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黄芩苷通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制食管鳞癌进展的机制研究

申报人：于露 申报日期：2026-03-13

基本情况

2026创新项目
黄芩苷通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制食管鳞癌进展的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生自主选题
二年期
食管鳞癌是我国高发易耐药的恶性肿瘤，晚期5年生存率不足20%，亟需高效低毒天然药物。黄芩苷为中药黄芩主要活性成分，但其抗食管鳞癌机制尚不明确。团队前期发现，黄芩苷可抑制KYSE450细胞增殖与侵袭，下调β-catenin、Bcl-2、c-Myc，上调GSK-3β，提示其抑制Wnt/β-catenin通路。基于此，我们提出假说：黄芩苷通过调控Wnt/β-catenin通路抑制食管鳞癌进展。为验证这一假说，本课题以KYSE450细胞为模型，采用CCK-8、EdU、流式细胞术、划痕愈合及Trawell实验评估黄芩苷对增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响；运用Western blot、RT-qPCR和免疫荧光检测GSK-3β、β-catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1表达及β-catenin核转位变化；借助Wnt通路激活剂氯化锂进行功能挽救实验；最后构建裸鼠皮下移植瘤模型，评估其体内抑瘤效果，并通过免疫组化验证通路分子变化。本研究拟从细胞和动物水平阐明黄芩苷经Wnt/β-catenin通路抑制食管鳞癌进展的分子机制，为靶向治疗提供实验依据与潜在靶点。

        入校以来，项目负责人积极参与科研训练，现已熟练掌握细胞培养、Western blot、PCR等常规分子生物学实验技术，可独立完成相关实验操作。学术成果方面，参与发表SCI一区论文2篇，在文献检索与阅读、实验数据整理、学术论文撰写等方面积累了较为系统的经验，能够熟练运用SPSS、Photoshop等软件完成基础数据分析。学科竞赛方面，曾参与“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛获校级金奖，参与全国大学生市场调查与分析大赛获省级一等奖，参与大学生创新创业类竞赛获市级铜奖。在本次项目前期准备中，我在指导教师带领下完成了文献调研与部分预实验工作，对课题研究背景、科学问题及实验设计均有较为深入的理解，这为项目的顺利实施提供坚实保障。

        指导教师主持并完成国家自然科学基金项目1项，校级基金项目2项，参与国家自然科学基金项目5项，近5年在国内外期刊上发表高质量论文20余篇。
  本项目的顺利推进得益于两位指导老师在申报与实施全流程中提供的全方位、系统性支持：
  1.顶层设计与科学把关：项目初期，指导老师牵头组织文献研读，精准凝练核心科学问题，从源头上保障了课题的科学性、创新性与可行性。
  2.过程管理与技术赋能：执行阶段，建立定期组会制度，针对核心实验技术开展专项培训，实时解决操作难题，确保了实验流程的规范性与数据结果的可靠性。
  3.资源保障与前沿引领：积极协调学校及实验室管理部门，落实仪器使用权限与试剂耗材采购，为实验开展扫清障碍；同时持续分享领域最新进展，帮助团队把握科研前沿，拓宽学术视野。
  4.人才培养与学风建设：注重“授人以渔”，着力培养团队成员的科研思维与规范意识，引导树立严谨的治学态度和高效的协作精神，营造了积极向上的科研氛围，为项目高质量完成奠定了坚实的人才基础。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
于露 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 负责Western blot、Transwell等实验，负责数据汇总与统计分析，撰写项目申报书与结题论文
赵天驰 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2024 负责裸鼠饲养、给药、肿瘤测量；参与免疫组化染色及组织切片观察
曲仪琳 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 负责KYSE450细胞培养、传代、冻存；执行CCK-8、EdU、流式细胞术、划痕愈合等实验
宋慈 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 负责文献检索与整理；参与竞赛材料准备
孙润琪 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 执行Western blot、免疫荧光等实验；检测Wnt通路相关蛋白/mRNA表达
杨浩辰 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 负责LiCl激活剂实验；协助统计分析；整理实验数据图表

