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HSPA8通过NLRP3/GSDMD信号轴调控小鼠海马神经细胞焦亡减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究

申报人：马雯博 申报日期：2026-03-11

基本情况

2026创新项目
HSPA8通过NLRP3/GSDMD信号轴调控小鼠海马神经细胞焦亡减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
缺血性脑卒中占比超 85%，是我国成年人首要致死、致残病因。脑缺血再灌注损伤（CIRI）会造成神经元死亡、神经炎症失控，引发不可逆神经功能缺损。细胞焦亡是 CIRI 加重脑损伤的关键机制，NLRP3/GSDMD 信号轴是海马神经元焦亡的核心通路，靶向该通路具有重要研究价值。 热休克蛋白 HSPA8 可介导蛋白泛素化降解调控细胞稳态与炎症反应。其家族蛋白能抑制 NLRP3 炎症小体活化，但 HSPA8 在海马神经元中调控 CIRI 的具体机制仍不明确缺乏组织特异性验证。 前期实验显示，MCAO/R 模型小鼠海马区 HSPA8 表达随再灌注时间上调，12h 达峰值，表达特征与皮层明显不同，具有组织特异性，推测其为内源性保护因子。生信分析也证实 HSPA8 与 NLRP3 及焦亡通路高度关联。本研究假设：HSPA8 通过促进 NLRP3 泛素化降解，抑制 NLRP3/GSDMD 通路过度激活，减轻神经元焦亡，缓解 CIRI 损伤。 本研究采用 MCAO/R 动物模型与 HT22 细胞 OGD/R 模型，结合基因过表达、药物干预等实验，多维度解析其作用机制。研究成果有望发现新的治疗靶点。
  课题负责人自2025年10月以来，于济宁医学院科研处实验室学习基本实验技能，参与济宁医学院2022年度贺林院士新医学临床转化工作站科研基金《CB1R在脑缺血再灌注损伤中的保护作用机制研究》、2025年山东省医药卫生科技项目青年项目一项,《CB1R靶向MAPK/EGR1信号轴调节神经炎症缓解脑缺血再灌注损伤的作用机制研究》。参与并承担项目中动物模型构建、细胞培养与Western Blot等实验，目前已经熟练掌握了多种实验技术，并对HSPA8蛋白、脑缺血再灌注损伤有了一定程度的了解，为本课题的实验设计、开展与实验数据收集与分析等打下了坚实的基础。
2020年主持济宁医学院教师科研扶持基金一项，TNF-a-TNFR信号在脑缺血再灌注损伤中的作用机制研究（JYFC2019KJ009)，结题。
2021年主持山东省自然科学基金一项，CBI-CCK1R 异源二聚体信号转导及其对神经炎症调控机制的研究（ZR2020QC079)，结题。
2022年主持济宁医学院2021年度贺林院士新医学临床转化工作站科研基金项目一项，CBIR在脑缺血再灌注损伤中的保护作用机制研究(JYHL2021MS01)，结题。
2025年主持山东省医药卫生科技项目青年项目一项, CB1R靶向MAPK/EGR1信号轴调节神经炎症缓解脑缺血再灌注损伤的作用机制研究（202502080778），在研。
指导教师长期从事脑缺血再灌注损伤与神经信号转导调控领域，研究方向与本课题高度契合，在相关机制研究方面积累了深厚的理论基础与丰富的实践经验。其在研课题与本项目研究内容紧密衔接，可为课题提供成熟的实验范式与前期数据支撑；同时，指导教师在研项目经费保障充足，能够为本课题在实验设计、技术操作、数据分析及成果产出等全流程提供全方位支持，为项目的顺利实施与高质量完成奠定了坚实基础。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
马雯博 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 设计实验、建立OGD/R模型、CCK8实验、qRT-PCR实验、整理实验数据和撰写文章
徐嘉怡 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 ELISA实验、免疫荧光染色
胡瀚文 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 PI染色实验、TTC染色
孙晨耀 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 免疫共沉淀实验（Co-IP）、神经行为学
王依婷 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 LDH释放实验
张兆开 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 构建小鼠MCAO模型，Western Blot实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张胜男 精神卫生学院 否
陈星耀 医学影像与检验学院 否

立项依据

1. 明确CIRI下HSPA8表达规律与海马神经元焦亡的相关性，验证HSPA8抑制海马神经元焦亡，确认其神经保护作用。
2. 阐明HSPA8促进NLRP3泛素化降解、抑制焦亡通路的分子机制，证实NLRP3泛素化为HSPA8调控焦亡的关键靶点，提供干预依据。
  本项目先在动物实验CIRI模型中发现海马区HSPA8高表达的现象，随后通过生物信息学分析初步预测靶基因关系，依托公共数据库分析明确HSPA8与NLRP3焦亡通路的潜在关联，再以小鼠海马神经细胞HT22为研究对象，建立OGD/R体外细胞模型模拟脑缺血再灌注损伤，利用CCK-8、LDH释放实验、qRT-PCR、Western Blot、ELISA、免疫荧光染色、PI染色等实验方法，结合HSPA8过表达、特异性抑制剂干预手段，探究HSPA8对NLRP3/GSDMD介导的细胞焦亡的调控作用及缓解脑缺血再灌注损伤的分子机制，具体研究内容如下：
1 小鼠MCAO/R模型中HSPA8表达特征和生物信息学互作分析
（1）构建小鼠MCAO/R模型（假手术、再灌注6h、12h、24h），取海马组织Western Blot检测HSPA8在脑缺血再灌注不同时间点的动态表达特征。
