济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

济宁医学院 创新创业管理系统

详情

丙酸血症 PCCA c.2002G>A 突变体酶活性失活机制研究及其药物的研发

申报人：于存硕 申报日期：2026-03-12

基本情况

2026创新项目
丙酸血症 PCCA c.2002G>A 突变体酶活性失活机制研究及其药物的研发 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
丙酸血症是由丙酰辅酶A羧化酶缺陷引起的罕见遗传代谢病，PCCA c.2002G>A（p.Gly668Arg）是中国人群高频致病突变，与早发型重症密切相关。本研究团队前期已成功构建该突变型细胞模型并证实其导致酶活性显著下降，但分子机制尚未阐明，也缺乏靶向治疗手段。本项目拟深入解析该突变致酶失活的分子机制，明确突变对PCCA与HLCS结合及生物素化水平的影响，结合结构预测与分子动力学模拟揭示突变对蛋白构象动态的影响；进而以突变体结构为靶点，对FDA批准药物库进行虚拟筛选，获得可稳定突变蛋白构象的候选药物，并在细胞模型中验证其功能恢复效果。本项目旨在阐明该突变致酶失活的分子机制，获得具有构象稳定作用的候选药物，为丙酸血症等罕见遗传代谢病的靶向治疗提供新策略。
        获得过山东省生物技术大赛二等奖、第十六届全国大学生数学竞赛二等奖；曾作为项目负责人参与校级大创项目一项（编号：cx2024276）
1.山东省卫生健康委员会（山东省中医药管理局），面上项目，M20245102，基于多组学探讨木防己汤治疗慢性心力衰竭的有效成分及作用机制的研究，2025-01 至 2027-12, 5万元, 在研, 主持
2.山东省卫生健康委员会, 面上项目, 20230311337, 丙酸预处理通过调控Nrf2-PCC通路清除HNE减轻心肌缺血再灌注损伤的机制研究, 2024-01 至 2025-12, 1万元, 资助期满, 主持 
指导老师将在经费、理论指导、技术指导等方面给予本项目大力支持，以保证本项目顺利完成。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
于存硕 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 项目调研、撰写以及实验设计
李筱晴 精神卫生学院 精神医学（本科） 2025 论文撰写
路晓雅 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 数据处理分析
李瑞雪 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 酶活性检测
王恩哲 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 突变体设计和构建

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
朱苏红 基础医学院 否
王友 基础医学院 否

立项依据

       丙酸血症是一种由丙酰辅酶A羧化酶缺陷引起的罕见遗传代谢病，PCCA c.2002G>A（p.Gly668Arg）是中国人群高频致病突变，与早发型重症密切相关。目前该突变导致酶活性丧失的分子机制尚不明确，也缺乏针对性治疗手段。本项目拟在前期已构建的突变细胞模型基础上，结合分子动力学模拟与实验验证，解析该突变对蛋白构象及功能的影响；进一步以突变体结构为靶点，对FDA批准药物库进行虚拟筛选，获得可稳定蛋白构象的候选药物，并在细胞水平验证其功能恢复效果。本研究旨在阐明该突变的致病机制，为丙酸血症的靶向治疗提供潜在药物，也为其他罕见遗传代谢病的药物重定位研究提供借鉴。
 