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
魏晓楠 精准医学研究院 否
李艳平 精准医学研究院 否

立项依据

  食管癌（esophageal cancer, EC）是发生于食管黏膜上皮或腺体组织的恶性肿瘤。在全球范围内，其年新发病例约51.07万例，居恶性肿瘤发病第11位；年死亡病例达44.51万例，位居癌症相关死亡第7位[1]。我国是EC的高发地区，其中食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）为主要病理类型，占比超过90%[2]。尽管手术、放疗、化疗及免疫治疗等手段不断发展，但晚期ESCC患者预后仍极差，5年生存率仅约20%[3]。加之化疗耐药、治疗反应不佳等问题，临床疗效显著受限。因此，发掘高效、低毒的天然活性产物，已成为改善ESCC治疗效果、提高患者生存率的重要方向。
        黄芩苷（baicalin, BC）是从唇形科植物黄芩中提取的主要黄酮类活性成分，具有抗菌、解热、抗氧化、抗病毒等多种药理作用[4,5]。近年来，其抗肿瘤活性逐渐成为研究热点。刘等[6]研究发现，BC可通过调控凋亡相关蛋白（如上调Bad、下调cIAP-1）抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡；在EC中，BC亦能抑制细胞增殖、迁移与侵袭，并可通过 miR-126-5p 靶向抑制WEE1激酶表达进而诱导EC细胞凋亡[7]。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是EC发生发展的关键机制[8]。β-catenin在ESCC组织中的异常表达与患者不良预后密切相关[9]。然而，BC是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制ESCC进展，目前尚未明确。
        基于此，本课题拟系统探讨BC对ESCC细胞增殖、侵袭及迁移等恶性生物学行为的抑制作用；明确Wnt/β-catenin信号通路在BC抑制ESCC发生发展中的关键作用；阐明BC通过调控该通路关键分子发挥抑癌效应的具体机制。本研究可为ESCC的天然药物靶向治疗提供实验依据与潜在分子靶点。
        1. BC对ESCC细胞恶性生物学行为的影响
        (1)采用CCK-8法，以0、50、100、150、200、250 μmol/L浓度梯度BC处理KYSE450细胞，观察BC对ESCC细胞的抑制作用，测定细胞存活率并计算IC50作为后续功能实验的最佳给药浓度（已完成，见图1A）。
       (2)采用CCK-8法及5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）染色，通过检测EdU阳性细胞比例评估BC对KYSE450细胞S期DNA复制的阻断能力，结合CCK-8结果共同反映BC对细胞增殖的抑制作用；采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率，明确BC是否通过诱导凋亡清除ESCC细胞（CCK-8增殖抑制实验已完成，见图2）。
       (3)通过划痕愈合实验检测划痕愈合率，通过Transwell侵袭实验计数穿过基质胶的细胞数，观察BC对KYSE450细胞迁移与侵袭能力的影响（Transwell侵袭实验已完成，见图1B）。
        2. BC对ESCC细胞Wnt/β-catenin信号通路的调控作用
        (1)采用Western blot检测BC对KYSE450细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（包括GSK-3β、β-catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1）的表达水平，通过灰度值分析明确BC是否在蛋白水平抑制该通路及其下游效应分子（Western blot实验已完成，见图3）。
        (2)采用RT-qPCR检测该通路相关基因mRNA表达水平，通过2-ΔΔCt法计算相对表达量，验证BC是否在转录水平调控该通路。
        (3)采用免疫荧光染色并通过激光共聚焦显微镜观察β-catenin在细胞质与细胞核内的分布，计算核/质荧光强度比值，明确BC是否抑制β-catenin核转位。
        3. Wnt/β-catenin 通路挽救实验验证BC抑癌作用机制
        采用Wnt通路激活剂氯化锂（LiCl）处理细胞，通过CCK-8法、EdU染色、流式细胞术、划痕愈合及Transwell实验检测各组细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力的变化，并采用Western blot检测GSK-3β、β-catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1的蛋白表达，观察LiCl能否逆转BC的抑制作用，以验证Wnt/β-catenin通路在BC抑癌效应中的关键作用。
       4. 动物体内实验验证