（2）利用GEO数据库获取脑缺血再灌注损伤相关数据集，结合KEGG通路富集分析，明确脑缺血再灌注损伤后的差异基因富集于NLRP3介导的细胞焦亡通路。
（3）借助STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络，结合基因评分筛选，确定HSPA8与NLRP3的互作关系。
2 明确CIRI模型中神经元焦亡与HSPA8相关性
（1）取小鼠MCAO/R模型（假手术、再灌注6h、12h、24h）的海马组织，Western Blot检测NLRP3、cleaved‑Caspase‑1、GSDMD‑N蛋白表达特征。
（2）建立HT22-OGD/R模型，CCK‑8、LDH筛选最佳造模条件（损伤率40%–60%）。
（3）正常vs模型组：qRT‑PCR测HSPA8、NLRP3、Caspase‑1、GSDMD、IL‑1β、IL‑18 mRNA；Western Blot检测HSAPA8及焦亡相关蛋白表达；ELISA测上清炎症因子分泌，免疫荧光染色明确HSPA8与细胞焦亡的相关性。
3 HSPA8抑制海马神经元焦亡的功能验证
（1） HT22细胞转染HSPA8过表达质粒/空载体，qRT‑PCR、Western Blot验证过HSPA8表达效率。
（2）梯度VER155008（HSPA8抑制剂）、MCC950（NLRP3抑制剂）处理，CCK‑8、Western Blot实验筛选抑制剂的无毒有效浓度。
（3）设置实验组：对照组、OGD/R组、空载体组、HSPA8过表达组、VER155008组、MCC950组、过表达+VER组、过表达+ MCC组，按照相应组别进行处理后，细胞通过CCK‑8、LDH、PI染色、WB和免疫荧光检测焦亡表型，验证HSPA8的细胞保护作用。
4 HSPA8调控NLRP3泛素化降解的机制解析
（1）qRT‑PCR、Western Blot、ELISA检测各组HSPA8、NLRP3、ASC、cleaved‑Caspase‑1、GSDMD‑N、IL‑1β、IL‑18水平。
（2）免疫荧光观察HSPA8与NLRP3共定位；Co‑IP检测HSPA8与NLRP3之间互作关系。
（3）Western Blot检测NLRP3总泛素化、K48位泛素化水平，Co-IP检测HSPA8与NLRP3泛素化的互作关系，确认降解机制。
5 NLRP3通路回补，确认关键靶点
（1）HSPA8过表达+ MCC950回补，CCK‑8、LDH、PI染色、免疫荧光检测焦亡表型。
（2）Western Blot检测NLRP3、cleaved‑Caspase‑1、GSDMD‑N蛋白，确认HSPA8作用的靶点。 
1 脑缺血再灌注损伤与神经元焦亡的研究现状
  缺血性脑卒中是由脑动脉阻塞引起的脑组织缺血性坏死，占所有脑卒中病例的85％以上，是全世界致残和死亡的主要原因之一。其高发病率、致残率及死亡率对公众健康构成巨大威胁。近年来，随着人口老龄化进程加速与城市化的深入发展，我国缺血性脑卒中的新发病例数呈现上升的态势，年龄标准化发病率也呈上升趋势，对社会医疗保障体系造成巨大压力[1]。目前，缺血性脑卒中最有效的治疗策略是尽快恢复缺血区域的血流灌注，即静脉溶栓或机械取栓治疗。然而，血流恢复往往会诱发更严重的继发性损伤，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI），其发生机制复杂，涉及能量代谢紊乱、线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症和多种程序性细胞死亡方式[2][3]。
  越来越多的研究发现细胞焦亡在脑缺血再灌注损伤中起重要作用，不仅加剧炎症反应，还导致神经细胞死亡，进一步恶化脑损伤。细胞焦亡（pyroptosis）与细胞凋亡和坏死有明显区别，焦亡由炎症小体激活，经半胱氨酸蛋白醇﹣1(cysteine proteinase-1,Caspase-1）介导，并通过气凝胶蛋白D (Gasdermin D, GSDMD) 在细胞膜上形成孔道，导致细胞膜破裂和炎症介质释放，具有强烈的炎症反应特性。具体机制包括活性氧（reactive oxygen species, ROS)、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）和钙离子浓度变化等信号激活NLRP3炎症小体，随后Caspase-1裂解GSDMD。释放的GSDMD-N片段在细胞膜上形成孔道，引发细胞膜破裂和炎症因子释放。这些过程导致血脑屏障通透性增加，使更多炎症细胞和有害物质进入脑组织，加剧脑损伤[4]。抑制神经元焦亡可显著减轻CIRI，改善神经功能缺损，因此，探究焦亡的调控机制，寻找有效的抗焦亡分子靶点，对CIRI的防治具有重要的临床意义。

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                                图1 焦亡概述[18]
注释：a.细胞焦亡的形态学特征：图中展示了通过电穿孔技术转染了重组gasdermin D（GSDMD）活性氨基端片段（GSDMD-NT）的HEK293T细胞，并在含有活细胞不可透过性核酸染料碘化丙啶（PI）的培养基中培养。PI阳性的焦亡细胞表现出细胞肿胀以及大的气球样泡形态。
b. 焦亡的分子机制过程;在受到外源性或内源性损伤信号刺激时，处于自抑制状态的 gasdermin蛋白（GSDMs）会通过蛋白酶介导的切割作用或翻译后修饰被激活。此外，GSDMs也可通过功能获得性突变被激活。活化的GSDMs会转位至细胞膜，发生寡聚化并形成膜孔。同时，白细胞介素 - 1β（IL-1β）和IL-18等促炎细胞因子会被诱导表达，并经炎症性caspase加工成熟。GSDM细胞膜孔触发焦亡的发生，并作为通道，让成熟IL-1β、IL-18 等小分子炎症介质以及损伤相关分子模式（DAMPs）释放到细胞外，启动炎症级联反应。CT：羧基端片段；NT：氨基端片段。
3.2 NLRP3/GSDMD信号轴是神经元焦亡的核心执行通路