1. PCCA c.2002G>A突变对蛋白结构与功能影响的机制研究
      基于前期已构建的突变型细胞模型，通过免疫共沉淀、Western Blot等技术检测突变对PCCA蛋白与HLCS（全羧化酶合成酶）结合能力及其生物素化水平的影响，明确突变干扰酶活性激活的关键环节。同时结合AlphaFold结构预测与分子动力学模拟，从原子水平分析突变对蛋白构象动态、局部灵活性及结构稳定性的影响，揭示突变导致酶活性丧失的分子机制。
2. 基于突变体结构的FDA药物虚拟筛选
      以解析的突变体三维结构为靶点，对FDA批准药物库（约1600余种药物）进行分子对接虚拟筛选，初步获得与突变蛋白具有较高结合亲和力的候选化合物。结合药物临床适应症、给药途径及安全性信息进行综合评估，排除不适合长期全身给药的药物，确定进入后续验证的候选分子。
3. 候选药物的分子动力学模拟与结合模式分析
    对筛选获得的候选药物与突变蛋白复合物进行多轮分子动力学模拟（10 ns和100 ns），通过计算结合自由能（MM/PBSA）、分析配体结合稳定性及蛋白关键区域构象变化，评估药物对突变蛋白的构象稳定效果。进一步解析药物与蛋白关键残基（如Lys694等）的相互作用模式，明确其潜在作用机制。
4. 候选药物在细胞模型中的功能验证
     利用前期构建的PCCA突变型iPSC来源心肌细胞模型，检测候选药物处理对PCC酶活性、特征代谢物积累（如丙酰肉碱）及细胞功能（如收缩功能）的改善效果，验证药物的功能恢复作用，为后续临床转化提供实验依据。
       丙酸血症（Propionic Acidemia，PA）是一种由丙酰辅酶A羧化酶（PCC）缺陷引起的常染色体隐性遗传代谢病，其病理基础在于PCCA或PCCB基因突变导致PCC酶活性丧失，使丙酰辅酶A及其毒性代谢物在体内蓄积，进而引发代谢性酸中毒、高氨血症及多器官损伤。该病临床表现异质性大，从新生儿期急性危象至迟发型轻度症状不等，严重者可致死或遗留永久性神经系统损伤[1]。
1. PCCA c.2002G>A突变是中国人群高频致病位点
       PCC酶是由α亚基（PCCA编码）和β亚基（PCCB编码）组成的线粒体异源十二聚体酶，目前已报道的PCCA和PCCB基因存在多种致病性变异，突变谱广泛[2]。不同人群的突变谱存在显著差异，明确特定人群的热点突变对于精准诊断和治疗具有重要意义。Liu等（2022）对60例中国丙酸血症患者的基因型-表型关系进行了系统分析，结果显示c.2002G>A（p.Gly668Arg）是中国PCCA基因中最常见的突变位点之一，等位基因频率达13.9%[3]。该结论在Zhang等（2023）对中国PA患病率的系统综述中得到了进一步确认，该研究汇总分析了61例中国PA患者的基因数据，发现c.2002G>A占PCCA突变等位基因的25.0%[4]，是频率最高的变异类型。该突变位于PCCA基因第22号外显子，导致第668位高度保守的甘氨酸被精氨酸取代，临床资料显示携带该突变的患儿多表现为新生儿期起病、症状严重且常合并心肌受累[3-4]。然而，目前关于该突变导致酶活性丧失的分子机制尚不明确，也缺乏针对性的靶向治疗策略。
2. 丙酸血症疾病模型的研究进展
       临床前研究依赖于能够准确模拟人类疾病病理过程的细胞和动物模型。在细胞模型方面，Tao等（2026）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了携带PCCA c.2002G>A纯合突变的人诱导多能干细胞（iPSC）等基因模型，该模型细胞维持正常核型和多能性，并可定向分化为心肌细胞。功能研究表明，突变型iPSC来源的心肌细胞PCC酶活性较野生型下降约8倍，丙酰肉碱水平显著升高，且在丙酸刺激下收缩功能明显受损。该模型的建立为研究PA的分子机制和药物筛选提供了可靠的细胞平台[5]。
3. 丙酸血症治疗策略的现状与挑战
       目前PA的临床治疗以对症支持治疗为主，主要包括限制天然蛋白摄入、补充左卡尼汀、使用抗生素抑制肠道产丙酸菌等，但这些方法无法根治疾病，患者仍面临代谢危象反复发作的风险[6]。肝移植虽可部分恢复PCC酶活性，但受限于供体短缺、手术风险及术后长期免疫抑制等问题[7]。近年来，基于信使RNA（mRNA）的酶替代疗法取得重要进展，Jiang等（2020）报道了编码PCCA和PCCB亚基的双mRNA疗法在小鼠模型中可恢复肝脏PCC酶功能并降低毒性代谢物水平，相关药物（mRNA-3927）已进入临床试验阶段[8]。国内学者也在积极探索新的治疗策略，韩连书等人于2024年联合发布了《丙酸血症筛查及诊治专家共识》，系统规范了PA的诊疗流程[9]。此外，杨艳玲等报道卡谷氨酸在有机酸血症所致高氨血症的防治中具有良好疗效，为PA急性期处理提供了新的药物选择[10]。
4. 基于蛋白构象稳定的药物重定位策略
       在囊性纤维化、肿瘤等疾病领域，基于突变蛋白构象稳定的小分子药物开发已取得突破性进展。例如，针对CFTR F508del突变的折叠校正剂可促进突变蛋白的正确折叠和膜定位[11]。这种“构象稳定剂”策略为包括PA在内的罕见遗传代谢病提供了新的治疗思路。通过计算机辅助药物筛选，从FDA已批准药物库中寻找能够稳定突变蛋白构象的小分子，具有研发成本低、周期短、安全性已知的优势。Subramanian等（2021）报道了泛酸激酶激活剂可通过改善辅酶A代谢缓解PA小鼠模型的线粒体功能障碍[12]，提示小分子药物在PA治疗中的应用潜力。然而，针对中国人群高频突变PCCA c.2002G>A的靶向药物研究仍属空白。
       综上所述，PCCA c.2002G>A突变是中国丙酸血症患者的重要致病位点，其分子机制尚未阐明，现有治疗手段存在局限性。基于已建立的iPSC疾病模型，结合结构生物学与计算机辅助药物筛选，探索靶向该突变的构象稳定剂，不仅有望为PA患者提供新的治疗选择，也为其他罕见遗传代谢病的精准治疗研究提供可借鉴的范式。 