       (1)将KYSE450细胞接种于裸鼠右腋窝皮下构建移植瘤模型，造模成功后分组给予BC干预。
       (2)定期测量并记录瘤体积与重量，实验结束后，剥离肿瘤并称重，计算抑瘤率。
       (3)取各组肿瘤组织进行免疫组化检测，分析GSK-3β、β-catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1等蛋白表达，体内证实BC可抑制Wnt/β-catenin信号通路活性发挥抑癌作用。

       ESCC是亚洲最常见的恶性肿瘤之一，主要起源于食管上段、中段的鳞状上皮，在我国西北地区发病率较高，具有显著的地域差异。由于缺乏准确的早期诊断和筛查方法，大多数患者确诊时已达中晚期，5年总生存率不足30％[1]。EC的发生与吸烟、饮酒、饮食习惯、环境及遗传等多种危险因素密切相关[2]，但其确切关键病因及分子交互机制尚未完全阐明。目前，手术仍是ESCC主要治疗手段。对于局部进展期ESCC，单纯手术难以控制其高复发与转移风险[3]，多采用以手术为核心，联合放疗、化疗及免疫治疗等多学科综合治疗模式，这也是NCCN指南推荐的标准方案。对于不可手术的局部晚期ESCC仍需更为有效的全身治疗策略。以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂虽能改善晚期ESCC患者生存，成为一线、二线和新辅助治疗的重要选择，但仅20-30%的患者能长期获益[4]，多数患者因原发或获得性耐药促使病情恶化[5]。因此，在现有治疗体系之外从天然药物中筛选可增敏放化疗、逆转免疫耐药或具有直接抗肿瘤活性的新型药物，已成为改善ESCC临床预后的迫切需求与重要研究方向。

       近年来，BC的抗肿瘤作用受到广泛关注。Li等[6]研究发现，BC可诱导卵巢癌细胞凋亡并引起细胞周期G2/M期阻滞。Pourhanifeh等[7]的综述进一步指出，BC在乳腺癌等癌症中可通过调控PI3K/Akt/mTOR、MAPK/ERK及Wnt/β-catenin等多条信号通路发挥抗癌作用。在食管癌中，BC已被证实可通过调控凋亡相关蛋白、干扰线粒体途径诱导细胞凋亡[8]，并通过上调miR-126-5p、下调靶基因WEE1表达，显著抑制EC细胞迁移与侵袭[9]。此外，BC还通过细胞毒作用、诱导凋亡、抑制血管新生及转移等多重机制，在肝癌、前列腺癌、胃癌、肺癌及皮肤癌中展现出抗肿瘤活性。因此预测，BC对ESCC亦可能具有潜在治疗价值，值得深入探究。
        Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞增殖、分化、凋亡及迁移等生命活动的核心通路。在生理状态下，β-catenin与由Axin、GSK-3β、APC、CK1形成的降解复合体结合，继而发生磷酸化与泛素化降解，通路处于静息状态；当通路异常激活时，β-catenin降解受阻，在胞质内异常蓄积并转位入核，与TCF/LEF转录因子结合形成复合体，启动下游靶基因转录，驱动细胞异常增殖。在肿瘤发生中，β-catenin降解调控关键分子异常及其胞质蓄积是该通路异常激活的中心事件。大量研究表明，β-catenin异常表达广泛存在于结直肠癌、肝细胞癌等多种消化道肿瘤中[10,11]。在ESCC组织中亦普遍存在β-catenin胞质和（或）胞核的过度表达、膜表达减少或缺失等现象[12,13]。异常活化的β-catenin可进一步上调c-Myc、Cyclin D1等下游致癌靶基因，其表达水平与食管癌变进程呈正相关，共同导致细胞周期紊乱与过度增殖，促进肿瘤发生发展。
       目前，BC在ESCC中的抑癌作用是否通过调控Wnt/β‑catenin信号通路实现，仍需进一步验证。然而，大量研究已证实黄芩苷可通过该通路在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用。在结肠癌中，黄芩苷经miR-217/DKK1介导的机制抑制Wnt信号通路，下调β-catenin和c-Myc表达[14]；在肺癌中，黄芩苷通过抑制Wnt/β‑catenin信号通路，抑制细胞增殖、侵袭、迁移并诱导凋亡[15]；在肝癌中，黄芩苷通过调控ROCK1/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制肿瘤增殖和转移[16]。本课题组前期研究结果显示，BC处理KYSE450细胞后，Western blot显示β-catenin、Bcl-2和c-Myc蛋白表达水平显著下调，而GSK-3β表达明显升高（图3），进一步提示BC可能通过靶向Wnt通路核心分子发挥抗肿瘤作用。基于此，我们提出科学假说：BC通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制食管鳞癌进展。本研究将在细胞和动物水平上深入探究BC调控Wnt/β-catenin通路抑制ESCC恶性进展的分子机制，有望为ESCC的靶向治疗提供新的候选药物和理论依据。
主要参考文献：
[1] YANG H, WANG F, HALLEMEIER C L, et al. Oesophageal cancer[J]. The Lancet, 2024, 404(10466): 1991-2005.