       Caspase-1是焦亡过程中最关键的蛋白酶，它能够裂解并激活GSDMD，同时也促使IL-Iβ和IL-18等促炎性细胞因子成熟并释放[4]。活化成熟的Caspase-1具有双重功能： 一方面切割焦亡执行蛋白GSDMD并产生GSDMD-NT片段，GSDMD-NT片段可与质膜中的磷酸肌醇结合，在细胞膜形成寡聚孔，破坏膜的完整性，导致细胞发生焦亡；另一方面，caspase-1催化pro-IL-18和proIL-1β成熟为IL-18和IL-1β，它们被释放到细胞外基质，启动和放大炎症级联反应，进一步加剧神经元损伤引起炎症反应[5]。GSDMD作为细胞焦亡的关键执行蛋白，在被Caspase‑1剪切后，其N端结构域会插入细胞膜并组装成膜孔，进而造成细胞膜破损、胞内物质释放，最终诱发细胞焦亡与剧烈的炎症应答。GSDMD在未裂解状态下无活性，只有被Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11裂解后，其N端片段才能嵌入细胞膜，形成孔道，导致细胞膜破裂和焦亡[6][7] 。
  炎症小体是细胞焦亡的核心组成部分，其中NLRP3炎症小体是研究最广泛的类型，其调控机制在细胞焦亡过程中尤为重要[4]。NLRP3炎症小体作为响应细胞危险信号的关键感受器，在脑缺血再灌注损伤（CIRI）后被激活，进而切割并活化caspase-1。NLRP3炎症小体由传感器蛋白NLRP3、适配蛋白ASC和效应蛋白pro-caspase-1组成，其激活通常需要两个信号：第一信号（启动信号）通过NF-κB通路上调NLRP3和pro-IL-1β的表达；第二信号（激活信号）由损伤相关分子模式（DAMPs）如ATP、活性氧（ROS）或晶体物质触发，促进炎症小体组装和caspase-1活化[8][9]。研究证实，NLRP3/GSDMD信号轴在CIRI后的神经元损伤中发挥核心作用[10]。Liu等研究发现，在大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中，缺血再灌注后NLRP3、ASC、caspase-1和GSDMD的表达均显著上调，且与梗死体积和神经功能缺损程度呈正相关[11]。Zhang等报道，使用NLRP3特异性抑制剂MCC950可显著抑制GSDMD的切割活化，减少神经元焦亡，缩小脑梗死体积并改善神经功能[12]。此外，在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导的神经元损伤模型中，敲低NLRP3或GSDMD均可显著减少LDH释放和PI阳性细胞，证实了该信号轴在神经元焦亡中的关键作用[10][11]。因此，NLRP3/GSDMD信号轴通过调控 Caspase‑1活化与GSDMD膜孔形成，紧密连接炎症激活与神经元焦亡，是脑缺血再灌注损伤中神经元死亡和炎症放大的关键通路。
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 图 2 细胞焦亡在脑缺血再灌注损伤中的作用机制[4]
注释：诱导细胞焦亡的机制涉及多个关键的信号和分子事件。ROS、细胞外液中的ATP、钙内流和DAMPs的释放共同作用，激活NLRP3炎性小体，募集ASC蛋白，进而激活Caspase-1。Caspase-1裂解GSDMD，释放GSDMD-N片段，并在细胞膜上形成 孔，导致细胞膜破裂，细胞焦亡。同时大量IL-1β、IL-18等炎症介质被释放，进一步加重局部炎症反应。DAMPs：损伤相关 分子模式；ASC：含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白；GSDMD：气凝胶蛋白D；NLRP3：Nod样受体家族pyrin结构域。
3 HSPA8调控NLRP3/GSDMD轴在缺血再灌注损伤中的研究进展
  热休克蛋白家族A成员8（HSPA8），又称热休克同源蛋白70（HSC70），是一种组成型表达的热休克蛋白，作为分子伴侣参与调节细胞分裂、伴侣活性、信号转导、转录、翻译控制，蛋白质折叠、转运、降解和自噬等多种细胞过程，特别是它在泛素-蛋⽩酶体途径中的发挥重要作⽤。泛素-蛋⽩酶体降解系统依赖于多泛素链与蛋⽩质底物的偶联，该底物作为靶向信号，然后被蛋⽩酶体的蛋⽩⽔解复合物降解[13]。NLRP3炎症小体的活化与细胞焦亡进程高度依赖其自身的泛素化修饰状态，而HSPA8作为关键调控分子，可通过影响NLRP3的泛素化降解，直接调控炎症反应与细胞焦亡的强度，近年来的研究也揭示了其在这一过程中的重要功能。
  越来越多的证据揭示HSPA8在调控炎症反应和细胞焦亡中的新功能。Fu[14]等的研究首次在脑缺血再灌注损伤中揭示了HSPA8通过乳酸化修饰调控NLRP3/GSDMD轴的具体机制[14],发现小鼠脑缺血再灌注后HSPA8的表达及其K524位点的乳酸化水平显著升高[14]，该研究首次证实了HSPA8的乳酸化修饰在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用，为靶向HSPA8乳酰化治疗CIRI提供了直接证据[14]。值得注意的是，HSPA8调控NLRP3/GSDMD轴的机制在不同疾病模型中具有保守性。Li等研究发现，在脓毒症诱导的急性肺损伤模型中，HSPA8的表达显著下调，通过影响E3泛素连接酶SKP2介导的NLRP3泛素化，促进NLRP3炎症小体活化和GSDMD依赖的细胞焦亡。也有研究表明，E3泛素连接酶Cbl-b通过连接NLRP3富含亮氨酸的重复结构域的泛素相关结构域与k63 -多泛素链结合,并靶向NLRP3的K496进⾏k48连接的泛素化和蛋⽩酶体介导的降解[15]。该研究进一步证实了HSPA8作为NLRP3上游关键调控因子的核心地位。Chen等研究发现，在心肌缺血再灌注损伤模型中，HSPA8通过抑制NLRP3炎症小体活化减轻心肌细胞焦亡和梗死面积[16]。这些研究共同提示，HSPA8通过促进NLRP3的泛素化降解、负向调控NLRP3/GSDMD轴介导的细胞焦亡，是一种潜在的内源性保护机制[14][15][16]。VER155008是一种小分子HSPA8抑制剂，可与BRAF抑制剂（如Encorafenib、Dabrafenib）协同作用,是有潜力的治疗靶点[17]。