参考文献
[1] Marchuk H, Wang Y, Ladd ZA, Chen X, Zhang GF. Pathophysiological mechanisms of complications associated with propionic acidemia. Pharmacol Ther. 2023;249:108501. doi:10.1016/j.pharmthera.2023.108501

[2] Wongkittichote P, Ah Mew N, Chapman KA. Propionyl-CoA carboxylase - A review. Mol Genet Metab. 2017;122(4):145-152. doi:10.1016/j.ymgme.2017.10.002

[3] Liu Y, Chen Z, Dong H, et al. Analysis of the relationship between phenotypes and genotypes in 60 Chinese patients with propionic acidemia: a fourteen-year experience at a tertiary hospital. Orphanet J Rare Dis. 2022;17(1):135. Published 2022 Mar 24. doi:10.1186/s13023-022-02271-3

[4] Zhang Y, Peng C, Wang L, et al. Prevalence of propionic acidemia in China. Orphanet J Rare Dis. 2023;18(1):281. Published 2023 Sep 9. doi:10.1186/s13023-023-02898-w

[5] Tao T, Lin L, Tang Y, et al. Generation of an isogenic human induced pluripotent stem cell line with a mutant propionyl-CoA carboxylase α subunit. Orphanet J Rare Dis. 2026;21(1):61. Published 2026 Jan 23. doi:10.1186/s13023-026-04197-6

[6] Baumgartner MR, Hörster F, Dionisi-Vici C, et al. Proposed guidelines for the diagnosis and management of methylmalonic and propionic acidemia. Orphanet J Rare Dis. 2014;9:130. Published 2014 Sep 2. doi:10.1186/s13023-014-0130-8

[7] Zhou GP, Jiang YZ, Wu SS, Kong YY, Sun LY, Zhu ZJ. Liver Transplantation for Propionic Acidemia: Evidence From a Systematic Review and Meta-analysis. Transplantation. 2021;105(10):2272-2282. doi:10.1097/TP.0000000000003501