[2] UHLENHOPP D J, THEN E O, SUNKARA T, et al. Epidemiology of esophageal cancer: update in global trends, etiology and risk factors[J]. Clinical Journal of Gastroenterology, 2020, 13(6): 1010-1021.
[3] ZENG Y, SU X, ZHOU T, et al. Propensity-matched study on locally advanced esophageal cancer: surgery versus post-operative radiotherapy[J]. Radiation Oncology, 2024, 19(1): 130.
[4] YANG F, DAN M, SHI J, et al. Efficacy and safety of PD-1 inhibitors as second-line treatment for advanced squamous esophageal cancer: a systematic review and network meta-analysis with a focus on PD-L1 expression levels[J]. Frontiers in Immunology, 2025, 15: 1510145.
[5] PANG K, SHI Z D, WEI L Y, et al. Research progress of therapeutic effects and drug resistance of immunotherapy based on PD-1/PD-L1 blockade[J]. Drug Resistance Updates, 2023, 66: 100907.
[6] LI X, YUE J, KUMAR Y, et al. Chemoprotective effect of baicalin against cyclophosphamide induced ovarian toxicity in mice via inhibition of TGF-β[J]. Heliyon, 2023, 9(12): e22079.
[7] POURHANIFEH M H, FARROKHI-KEBRIA H, MOSTANADI P, et al. Anticancer properties of baicalin against breast cancer and other gynecological cancers: therapeutic opportunities based on underlying mechanisms[J]. Current Molecular Pharmacology, 2024, 17: e18761429263063.
[8] 刘莎莎, 赵杨, 申兴斌. 黄芩苷对食管癌细胞增殖及凋亡影响的研究[J]. 河北医学, 2019, 25(11): 1887-1891.
[9] 符鑫, 彭鑫, 黄婷婷, 等. 黄芩苷通过miR-126-5p调节WEE1对食管癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响[J]. 中国老年学杂志, 2024, 44(11): 2693-2698.
[10] HUSSEIN Z H, AL HASSAWI B, IBRAHEEM Q. Aberrant β-catenin expression and its association with epithelial-mesenchymal transition and clinical outcomes of colorectal cancer[J]. Cureus, 2024, 16(1): e53104.
[11] YU H, WU J, GAO L. Elevated expression of CK19, Ki67, and β-catenin as prognostic biomarkers in hepatocellular carcinoma[J]. BMC Cancer, 2025, 12;26(1):96.
[12] KUDO J, NISHIWAKI T, HARUKI N, et al. Aberrant nuclear localization of β-catenin without genetic alterations in β-catenin or Axin genes in esophageal cancer[J]. World Journal of Surgical Oncology, 2007, 5: 21.
[13] 周晓波, 吕宁, 张维, 等. β-连环蛋白在食管癌组织中的表达及意义[J]. 癌症, 2002, 21(8): 877-880.
[14] JIA Y, CHEN L, GUO S, et al. Baicalin induced colon cancer cells apoptosis through miR-217/DKK1-mediated inhibition of Wnt signaling pathway[J]. Molecular Biology Reports, 2019, 46(2): 1693-1700.