  综上所述，NLRP3/GSDMD信号轴介导的神经元焦亡，是脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury, CIRI）发生发展的核心病理环节。现有研究已证实热休克蛋白家族A成员8（HSPA8） 可通过调控NLRP3泛素化降解参与炎症反应与细胞焦亡进程，但多集中于心肌损伤、肺部炎症等模型，在小鼠海马特异性神经元中，HSPA8靶向调控NLRP3/GSDMD信号轴、参与CIRI神经损伤的内在调控机制仍缺乏系统阐释，且HSPA8对海马神经元焦亡的特异性调控作用尚未明确。我们在前期动物实验中观察到，MCAO模型再灌注不同时间点的小鼠海马区域，HSPA8表达水平呈现明显上调趋势，与Fu等的研究结果一致，通过生物信息学分析发现在公共数据库中的脑缺血再灌注损伤富集基因主要集中于细胞焦亡相关通路，而且STRING分析HSPA8与NLRP3途径的蛋白存在直接或间接作用。基于上述理论和实验发现，我们提出如下科学假设：在小鼠海马神经元中，上调HSPA8的表达水平，可能进一步促进NLRP3的泛素化降解，进而阻断NLRP3/GSDMD信号轴的激活，发挥抑制海马神经元焦亡、减轻CIRI诱导脑损伤与认知功能障碍的作用。本项目将通过实验系统验证这一调控机制，研究结果有望为CIRI的神经保护干预提供潜在的新策略，为缺血性脑卒中的治疗研究开辟新的思路。

参考文献：
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1 拓宽对于分子伴侣蛋白的认知：突破HSPA8作为伴侣蛋白的传统功能，阐释HSPA8参与神经炎症与神经元焦亡耦联病理过程的作用特点，丰富HSPA8在脑血管疾病中的生物学功能研究范畴。
2 解析伴侣蛋白在脑缺血疾病中的作用机制：揭示HSPA8可通过抑制NLRP3炎症小体激活，减少下游炎症因子释放与神经元焦亡发生，有效缓解脑缺血再灌注后的神经炎症级联反应与继发性脑损伤。
3 突出靶点优势，为临床转化提供更多可能：选用内源性分子HSPA8作为研究靶点，相较于外源性药物干预安全性更具优势；相较于广谱抗炎、非特异性抗凋亡干预，靶向焦亡核心通路调控作用更精准，可为缺血性脑卒中依托焦亡通路开展防治策略研发提供理论参考与实验支撑。
1 技术路线
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图1 技术路线图
2 具体实验路线
2.1 小鼠MCAO/R模型中HSPA8表达特征和生物信息学互作分析
（1）小鼠MCAO/R模型构建及海马区HSPA8表达检测
  采用线栓法构建C57BL/6J小鼠大脑中动脉栓塞/再灌注（MCAO/R）模型，将小鼠随机分为假手术组（Sham）、MCAO/R 6h组、MCAO/R12h组、MCAO/R24h组，每组6-8只。假手术组仅分离颈内动脉，不插入线栓；模型组阻塞大脑中动脉90min 后拔出线栓实现再灌注，再灌注至预设时间点。
模型有效性验证：
a.神经行为学评分：再灌注24h时，采用改良的神经功能缺损评分（mNSS）对各组小鼠进行行为学评估，包括运动、感觉、反射和平衡功能，评分越高提示神经功能缺损越严重，以此评价模型构建是否成功。
b. TTC染色检测脑梗死体积：行为学评估结束后，取完整脑组织行TTC染色，正常脑组织呈玫瑰红色，梗死区呈苍白色，通过ImageJ软件定量分析梗死体积百分比，验证缺血再灌注损伤模型的有效性。
  在确认模型构建成功后，处死小鼠并分离海马组织，加入RIPA裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，通过Western Blot检测不同再灌注时间点HSPA8蛋白的表达水平，使用ImageJ软件对条带灰度值进行定量分析，比较各组间HSPA8 的表达差异。
（2）GEO数据库差异基因及通路富集分析
  利用GEO数据库获取脑缺血再灌注损伤相关数据集，筛选差异表达基因，结合KEGG通路富集分析，明确脑缺血再灌注损伤后的差异基因富集于NLRP3介导的细胞焦亡通路。
（3）蛋白互作网络构建及HSPA8-NLRP3互作关系筛选
  借助STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络，结合基因评分筛选，确定HSPA8与NLRP3的互作关系。
2.2 明确CIRI模型中神经元焦亡与HSPA8相关性
（1） 小鼠MCAO/R模型海马区焦亡相关蛋白表达检测
  取小鼠MCAO/R模型（假手术组、再灌注6h组、再灌注12h组、再灌注24h组）的海马组织，提取总蛋白，通过Western Blot检测NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N的蛋白表达水平，采用ImageJ软件进行灰度值定量分析，明确CIRI模型中神经元焦亡的动态变化特征，并结合（1）中HSPA8的表达趋势，初步分析HSPA8与焦亡的相关性小鼠海马神经元。
（2）HT22细胞培养与OGD/R焦亡模型的建立及条件优化
  HT22细胞常规培养于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞融合至70%-80%时进行传代，培养三代以上用于实验。将细胞以适宜密度接种于96孔板/6孔板，待贴壁后，更换为无糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂、5%O₂、90%N₂的三气培养箱中进行氧糖剥夺，分别设置4h、6h、8h、10h、12h剥夺时间；剥夺结束后，换回常规完全培养基，置于正常培养箱中复氧，设置4h、6h、8h、10h、12h复氧时间。采用CCK-8实验检测各时间点细胞活力，LDH释放实验检测膜损伤，筛选出细胞损伤率40%-60%的最佳OGD/R条件，建立稳定的焦亡模型。
（3） OGD/R模型中HSPA8与焦亡相关分子的表达检测