[8] Jiang L, Park JS, Yin L, et al. Dual mRNA therapy restores metabolic function in long-term studies in mice with propionic acidemia. Nat Commun. 2020;11(1):5339. Published 2020 Oct 21. doi:10.1038/s41467-020-19156-3

[9] 韩连书,杨艳玲,杨茹莱,等.丙酸血症筛查及诊治专家共识[J].中国实用儿科杂志,2024,39(04):241-248.DOI:10.19538/j.ek2024040601.

[10] 杨艳玲,莫若,陈哲晖.甲基丙二酸血症的多学科综合治疗与防控[J].中华实用儿科临床杂志,2020,35(9):647-652.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20200324-00493.

[11] Rowe SM, Heltshe SL, Gonska T, et al. Clinical mechanism of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator potentiator ivacaftor in G551D-mediated cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2014;190(2):175-184. doi:10.1164/rccm.201404-0703OC

[12] Subramanian C, Frank MW, Tangallapally R, et al. Pantothenate kinase activation relieves coenzyme A sequestration and improves mitochondrial function in mice with propionic acidemia. Sci Transl Med. 2021;13(611):eabf5965. doi:10.1126/scitranslmed.abf5965 
       本项目的创新点和特色主要有以下几个方面：

  1.  聚焦中国人群高频突变，填补靶向治疗空白：PCCA c.2002G>A（p.Gly668Arg）是中国丙酸血症患者中最常见的致病突变位点，与早发型重症及心肌受累密切相关。然而，目前国内外针对该突变的分子机制研究尚不深入，更缺乏特异性靶向治疗策略。本项目聚焦这一中国人群高频突变，从机制解析到药物筛选形成完整研究链条，具有鲜明的临床针对性和地域特色。
  2. 首次提出“构象稳定剂”治疗新策略：不同于传统对症支持治疗或基因治疗思路，本项目基于突变蛋白构象动态异常的病理机制，首次提出“构象稳定剂”作为丙酸血症靶向治疗的新策略。通过筛选可稳定PCCA突变蛋白构象的小分子药物，从根本上恢复酶活性，为PA以及其他罕见病的治疗开辟全新路径。
  3. 计算生物学与实验生物学深度融合：本项目将结构预测、分子动力学模拟、虚拟筛选等计算生物学手段与iPSC疾病模型、免疫共沉淀、酶活性检测等实验技术有机结合，形成“计算预测-机制验证-药物筛选-功能评价”一体化的研究范式。多轮分子动力学模拟与结合自由能计算的联合应用，显著提高了药物筛选的准确性和效率。
  4. 基于FDA已上市药物的重定位策略，转化前景明确：本研究直接对FDA已批准药物库进行筛选，候选药物具有明确的药代动力学参数、安全性数据和临床用药经验，可大幅缩短从实验室发现到临床应用的转化周期。初步筛选获得的sirolimus、teniposide、natamycin等均为临床常用药物，具备良好的成药性和可及性。
  5. 依托前期工作基础，研究可行性高：项目团队已成功构建PCCA c.2002G>A突变型iPSC细胞模型并完成初步功能验证，相关成果已发表于国际学术期刊。同时，已初步完成突变蛋白结构预测、分子动力学模拟及FDA药物库虚拟筛选，获得3个候选化合物。扎实的前期工作为项目的顺利实施提供了有力保障。

       综上所述，本项目聚焦中国人群高频突变，首创构象稳定剂靶向策略，深度融合计算与实验方法，具有显著的创新性与前瞻性，为丙酸血症的精准治疗及转化医学研究提供了重要价值。

