的特异性识别与螯合能力。
  在此基础上，为验证C83在复杂细胞微环境中对铜离子的调控作用，我们利用铜离子特异性荧光探针CS1，结合激光共聚焦显微镜，检测了C83处理后MIA PaCa-2细胞内游离铜离子的相对含量。共聚焦成像显示，对照组细胞呈现较强的红色荧光信号，代表基础水平的胞内游离铜；而经C83处理后，细胞内红色荧光强度显著减弱。荧光定量分析表明，与对照组相比，C83处理组的平均荧光强度下降约50%（***p < 0.001）。上述结果从体外分子层面到细胞生物学层面形成完整证据链，证实C83能够特异性结合铜离子并显著降低胰腺癌细胞内的生物可利用铜浓度，为其作为“GSK-3β/Cu²⁺”双靶向抑制剂的作用机制提供了关键的化学与细胞学依据。
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图 10. C83 对铜离子的特异性识别及其对 MIA PaCa-2 细胞内铜稳态的调控作用
A. C83 及其与 Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Al³⁺在甲醇溶液中的紫外-可见吸收光谱
B. C83 通过铜探针染色检测对 MIA PaCa-2 细胞中铜离子荧光信号的影响（***p < 0.001）。
（11）GSK-3β 抑制剂在体内的安全性评价
  为评估C83的体内安全性，采用高剂量（1000 mg/kg）C83对小鼠进行灌胃给药。结果显示，给药组小鼠体重在观察期内持续增长，与对照组相比无显著差异（图11A），提示该剂量下未引起明显全身毒性。大体解剖观察显示，C83处理组小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要脏器的大小、色泽及形态均未见肉眼可见异常（图11B）。HE染色组织病理学分析进一步证实，与对照组相比，C83高剂量组小鼠各主要脏器组织结构完整，细胞形态正常，未见明显炎症细胞浸润、坏死、变性或水肿等病理改变（图11C）。综上所述，C83在实验剂量下表现出良好的安全性。
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图11. GSK-3β 抑制剂C83在体内的安全性评价
A. 给药期间小鼠体重变化曲线。B. 小鼠实验主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的大体解剖形态。C. 主要脏器的组织病理学分析（HE染色）。
  综上所述，本项目已成功构建了基于“双模型（MIA PaCa-2 + ASPC-1）”的研究体系。预实验数据不仅验证了双靶向抑制剂C83在纳摩尔级对靶点的强效抑制能力，更在微摩尔级实现了对胰腺癌细胞增殖的显著抑制，且效果显著优于单靶点药物（**P < 0.01）。这些扎实的阶段性成果，为后续深入解析NF-κB炎症通路及TopBP1-ATR-Chk1 DNA损伤修复轴等下游分子机制，以及开展体内动物实验奠定了实验基础。


7.2 已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法
7.2.1 已具备的条件
  实验材料：已成功合成并纯化得到高纯度的新型吡咯并吡啶化合物（C22, C42, C83）；构建了四种胰腺癌细胞系（MIA PaCa-2, ASPC-1等）的稳定培养体系；完成了TCGA数据库挖掘及分子对接模拟。
  技术掌握：团队掌握细胞功能实验（CCK-8、流式细胞术、Transwell、划痕实验）、分子生物学检测（Western blot、qPCR、免疫组化）及动物实验技术（皮下/原位移植瘤模型构建）。
  硬件设施：依托济宁医学院SPF级实验动物中心（SYXK（鲁）2018 0002认证）及完善的分子生物学实验室，拥有激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、化学发光成像系统等关键设备，可保障本项目顺利实施。
  团队扎实：指导教师在激酶抑制剂研发及肿瘤机制研究方面经验丰富，前期相关成果已为本题目奠定了坚实基础。
7.2.2 尚缺少的条件
  深层机制验证工具：针对双靶向下游具体信号通路（如TopBP1-ATR-Chk1轴）的验证，尚需构建特定的基因敲低/过表达稳转株。
  类器官模型构建：人源胰腺癌类器官（PDO）模型的构建及药敏评价体系尚需进一步优化和标准化。
  内药代动力学数据：化合物在体内的代谢稳定性及分布特征数据目前尚属空白。
7.2.3 解决方法
  技术攻关：利用CCK-8法、流式细胞术、Transwell实验及划痕愈合实验评估化合物对胰腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响；采用Western blot、qRT-PCR及转录组测序（RNA-seq）技术解析GSK-3β/Cu²⁺双靶向抑制胰腺癌的分子机制及信号通路；建立胰腺癌小鼠皮下/原位移植瘤模型及人胰腺癌类器官模型，验证化合物的体内抗肿瘤活性及联合用药效果。
  实验材料：通过采购、合作交换等方式，获取所需的实验材料。
  合作单位：与学校生物信息中心及附属医院病理科合作，优化类器官培养条件。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 12000.00 8000.00
1. 业务费 5000.00 无 2000.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 2000.00 交通出行 2000.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 论文出版 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 15000.00 细胞培养相关用品、抗体、WB、PCR相关试剂耗材、小鼠饲养鉴定、造模 10000.00 5000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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