  将HT22细胞分为正常对照组和OGD/R模型组，按最佳造模条件处理后，收集细胞及细胞上清液。采用Trizol法提取细胞总RNA，反转录为cDNA后，通过qRT-PCR检测Hspa8、Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd、Il-1β、Il-18的mRNA相对表达量；采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，通过Western Blot检测HSPA8、NLRP3、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、pro-GSDMD、GSDMD-N、IL-1β的蛋白表达水平；采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-1β、IL-18的分泌量，分析HSPA8与焦亡分子表达的相关性。
2.3 HSPA8抑制海马神经元焦亡的功能验证
（1） 过表达细胞模型构建
  构建HSPA8过表达质粒（HSPA8-OE）和空载体质粒（Vector），将HT22细胞接种于6孔板，待融合至50%-60%时，采用脂质体转染试剂分别转染HSPA8-OE和Vector，转染后24h/48h，通过qRT-PCR和Western Blot检测HSPA8的mRNA和蛋白表达水平，验证过表达效率，确定最佳转染条件。
（2） HSPA8抑制剂浓度筛选
选用VER-155008（HSPA8/HSP70特异性抑制剂），设置梯度浓度（5μM、10μM、20μM、40μM）处理HT22细胞，同时设置DMSO溶剂对照组。处理24h后，采用Western Blot检测HSPA8蛋白表达及功能抑制情况，结合CCK-8检测细胞活力，筛选出显著抑制HSPA8功能且无明显细胞毒性的最佳工作浓度。
（3） NLRP3抑制剂浓度筛选
选用MCC950（NLRP3特异性抑制剂），设置梯度浓度（1μM、5μM、10μM、20μM）处理HT22细胞，同时设置DMSO溶剂对照组。处理24h后，结合CCK-8检测细胞活力、Western Blot检测NLRP3下游相关蛋白活化水平，筛选出显著抑制NLRP3炎症小体激活且无明显细胞毒性的最佳工作浓度。
（4）HSPA8对OGD/R诱导的HT22细胞焦亡的表型及机制检测
将HT22细胞随机分为8组：
1)Control组：正常培养，给予等体积DMSO处理；
2)OGD/R+VER155008单药组：不进行转染操作，直接给予最佳浓度VER155008预处理后进行OGD/R造模；
3)OGD/R 组：OGD/R造模，给予等体积DMSO处理；
4)OGD/R+Vector组：转染空载体后进行OGD/R造模；
5)OGD/R+HSPA8-OE组：转染HSPA8过表达质粒后进行OGD/R造模；
6)OGD/R+HSPA8-OE+VER155008组：转染HSPA8过表达质粒后，给予最佳浓度 VER155008预处理，再进行OGD/R造模；
7)OGD/R+VER155008转染对照组：转染空载体后，给予最佳浓度VER155008预处理，再行OGD/R造模；
8)OGD/R+MCC950组：给予NLRP3特异性抑制剂MCC950预处理后进OGD/R造模。
干预方式：转染组于造模前24h转染质粒，抑制剂组于造模前1h加入试剂预处理；后续按最佳条件进行OGD/R造模。
a. 表型检测：CCK-8、LDH释放、光镜下细胞形态、PI染色计数死细胞比例。
b. 分子机制检测：qRT-PCR检测Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd、Il-1β、Il-18 mRNA；Western Blot检测NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N、成熟IL-1β；ELISA检测上清IL-1β、IL-18；免疫荧光观察NLRP3和GSDMD定位及荧光强度。
2.4 HSPA8调控NLRP3泛素化降解的机制解析
（1） 蛋白互作验证
  收集各组HT22细胞制备细胞爬片，经固定、透膜、免疫荧光染色后，利用激光共聚焦显微镜观察并分析HSPA8与NLRP3在神经元内的分布及共定位情况。同步提取各组细胞总蛋白，运用免疫共沉淀（Co-IP）技术特异性富集NLRP3蛋白复合物，再结合Western Blot检测，明确两种蛋白的相互结合能力。
（2） 泛素化检测
  利用免疫共沉淀技术对各组细胞内的NLRP3蛋白进行富集沉淀，分别采用总泛素化抗体、K48位点特异性泛素化抗体开展Western Blot检测。对比分析不同组别中NLRP3蛋白的整体泛素化程度，以及K48位点泛素化修饰的强弱差异，判断泛素化修饰水平变化。
2.5 NLRP3通路回补验证
（1） 回补干预与表型检测
  选取稳定过表达HSPA8（HSPA8-OE）的HT22细胞，加入筛选得到的最优浓度MCC950预处理1小时，随后构建OGD/R损伤模型。同步设置HSPA8-OE组、单纯OGD/R模型组、MCC950单药组作为对照，通过CCK-8、LDH释放实验及PI染色，综合评估各组细胞活力、膜损伤及焦亡细胞比例变化。
（2） 通路靶点验证
  收集上述所有实验组细胞并提取总蛋白，借助Western Blot技术检测NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N等焦亡通路核心蛋白的表达量。对比通路回补组与HSPA8过表达组的蛋白表达差异，分析NLRP3/GSDMD信号轴的活化状态改变。
2.6 统计学分析
  实验数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，结果以均值±标准差（x±s）表示，每组实验独立重复3次，组间差异采用单因素方差分析（ANOVA），多重比较采用Tukey法，P<0.05为差异具有统计学意义。
3 拟解决的问题
3.1 明确脑缺血再灌注损伤（CIRI）进程中HSPA8的动态表达规律，验证其对神经元焦亡及细胞活力的调控作用，揭示其在脑损伤中的功能角色。
3.2 阐明HSPA8是否通过促进NLRP3泛素化降解、抑制NLRP3/GSDMD信号轴激活，进而发挥抗神经元焦亡的核心分子机制，为CIRI的神经保护研究提供潜在靶点。
4 预期成果