项目技术路线summernote-img

图1. 项目技术路线
拟解决的问题
        本项目旨在解决以下关键问题：

  1. PCCA c.2002G>A突变导致酶活性丧失的分子机制尚未阐明：目前已知PCCA c.2002G>A（p.Gly668Arg）是中国丙酸血症患者的高频突变位点，且与早发型重症密切相关，但该突变如何从分子水平导致PCC酶活性丧失尚不明确。具体而言，突变是否影响PCCA蛋白与HLCS（全羧化酶合成酶）的结合能力？是否干扰生物素化修饰过程？对蛋白三维构象和动态稳定性有何影响？这些问题有待系统解析。
  2. 突变对蛋白构象动态的影响缺乏原子水平的认识：传统实验手段难以捕捉突变对蛋白构象动态的细微影响。本项目需借助分子动力学模拟，从原子水平揭示Gly668Arg突变如何改变PCCA蛋白的局部灵活性、整体稳定性及构象空间分布，明确突变导致功能缺陷的结构基础。
  3. 缺乏针对中国人群高频突变的靶向治疗策略：目前丙酸血症的治疗以饮食控制、左卡尼汀补充和对症支持为主，缺乏能够从根本上修复突变酶功能的靶向药物。针对PCCA c.2002G>A这一中国人群特有高频突变的小分子药物研发仍属空白。
  4. 现有药物筛选方法难以兼顾效率与准确性：传统高通量药物筛选成本高、周期长，且难以评估药物与靶点结合的动态稳定性。如何建立高效、准确的计算筛选流程，从已上市药物中快速识别具有构象稳定潜力的候选分子，是本研究需要解决的方法学问题。
  5. 候选药物的功能验证缺乏合适的细胞模型：可靠的细胞模型是药物功能验证的基础。本项目需在已构建的突变型iPSC模型基础上，建立可用于药物评价的心肌细胞功能检测体系，实现对候选药物疗效的准确评估。 

预期研究成果

  1.  建立一套适用于所有由点突变引起的罕见病的“结构解析-虚拟筛选-动力学验证-功能评价”一体化筛选体系，并通过分子动力学模拟与细胞实验验证，获得1-3个能够稳定突变蛋白构象、恢复PCC酶活性的FDA批准药物候选分子，明确其与关键残基（如Lys694）的相互作用模式；
  2.  在国内外学术期刊发表研究论文1—2篇，申请发明专利1项，参加学术会议1—2次，项目组成员完成从文献调研、实验设计到数据分析的完整科研训练。 

表1：项目研究进度安排表
时间
主要研究内容
2026.06-2026.10             
突变机制解析：免疫共沉淀检测PCCA与HLCS结合及生物素化水平；AlphaFold结构预测与100 ns分子动力学模拟，分析突变对蛋白构象的影响。
2026.11-2027.02
药物虚拟筛选：以突变体结构为靶点，对FDA药物库（约1600种）进行分子对接，结合临床安全性评估，筛选20个高亲和力候选药物。
2027.03-2027.07
动力学验证：对候选药物进行10 ns和100 ns分子动力学模拟，结合MM/PBSA计算结合自由能，筛选2-3个具有构象稳定作用的候选药物。
2027.08-2028.01
细胞功能验证：在突变型iPSC来源心肌细胞中检测候选药物对PCC酶活性、代谢物积累及收缩功能的改善效果。
2028.02-2028.05
成果总结：整理数据，撰写论文1-2篇，申请专利1项，完成结题报告。