[15] 侯从岭, 雷小婷, 芦晓帆, 等. 黄芩苷对肺癌H460细胞生物学特性及Wnt/β-catenin信号通路的影响[J]. 中国老年学杂志, 2022, 42(2): 426-430.
[16] SUN J, YANG X, SUN H, et al. Baicalin inhibits hepatocellular carcinoma cell growth and metastasis by suppressing ROCK1 signaling[J]. Phytotherapy Research, 2023, 37(9): 4117-4132.
       选题新颖：ESCC是我国高发、高耐药的难治性肿瘤，尽管BC在多种恶性肿瘤中表现出抑癌活性，但其在ESCC中的作用及分子机制尚不完整，尤其是BC是否通过调控经典致癌通路Wnt/β-catenin发挥抗肿瘤效应，目前相关研究较为有限。本课题组前期实验发现：BC可调控Wnt/β-catenin信号通路抑制KYSE450细胞转移（见前期工作，图1），提示Wnt/β-catenin信号通路可能是BC发挥抑癌作用的关键节点。基于此，本课题凝练出“BC通过干预Wnt/β-catenin信号通路抑制ESCC恶性进展”的核心科学假说，将BC的抗ESCC作用与Wnt/β-catenin通路直接关联，具有鲜明的原创性与前沿性，为中药单体靶向治疗食管鳞癌提供了新的切入点。
       紧贴临床：立足食管鳞癌耐药与预后不良的现实瓶颈，为靶向治疗提供新策略与分子标志物。ESCC起病隐匿、侵袭性强，晚期患者5年生存率不足20%，且对化疗及免疫治疗普遍存在原发性或获得性耐药，目前临床尚缺乏高效、低毒的辅助治疗药物。本项目以天然药物BC为干预手段，其作为黄芩主要活性成分，具有来源广泛、毒性低、多靶点等优势，符合“高效低毒”的精准治疗趋势。同时，本研究拟阐明BC对Wnt/β-catenin通路的调控机制，该通路在ESCC中异常激活已被证实与不良预后密切相关，研究成果可为ESCC的分子分型、靶点筛选及联合用药策略提供实验依据与理论支撑，具备明确的临床转化潜力。
       1.研究方案
      (1)BC对ESCC细胞恶性生物学行为的影响
       1)根据预实验测定的IC50值，采用该浓度处理KYSE450细胞，用于后续实验。(已完成)
       2)采用EdU染色检测细胞增殖。按试剂盒说明书操作，BC处理后的细胞加入EdU孵育2 h，固定、染色后于荧光显微镜下观察并计数EdU阳性率。
       3)采用Annexin V-FITC/PI结合流式细胞术检测细胞凋亡。收集BC处理后的细胞，用预冷PBS洗涤2次，加入结合缓冲液重悬细胞，调节细胞密度至1×106/mL，取100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室温避光孵育15 min，300目尼龙网过滤后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。
       4)利用划痕愈合实验检测细胞迁移能力。将细胞接种于6孔板，用200 μL枪头在孔内均匀划痕，PBS洗涤去除脱落细胞，继续培养细胞，显微镜下观察并拍照，计算划痕愈合率。
       5)实施Transwell侵袭实验分析细胞侵袭能力。将细胞悬液接种至Matrigel包被的Transwell上室，下室加入含10% FBS的培养基。37℃、5% CO2培养24 h后，取出小室，用棉签拭去上室表面未侵袭的细胞，固定染色后，随机取5个视野计数侵袭细胞数。（已完成）
      (2)BC对ESCC细胞中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用
      1)采用Western blot检测蛋白表达。收集BC处理后的细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白样品行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入二抗，室温孵育1 h，ECL显色，凝胶成像仪显影，进行灰度值定量分析。（已完成GSK-3β、β-catenin、c-Myc、Bcl-2检测，见图3）
      2)采用RT-qPCR检测mRNA表达。提取细胞总RNA，测定浓度和纯度。取2 μg总RNA逆转录为cDNA。反应条件为95℃预变性3 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环。采用2-ΔΔCt法计算GSK-3β、β-catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1等分子的相对表达量。
      3)采用免疫荧光染色观察β-catenin核转位。将细胞接种于confocal小皿，BC处理后进行固定、透化、封闭，加入β-catenin一抗4℃孵育过夜，荧光二抗室温避光孵育，DAPI染核，激光共聚焦显微镜观察β-catenin在细胞质与细胞核中的分布。
       (3)Wnt/β-catenin信号通路在BC抑制ESCC中的作用验证