4.1 本项目成功构建OGD/R诱导的HT22细胞焦亡模型并确定最优造模条件，证实OGD/R可下调HSPA8表达、激活NLRP3/GSDMD信号轴诱导细胞焦亡；明确HSPA8过表达可抑制该信号轴激活、减轻神经元焦亡，证实其保护作用；最终阐明HSPA8通过抑制NLRP3/GSDMD信号轴减轻海马神经元焦亡的分子机制。
4.2学术论文：拟发表国内外核心/ SCI论文1–2篇。
4.3研究资料：完成规范结题报告、实验原始记录、数据图表集。
4.4科研竞赛：参加全国大学生生命科学竞赛、全国大学生医学创新大赛暨 “一带一路” 国际竞赛等竞赛争取获得佳绩。

第一阶段 2026.06—2026.07
2026.06 前期准备与预实验搭建 文献调研、方案敲定与物资采购
1. 系统检索、精读脑缺血再灌注损伤（CIRI）、HSPA8、神经元焦亡相关中英文文献，梳理研究现状与技术方法；
2. 结合文献完善整体研究方案、技术路线、分组设计及预实验细节，完成方案定稿；
3. 统计试剂、耗材、抗体、试剂盒、质粒等物资清单，完成采购、验收与入库，重点配齐VER-155008、MCC950等特异性抑制剂及WB、qRT-PCR、Co-IP、ELISA配套试剂；
4. 整理实验记录本、分组表格、原始数据记录表。
2026.07 细胞体系建立、仪器调试与预实验摸底
1. 完成各类实验仪器调试与校准，包括细胞培养箱、三气培养箱、Western Blot系统、荧光显微镜、酶标仪，同时调试ImageJ、GraphPad Prism 9.0等数据分析软件；
2. 开展HT22小鼠海马神经元细胞复苏、常规传代，搭建状态稳定、均一的细胞培养体系，留存足量种子细胞备用；
3. 开展基础实验操作训练，熟练掌握细胞种板、换液、蛋白/RNA提取、BCA蛋白定量等核心技能；
4. 熟悉线栓法MCAO/R小鼠造模、mNSS神经功能评分、TTC染色等动物实验操作，为后续体内模型构建做好技术储备。
第二阶段 2026.08—2026.10
2026.08 体内外模型构建与表达相关性初筛 小鼠MCAO/R模型初步构建
1. 依托已完成的GEO数据集分析、KEGG通路富集、STRING蛋白互作网络结果，明确HSPA8与NLRP3的潜在关联及研究方向；
2. 开展C57BL/6J小鼠适应性饲养，强化线栓法操作练习；将实验小鼠分为假手术组、MCAO/R 6h组、MCAO/R 12h组、MCAO/R 24h组，启动批量MCAO/R在体模型构建。
2026.09 体内模型验证+海马组织HSPA8及焦亡蛋白检测
1. 对构建完成的MCAO/R模型进行有效性验证，开展mNSS神经行为学评分与脑组织TTC染色，利用ImageJ软件定量分析脑梗死体积，确认模型稳定性；
2. 分离各组小鼠海马组织并提取总蛋白，通过Western Blot检测不同再灌注时间点HSPA8的蛋白表达水平，完成灰度值定量与数据统计；
3. 同步检测海马组织内NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N等焦亡核心蛋白表达，分析CIRI模型中HSPA8与神经元焦亡的动态变化规律。
2026.10 体外OGD/R模型优化+体内外相关性综合分析
1. 基于HT22细胞设置多梯度氧糖剥夺与复氧时长，结合CCK-8、LDH实验结果筛选最优造模参数，建立稳定的体外神经元焦亡模型；
2. 设立正常对照组与OGD/R模型组，提取细胞RNA与蛋白，采用qRT-PCR、Western Blot技术检测HSPA8及焦亡通路相关分子的表达情况；
3. 运用ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-1β、IL-18的分泌水平，结合前期动物实验数据，综合分析HSPA8与神经元焦亡的表达相关性。
第三阶段 2026.11—2027.04
2026.11 细胞干预体系建立与HSPA8焦亡功能验证 HSPA8过表达质粒转染体系构建与效率验证
1. 准备HSPA8过表达质粒（HSPA8-OE）与空载体对照质粒，摸索脂质体用量、细胞接种密度、转染时长等关键条件；
2. 分别在转染后24h、48h收取细胞样本，通过qRT-PCR与Western Blot检测HSPA8的mRNA及蛋白表达量，确定最优转染方案并验证过表达效率。
2026.12 HSPA8抑制剂VER-155008浓度梯度筛选
1. 设置5μM、10μM、20μM、40μM四个药物浓度梯度，并设立DMSO溶剂对照组，使用VER-155008处理HT22细胞；
2. 通过CCK-8实验评估药物细胞毒性，结合Western Blot检测HSPA8蛋白表达，筛选出毒性低、抑制效果显著的最佳工作浓度。
2027.01 NLRP3抑制剂MCC950浓度梯度筛选
1. 设置1μM、5μM、10μM、20μM MCC950浓度梯度及DMSO对照组，对HT22细胞进行加药处理；
2. 结合CCK-8细胞活力检测、Western Blot分析NLRP3下游蛋白活化水平，确定MCC950最优工作浓度；
3. 整合质粒转染、抑制剂给药两项操作，统一实验干预时序，明确质粒转染提前24h、药物预处理提前1h的操作标准。
2027.02 多组别细胞干预+细胞表型检测
1. 按照预设8组实验方案，依次完成细胞转染、抑制剂预处理及OGD/R造模操作；
2. 开展细胞表型检测，包括CCK-8细胞活力测定、LDH细胞膜损伤检测、光学显微镜形态观察、PI染色统计死亡细胞比例，同步整理全部表型数据。
2027.03 焦亡通路分子表达检测（核酸+蛋白+炎症因子）
1. 收集各组细胞样本，利用qRT-PCR检测Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd、Il-1β、Il-18的mRNA表达水平；
2. 通过Western Blot检测NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N、成熟IL-1β等通路核心蛋白；
3. 采用ELISA法定量检测细胞上清中IL-1β、IL-18含量，完成分子层面数据收集工作。
2027.04 免疫荧光定位检测+功能结果汇总分析
1. 制备细胞爬片并完成免疫荧光染色，观察NLRP3、GSDMD在细胞内的定位及荧光强度变化；