        已取得的成绩：项目指导老师长期从事罕见遗传代谢病的发病机制与治疗策略研究，在丙酸血症、甲基丙二酸血症等疾病的分子病理机制、疾病模型构建及药物筛选方面积累了丰富经验。近年来聚焦中国人群高频致病突变，系统开展了PCCA c.2002G>A突变的致病机制研究，相关成果已发表于Orphanet Journal of Rare Diseases等国际学术期刊。
         与本项目有关的研究积累：
        a.成功构建PCCA c.2002G>A突变型iPSC细胞模型：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得携带纯合突变的iPSC单克隆株（1H10），经Sanger测序验证目标位点突变正确（图2a），脱靶分析显示10个潜在脱靶位点均无突变。该细胞模型维持正常核型（46, XY）（图2c），稳定表达多能性标志物OCT4、NANOG、SOX2（图2d），并可定向分化为三个胚层（图2e、2f）。功能研究表明，突变型iPSC来源的心肌细胞PCC酶活性较野生型下降约8倍（图3），丙酰肉碱水平显著升高（图4），且在丙酸刺激下收缩功能明显受损（图5）。相关研究成果发表于Orphanet Journal of Rare Diseases。后续将利用该细胞模型，对筛选获得的候选药物进行功能验证，检测药物处理对PCC酶活性、代谢物积累及心肌细胞收缩功能的改善效果，为药物疗效评价提供可靠的细胞平台。
summernote-img
图2：PCCA突变诱导多能干细胞（iPSC）的特征。（a）Sanger测序色谱图显示PCCA基因中的纯合子c.2002G>A突变。（b）iPSC集落形态的显微镜图像（比例尺=500μm）。（c）G-带核型分析。（d）多能性标记OCT4、NANOG和SOX2的免疫荧光染色（比例尺=50μm）。（e）三线分化标记SOX17、Brachyury和PAX6的免疫荧光染色（比例尺=50μm）。（f）胚胎体形成（比例尺=500μm）。
summernote-img
图3:野生型和PCCA突变细胞iPSC中的PCC（丙酰辅酶A羧化酶）活性。N=3。误差条代表SE。****表示指定组之间的显著差异，p<0.0001。
summernote-img
图4:野生型和PCC突变组iPSC衍生心肌细胞（iPSC-CMs）培养基中的特征代谢物。（a）乙酰肉碱的相对丰度。（b）丙酰肉碱的相对丰度。（c）乙酰肉碱（C2）与丙酰肉碱（C3）的相对丰度比。N=6。误差条代表SE。**和****分别表示组间的显著差异，p<0.01和p<0.0001。
summernote-img
图5: 丙酸（PA）对 iPSC 源性心肌细胞（iPSC-CMs）收缩幅度的影响。 收缩幅度以 2.5 mM PA 处理 10 分钟后与处理前的比值表示。(a) 野生型（WT）iPSC-CMs 在 PA 作用下的代表性收缩轨迹图。(b) 突变型（Mut）iPSC-CMs 在 PA 作用下的代表性收缩轨迹图。(c) 收缩幅度比值的统计汇总。N=3。误差线表示标准误（SE）。**表示组间差异显著，*p* < 0.01

       b.突变蛋白结构预测与动态分析：利用AlphaFold Server成功预测PCCA c.2002G>A突变体三维结构，从5个预测模型中筛选出置信度最高的模型（ranking_score 0.88）作为后续研究基础（图6）。对野生型与突变型进行100 ns分子动力学模拟，结果显示突变型蛋白RMSD从野生型的0.75±0.01 nm升高至1.00±0.25 nm且波动显著增大（图7A），生物素结合域（残基647-728）RMSF值明显升高（图7B），溶剂可及表面积整体降低（图7C），回旋半径略有增加（图7D），自由能景观由单一深能井转变为多个浅能井分布（图7E）。以上结果证实Gly668Arg突变导致PCCA蛋白构象稳定性下降、局部灵活性增加。后续将以该突变体结构为基础，开展更大规模的药物虚拟筛选，并利用分子动力学模拟评估候选药物与靶点的结合稳定性及构象调控效果，为药物作用机制解析提供结构基础。
summernote-img
图6:由AlphaFold2预测的PCCA蛋白的3D结构（A） 野生型。（B）p.Gly668Arg突变体。
summernote-img
图7:蛋白质分子动力学模拟结果;（A） 均方根偏差（RMSD）比较；（B）残差均方根波动（RMSF）比较；（C）溶剂可及表面积（SASA）比较；（D）回转半径（Rg）比较；（E）自由能景观（FEL）（左：2D FEL；右：3D FEL）。