      1)使用Wnt通路特异性激活剂LiCl预处理细胞2 h，再加入BC共培养24 h，设立对照组、BC组、LiCl组、BC+LiCl组。
      2)采用CCK-8法、EdU染色检测各组细胞增殖能力变化，流式细胞术检测细胞凋亡率变化，划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力变化，观察LiCl能否逆转BC对KYSE450细胞的抑制作用。（CCK-8增殖抑制实验已完成，见图2）
      3)采用Western blot检测上述各组细胞中GSK-3β、β-catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1等蛋白表达是否恢复，验证Wnt通路在BC抑癌效应中的关键作用。
       (4)动物实验验证
       1)制备KYSE450细胞悬液，取0.2 mL接种于裸鼠右侧靠近腋下。定期用游标卡尺测量肿瘤长径和宽径，按公式肿瘤体积=（长径×宽径2）/2计算肿瘤体积。
       2)待肿瘤体积约为30 mm3时，将裸鼠随机分为对照组和BC组，每组6只。BC组腹腔注射BC溶液；对照组裸鼠注射等量生理盐水。
       3)观察裸鼠状态，每7 d测量一次肿瘤体积，35 d后裸鼠实施安乐死，剥离肿瘤并称重。
       4)取各组肿瘤组织进行免疫组化染色，检测GSK-3β、β-catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1等蛋白表达，从体内水平验证BC对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。
       2.技术路线
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       3.拟解决的问题
       本研究旨在阐明BC通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制ESCC恶性进展的分子机制，并探讨其临床转化潜力。主要包括以下科学问题展开：
      (1)BC是否通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，进而调控ESCC细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力。
      (2)BC调控Wnt/β‑catenin通路的具体分子机制：是否通过影响β‑catenin蛋白稳定性及核转位过程发挥调控作用。
      (3)BC-Wnt/β‑catenin调控轴在体内是否具有抑瘤效应。
       4.预期成果
       (1)理论成果
       1)阐明BC通过抑制Wnt/β‑catenin信号通路，抑制ESCC细胞增殖、迁移与侵袭、诱导凋亡的作用机制；
       2)明确BC干预Wnt/β‑catenin通路的关键分子节点，揭示其对β‑catenin蛋白稳定性及核转位的调控作用。
       3)证实BC-Wnt/β‑catenin调控轴在ESCC体内模型中的抑瘤效应，评价该轴关键分子作为ESCC治疗靶点的潜在价值，为天然药物靶向治疗ESCC提供新的理论依据。
       (2)技术指标
       研究成果以高水平学术论文形式呈现，预期发表SCI /核心期刊论文1-2篇；同时将研究内容凝练为参赛作品，参与“挑战杯”、“互联网+”等学科竞赛，提升成果应用与转化价值。
   1. 2026.06-2027.06
        (1)根据预实验确定的IC50值，确定BC的最佳干预浓度，为后续实验奠定基础（已完成）；
        (2)系统检测BC对KYSE450细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力的影响。采用Western blot、RT-qPCR、免疫荧光等技术，检测Wnt/β‑catenin通路核心分子（GSK-3β、β‑catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1）的表达水平及β‑catenin核转位变化，明确BC对该通路的调控作用（CCK-8增殖抑制实验已完成，见图2；Transwell侵袭实验已完成，见图1B；Western blot检测GSK-3β、β-catenin、c-Myc、Bcl-2已完成，见图3）；
        (3)采用Wnt通路激活剂LiCl开展功能挽救实验，反向验证Wnt/β-catenin通路在BC抑癌效应中的关键作用。
         2. 2027.06-2028.06
        (1)建立KYSE450细胞裸鼠皮下移植瘤模型，分组给予BC干预，定期测量瘤体积与重量，评估BC体内抑瘤效果；
        (2)采用免疫组化检测移植瘤组织GSK-3β、β-catenin、TCF4、Bcl-2、c-Myc、Cyclin D1表达，完成从体外机制到体内效应的完整验证；