2. 整合表型、核酸、蛋白、炎症因子、免疫荧光所有实验数据，总结HSPA8对OGD/R诱导神经元焦亡的抑制作用及神经保护功能。
第四阶段 2027.05—2027.08
2027.05 分子机制解析与通路回补验证 HSPA8与NLRP3蛋白互作验证（免疫荧光共定位）
1. 制备各组HT22细胞爬片，完成细胞固定、透膜及双标免疫荧光染色；
2. 借助激光共聚焦显微镜成像分析，明确HSPA8与NLRP3在神经元内的分布特征与共定位情况，初步证实二者存在相互作用。
2027.06 免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白结合关系
1. 提取各组细胞总蛋白，采用Co-IP技术特异性富集NLRP3蛋白复合物；
2. 结合Western Blot检测复合物内HSPA8蛋白，证实HSPA8与NLRP3存在直接结合关系。
2027.07 NLRP3泛素化修饰检测（总泛素+K48位点特异性泛素化）
1. 再次利用Co-IP技术富集各组NLRP3蛋白，分别采用总泛素化抗体、K48位点特异性泛素化抗体开展检测；
2. 定量分析NLRP3整体泛素化水平与K48位泛素化修饰程度，阐明HSPA8通过促进NLRP3 K48泛素化降解，进而抑制NLRP3/GSDMD焦亡通路的分子机制。
2027.08 NLRP3通路回补实验设计与表型检测
1. 以HSPA8过表达细胞为研究对象，给予MCC950预处理后构建OGD/R模型，同时设置多组对照样本，开展通路回补实验；
2. 完成CCK-8、LDH、PI染色等表型检测，对比各组细胞损伤程度与焦亡表型差异。
第五阶段 2027.09—2028.06
2027.09-2028.01 数据复核、成果梳理与项目结题 通路回补分子检测+全部实验重复验证
1. 提取回补实验各组细胞蛋白，通过Western Blot检测NLRP3、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N等蛋白表达，反向验证NLRP3是HSPA8调控神经元焦亡的关键下游靶点；
2. 对所有核心功能实验、机制实验开展不少于2次独立重复，剔除异常数据，保障实验结果真实、稳定、可重复。
2028.02 数据统计分析+标准实验图表绘制
1. 使用GraphPad Prism 9.0对所有实验数据进行统计学分析，采用单因素ANOVA结合Tukey多重比较完成组间差异检验，统一全课题制图规范；
2. 完成所有实验统计图、成像图、信号通路模式图的绘制与排版。
2028.03-2028.06 学术论文撰写/项目验收与正式结题
1. 梳理研究逻辑、创新点及核心结论，完成学术论文初稿撰写，并结合研究内容与期刊要求，优化论文框架、文字表述与图表排版，完善文稿;
2. 提交全套结题材料，配合完成项目审核、答辩与验收工作;
3. 完成各项收尾工作，项目正式结题。
1.与本项目有关的研究积累
1.1 成功构建MCAO模型

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图 1 MCAO/R 小鼠神经功能缺损与脑梗死体积的动态变化
注释：A. MCAO/R 造模后小鼠典型神经功能缺损表现；B. 再灌注后 6、12、24 h小鼠神经功能缺损评分（mNSS）；C. 不同时间点小鼠脑梗死TTC染色代表性图片（白色为梗死区，红色为正常组织）；D. 脑梗死体积定量分析。与Sham组比较，P < 0.001。
与Sham组相比，MCAO/R组小鼠在再灌注后6 h、12 h、24 h 均表现出典型的神经功能缺损体征（图 1A），mNSS 评分显著升高（图 1B，*P<0.001），且在 12 h 时缺损程度达到峰值。TTC 染色结果显示，MCAO/R 组小鼠脑梗死灶随再灌注时间逐渐形成并扩大，12 h 时梗死体积达到峰值，24 h 时略有回落（图 1C、D），且各时间点梗死体积均显著高于 Sham 组（图 1D，*P<0.001）。上述结果表明，本研究成功构建了小鼠 MCAO/R 模型，且脑缺血再灌注损伤可导致小鼠神经功能缺损及脑梗死形成，为后续体内实验奠定了可靠模型基础。

1.2 HSPA8 在 CIRI 后呈脑区特异性上调
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图 2 脑缺血再灌注损伤后小鼠海马区 HSPA8 蛋白的动态表达变化
注释：左图Western Blot 检测各组小鼠海马组织中 HSPA8 蛋白表达的代表性条带；右图HSPA8 蛋白表达水平定量分析。与 Sham 组比较，**P<0.01，***P<0.001，*P<0.05。
Western Blot 结果显示，与 Sham 组相比，MCAO/R 组小鼠海马组织中 HSPA8 蛋白表达水平在再灌注后 6 h、12 h、24 h 均显著上调（图 2左图）。定量统计分析表明，6 h 时 HSPA8 表达即显著升高（**P<0.01），12 h 时上调幅度达到峰值（***P<0.001），24 h 虽略有回落但仍显著高于 Sham 组（*P<0.05），提示海马区域 HSPA8 对脑缺血再灌注损伤（CIRI）响应敏感且呈动态变化，可能通过调控海马神经细胞焦亡参与脑损伤进程（图 2右图）。
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图 3 脑缺血再灌注损伤后小鼠皮层区 HSPA8 蛋白的动态表达变化
注释：左图：Western Blot 检测 Sham 组与 MCAO/R 组小鼠再灌注后 6 h、12 h、24 h 皮层组织中 HSPA8 蛋白表达的代表性条带（β-actin 为内参）；右图：对应左图的 HSPA8 蛋白表达水平定量分析（以 HSPA8/β-actin 相对比值表示）。与 Sham 组比较，*P<0.05。
在皮层组织中，MCAO/R 组 HSPA8 蛋白表达同样呈现上调趋势（图 3左图）。定量统计分析显示，再灌注后 6 h 和 24 h 时，MCAO/R 组 HSPA8 表达水平均显著高于 Sham 组（图 3右图，*P<0.05），而 12 h 时两组表达水平无显著差异，提示皮层区域 HSPA8 对脑缺血再灌注损伤（CIRI）的响应模式与海马区域存在差异，进一步验证 HSPA8 主要在海马神经细胞中发挥焦亡调控作用