       c.基于突变体结构的FDA药物虚拟筛选：使用DoGSiteScorer对突变蛋白进行全表面结合口袋预测，获得体积1962.16 ų、药性评分0.81的最优口袋（Pocket 1），该口袋包含突变位点（图8）。以该口袋为靶点，对FDA批准药物库（1615种）进行分子对接筛选，获得前20个候选药物（结合能范围-10.6至-11.8 kcal/mol）（图9）。结合临床安全性评估，排除5种不适合长期全身给药的药物，剩余15种进入后续验证。后续将对筛选出的候选药物进行更深入的动力学模拟和结合自由能计算，进一步优化筛选参数，提高筛选准确率，并尝试对其他突变位点开展类似的药物重定位研究。
summernote-img
图8：预测的突变蛋白口袋
summernote-img
图9:筛选前20种药物（包括药物名称和CAS编号）

        d.候选药物的分子动力学验证：对15种候选药物进行10 ns初步分子动力学模拟，根据MM/PBSA结合自由能（<-20 kcal/mol）、配体平均RMSD（<4 Å）及关键区域RMSF变化（∣ΔRMSF∣<1 Å）三项指标筛选，获得同时满足三项标准的3个候选药物：natamycin、teniposide和sirolimus。对三者进行100 ns延长模拟，结果显示三种药物均能显著降低突变蛋白的整体构象波动（RMSD降至0.76-0.78 nm）（图10A），抑制生物素结合域的异常灵活性（RMSF显著下降）（图10B），使蛋白动态行为向野生型恢复且在100ns的模拟中持续有氢键作用（图10D）。自由能景观分析显示，药物结合后能井变得集中且加深（图11），证实其构象稳定作用。后续将在细胞水平验证这3个候选药物的功能恢复效果，并通过表面等离子体共振（SPR）或等温滴定量热法（ITC）测定药物与突变蛋白的结合亲和力，进一步验证计算结果的可靠性。
summernote-img
图10:候选药物结合对PCCA c.2002G>A突变体结构动力学和稳定性的影响注;（A）蛋白质骨架Cα原子均方根偏差（RMSD）时间演化的比较；（B）关键功能区残基（残基647-728）均方根波动（RMSF）的比较；（C）回转半径（Rg）分析比较；（D）药物-蛋白质复合物中氢键形成的动态分析；（E）溶剂可及表面积（SASA）的比较。
summernote-img
图11：药物结合后PCCA c.2002G>A突变体自由能景观的重塑

        e.结合自由能计算与能量分解：MM/PBSA计算显示，sirolimus结合最强（ΔG_bind=-24.29 kcal/mol），主要驱动力为范德华相互作用（ΔVDWAALS=-52.89 kcal/mol）；natamycin静电贡献显著（ΔEEL=-38.39 kcal/mol）；teniposide兼具范德华和静电贡献（表2）。能量分解表明，三种药物均与关键残基Lys694、Arg71、Arg353、Phe145等形成稳定相互作用（图12，图13），其中Lys694是生物素化位点，其稳定对酶活性恢复至关重要。后续将基于能量分解结果，对候选药物进行结构优化，设计亲和力更高、特异性更强的衍生物，并通过定点突变实验验证关键残基在药物结合中的作用，为药物设计和优化提供理论指导。