        (3)完成全部实验数据整理与统计分析，发表SCI、中文卓越期刊或北大核心等高质量论文1-2篇，整理结题材料并提交结题报告，同时凝练成果申报相关学科竞赛。
       (1)BC显著抑制ESCC细胞侵袭
       经CCK-8实验确定，BC对KYSE450细胞的IC50值约为：142 μmol/L （图1A）。Transwell侵袭实验结果显示，与对照组相比，BC处理KYSE450细胞24 h后，细胞侵袭能力显著降低（图1B）。
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                                       图1. BC对KYSE450细胞存活率及侵袭能力的影响
                     注：NC，阴性对照组；BC，黄芩苷处理组；图1B图片左下角标尺为20×。
       (2)BC显著抑制ESCC细胞增殖
       采用CCK-8法检测BC对KYSE450细胞增殖能力的影响。结果显示，BC处理组OD值在各时间点均显著低于对照组，且随时间延长差距逐渐增大，表明BC可显著抑制细胞增殖（图2）。
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         图2. BC对KYSE450细胞增殖能力的影响
      注：NC，阴性对照组；BC，黄芩苷处理组。
       (3)BC下调ESCC细胞中β-catenin蛋白表达
       Western blot检测结果显示，与对照组相比，BC处理KYSE450细胞24 h后，β-catenin蛋白表达显著下调，GSK-3β表达明显升高，下游靶基因Bcl-2和c-Myc表达均显著降低（图3）。上述结果一致表明BC能够有效抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性，提示其可能通过该通路发挥抗肿瘤作用。
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    图3. BC对KYSE450细胞中Wnt/β‑catenin通路相关蛋白表达的影响
                 注：NC，阴性对照组；BC，黄芩苷处理组。
        (4)LiCl可部分逆转BC对KYSE450细胞增殖的抑制作用
       采用LiCl进行功能挽救预实验，CCK-8法检测BC及BC+LiCl处理的KYSE450细胞的增殖情况。结果显示，BC+LiCl联合处理组OD值高于BC单独处理组（图4），提示LiCl可部分逆转BC对KYSE450细胞增殖的抑制作用，进一步支持Wnt/β-catenin通路在BC抑癌效应中发挥关键作用。
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                      图4. LiCl作用后BC对KYSE450细胞增殖的影响
注：BC，黄芩苷处理组；BC+LiCl，黄芩苷联合Wnt通路激活剂氯化锂处理组。
       (5)文献调研与理论储备
       课题组在项目申报前系统查阅并梳理了国内外有关黄芩苷抗肿瘤作用及Wnt/β‑catenin信号通路在ESCC中作用的文献，全面掌握了本领域研究现状、前沿热点与关键技术方法，为本项目科学假说的凝练及实验方案的设计奠定了坚实理论基础。
       项目申请人所在实验室为山东省慢性非传染性疾病精准医学特色实验室，设有分子生物学实验室、细胞生物学实验室等专业实验室，仪器设备先进，并建有 SPF 级动物实验平台。实验室现有细胞培养箱、生物安全柜、蛋白电泳仪、倒置荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、酶标仪、蛋白成像系统等关键设备，可满足本项目所需细胞培养、增殖与凋亡检测、迁移侵袭实验、Western blot、RT-qPCR、免疫荧光染色及免疫组化等全部实验需求。
       课题组与基础医学院生物化学与分子生物学教研室保持长期稳定合作，可在生物信息学分析、引物设计等方面提供可靠技术支撑。部分大型仪器可依托学校大型仪器共享平台资源共享使用，能够充分保障本课题实验顺利开展。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 试剂耗材及版面费 10000.00 10000.00
1. 业务费 6000.00 版面费 0.00 6000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 6000.00 无 0.00 6000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 14000.00 血清、抗体等试剂 10000.00 4000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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