1.3 生物信息学互作分析
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图 4 蛋白互作（PPI）网络及通路富集分析
注释：a图：HSPA8与NLRP3炎症小体通路关键分子的互作网络预测；b图：HSPA8互作蛋白的功能富集分析（GO/KEGG通路）。
  前期通过生物信息学分析，对HSPA8在脑缺血再灌注损伤（CIRI）中潜在的调控网络进行了系统性预测。首先，基于STRING数据库构建的蛋白-蛋白互作（PPI）网络结果显示，HSPA8与NLRP3炎症小体通路的关键分子（包括NLRP3、NEK7、CARD8及NLRP家族成员NLRP4/6/9/12等）存在直接或间接的相互作用，其中 HSPA8与NEK7的互作关系尤为关键，提示二者可能共同参与NLRP3炎症小体的组装与活化过程。
  在此基础上，对网络中的核心分子进行功能富集分析发现，这些分子显著富集于NOD样受体信号通路（KEGG: hsa04621）、核苷酸结合寡聚化结构域NOD通路（WP1433）及先天免疫反应调控（GO:0045088）等生物学过程，其中NOD样受体信号通路的富集程度最高，与本研究关注的NLRP3炎症小体介导的焦亡通路密切相关。
上述结果验证了HSPA8及其互作分子在先天免疫与炎症反应中的核心作用， 提供了充分的前期数据支撑与明确的研究靶点。

1.4 作用机制假说
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图 5 HSPA8通过NLRP3/GSDMD介导的神经元焦亡的机制假说图
  基于本项目实验设计的机制假说：HSPA8通过NLRP3/GSDMD信号轴介导的神经元焦亡与神经炎症，减轻脑缺血再灌注损伤。

1.5 结果总结分析
  本研究首先开展动物体内验证实验，成功构建小鼠MCAO/R脑缺血再灌注损伤模型。造模后小鼠神经功能缺损评分显著升高，脑梗死体积明显增大，模型稳定可靠；Western Blot 检测结果显示，缺血再灌注后小鼠海马区HSPA8蛋白表达随再灌注时间显著上调，于2小时达到峰值，24小时仍维持较高水平，而皮层区HSPA8表达仅轻度上调，提示HSPA8在海马组织中对脑缺血再灌注损伤响应更敏感、表达变化更显著，初步证实HSPA8是脑缺血再灌注损伤中的关键内源性响应分子，可能通过调控海马神经细胞焦亡参与神经保护过程。
基于上述动物实验线索，我们进一步开展生物信息学分析，从基因表达、分子互作及通路富集等层面分析发现，HSPA8与NLRP3等焦亡通路关键分子存在潜在互作关系，提示HSPA8具备成为调控脑缺血再灌注损伤焦亡进程核心靶分子的潜力。
综合动物实验与生物信息学分析数据可初步判定，HSPA8是脑缺血再灌注损伤中的关键内源性响应分子，推测其可通过调控海马神经细胞焦亡介导神经保护效应。上述前期工作，为项目后续深入开展机制研究提供了坚实的科学依据与实验支撑。
1.已具备的条件
1.1 技术支撑与人员基础
  项目组成员已系统完成细胞生物学、分子生物学等相关课程的学习，具备较为扎实的专业理论基础与严谨的科研素养。成员能够熟练掌握小鼠MCAO/R模型构建、细胞培养、qRT‑PCR、Western Blot、免疫共沉淀、TTC染色等常用实验技术，且已有合作成员完成并投稿相关领域综述论文，并且部分成员有丰富参赛经验在全国大学生医学创新大赛暨 “一带一路” 国际竞赛中斩获国家级铜奖。项目成员具备独立开展课题设计、实验操作、数据分析及学术写作的能力，可高效协作保障项目顺利推进。成员熟练掌握文献检索与管理技能，能够及时追踪领域前沿进展，认真细致、分工明确，为课题实施与成果凝练提供有力支撑。
指导教师长期致力于脑缺血再灌注损伤与神经细胞死亡调控方向的研究，具有丰富的科研积累与实践经验，主持及参与多项相关领域课题。以第一作者及通讯作者发表SCI论文9篇，其中第一作者SCI论文3篇，国际会议论文1篇，拥有扎实的理论功底与规范的科研素养，能够在实验设计、技术操作、数据分析及论文撰写等方面给予全面、细致的指导，为项目稳步推进提供可靠保障。
1.2 前期研究基础
课题组已成功构建小鼠MCAO/R模型及HT22细胞OGD/R体外模型，完成 HSPA8 表达变化检测，获得可靠前期数据，确立了本研究的可行性与科学性。本研究基于成熟稳定的OGD/R模型，结合qRT‑PCR、Western Blot等团队已熟练掌握的核心分子生物学技术，实验设计严谨规范、周期可控、重复性良好。若取得突破，将为脑缺血再灌注损伤提供新的神经保护靶点，具有重要的理论与临床转化价值。
1.3 实验平台与仪器设备
本项目在山东省济宁医学院公共科研平台开展，实验室拥有SPF级动物房、细胞培养室、分子生物学实验平台等功能区域，配备细胞培养箱、缺氧培养箱、荧光显微镜、实时荧光定量PCR仪、蛋白电泳及转印系统、酶标仪、高速离心机等全套设备，仪器运行稳定，可满足本项目动物实验、细胞实验与分子生物学实验需求。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 13300.00 6700.00
1. 业务费 3500.00 无 2000.00 1500.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3500.00 论文出版 2000.00 1500.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 16500.00 购置细胞培养试剂、分子生物学试剂盒、实验耗材等，支撑体内外实验开展。1.HT22 细胞、C57BL/6J 小鼠、饲料 2.qPCR / 反转录试剂、WB 抗体（HSPA8、NLRP3、Caspase-1、GSDMD 等）、转染试剂、抑制剂（VER155008、MCC950）、Co-IP 及泛素化检测相关试剂、ELISA 试剂盒 3.细胞培养耗材（培养皿、离心管、枪头）、WB 耗材 11300.00 5200.00
结束

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