表2 Teniposide，Sirolimus，Natamycin的结合分数
能量分量
 Natamycin-PCCA (ΔG, kcal/mol)
Sirolimus-PCCA (ΔG, kcal/mol) 
Teniposide-PCCA (ΔG, kcal/mol)
ΔVDWAALS    
 -36.03 ± 2.20
 -52.89 ± 3.20
-40.14 ± 1.34
ΔEEL
 -38.39 ± 3.02
 -11.70 ± 0.41
-29.43 ± 1.99
ΔEGB
 63.98 ± 0.71
 47.42 ± 1.38 
54.40 ± 0.60
ΔESURF
-5.93 ± 0.15
 -7.12 ± 0.06
-5.59 ± 0.03
ΔGGAS
 -74.42 ± 3.95
 -64.59 ± 3.61 
-69.57 ± 2.54
ΔGSOLV
58.05 ± 0.73
 40.30 ± 1.38
48.50 ± 0.60
ΔTOTAL
-16.37 ± 4.02
 -24.29 ± 3.86
-21.06 ± 2.61 
summernote-img
图12：PCCA c.2002G>A突变体对候选药物（纳他霉素、替尼泊苷、西罗莫司）结合自由能的每残基分解。
 
summernote-img
图13:纳他霉素、替尼泊苷和西罗莫司的可视化分析



 

       a.已具备的条件：项目指导老师长期从事罕见遗传代谢病的发病机制与治疗策略研究，在丙酸血症、甲基丙二酸血症等疾病的分子病理机制、疾病模型构建及药物筛选方面积累了丰富经验，项目组成员已完成CRISPR/Cas9基因编辑、iPSC培养与分化、免疫共沉淀、Western Blot、分子动力学模拟、虚拟筛选等核心技术的学习和预实验，具备了独立开展本项目研究的能力。实验室配备了高性能计算工作站（64GB RAM，NVIDIA RTX 3080 GPU），可满足分子动力学模拟、分子对接等计算任务的需求，已熟练掌握AlphaFold结构预测、GROMACS分子动力学模拟、AutoDock Vina分子对接、MM/PBSA结合自由能计算等软件和方法，建立了完整的“结构解析-虚拟筛选-动力学验证”计算流程。申请人所在学院建有省级重点实验室，拥有PCR仪、蛋白纯化仪、超高效液相色谱、酶标仪、超高速离心机、超低温冰箱、CO₂培养箱、荧光显微镜等本项目所需的仪器设备，可满足细胞培养、蛋白提取、Western Blot、酶活性检测等实验需求。前期已成功构建PCCA c.2002G>A突变型iPSC细胞模型并完成初步功能验证，相关成果已发表于Orphanet Journal of Rare Diseases，同时已完成突变蛋白结构预测、分子动力学模拟及FDA药物库虚拟筛选，获得3个具有构象稳定潜力的候选药物（sirolimus、teniposide、natamycin），并明确了其与关键残基的相互作用模式，另一篇研究论文正在投稿中，扎实的前期工作为项目的顺利实施提供了有力保障。

       b.尚缺少的条件及解决方法：目前尚缺少表面等离子体共振（SPR）或等温滴定量热法（ITC）设备用于测定候选药物与突变蛋白的结合亲和力，以及高分辨质谱仪用于精确检测细胞代谢物变化，拟利用学校公共实验平台或委托校外专业机构进行检测，并与校内具有相关设备的实验室开展合作研究；冷冻电镜等蛋白结构解析设备的缺失可通过分子动力学模拟和分子对接结果为主进行结构分析，如确需实验验证，可与国内外具有冷冻电镜平台的科研机构开展合作研究；心肌细胞收缩功能分析需要专业的视频分析软件，目前已下载MUSCLEMOTION等开源软件并进行测试，可满足基本分析需求，后续可根据需要购置专业分析软件；部分进口实验耗材采购周期较长，将提前制定采购计划、寻找国产替代产品，并与校内其他实验室共享常用试剂耗材，确保实验顺利开展。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 12000.00 云计算、版面费、实验试剂耗材 10000.00 2000.00
1. 业务费 5000.00 云计算、版面费 3000.00 2000.00
（1）计算、分析、测试费 3000.00 云计算 3000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 2000.00 版面费 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 7000.00 实验试剂耗材（酶活性、筛选药物） 7000.00 0.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

版权所有： 南京先极科技有限公司        

访问量：0