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HIP1R与Cortactin调控F-actin动态平衡在神经元发育中的作用机制研究

申报人：魏怡欣 申报日期：2026-03-09

基本情况

2026创新项目
HIP1R与Cortactin调控F-actin动态平衡在神经元发育中的作用机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
F-actin动态重塑是神经元形态建成、突触形成及可塑性维持的核心细胞学基础。亨廷顿蛋白互作蛋白1相关蛋白（HIP1R）作为一类具有肌动蛋白结合能力的调控因子，近年研究发现其在神经系统发育与突触稳态维持中发挥关键作用。已有研究表明，HIP1R可通过与Cortactin相互作用限制局部肌动蛋白聚合，从而维持F-actin的正常空间分布，但二者互作对神经元形态与功能的具体影响及深层分子机制尚不明确。为此，本项目以原代海马神经元等细胞为模型，综合运用免疫共沉淀、免疫荧光染色、膜片钳及FRAP光漂白恢复等实验技术，旨在系统阐明HIP1R与Cortactin相互作用对F-actin动态平衡的调控作用，明确HIP1R缺失或其与Cortactin互作受损对神经元形态建成及突触功能的影响，并进一步揭示HIP1R与Cortactin通过调控F-actin影响突触功能的分子路径。 本项目不仅有助于深化对神经元细胞骨架精细调控机制的理解，为神经发育障碍（如自闭症、智力障碍）和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中突触结构与功能异常提供潜在分子靶点，也具有重要的基础研究价值与临床转化潜力。
1.负责人从大一开始进入课题组跟随老师学习
2.参与导师的自然科学基金面上项目，学会了相关动物实验、WB、CO-IP、免疫荧光染色、膜片钳等实验操作技术
3.参加2025年大创省级项目立项
4.参加第十一届医学实验创新大赛获得省级二等奖
正在开展HIP1R相关蛋白在神经系统内功能的研究，具备丰富的相关背景知识
1.主持国家自然科学基金青年项目，围绕HIP1R在阿尔茨海默病突触功能损害所致认知障碍中的作用及机制开展研究，已顺利结题。
2.主持山东省自然科学基金青年项目，进一步探索HIP1R在阿尔茨海默病认知功能障碍中的功能，已圆满完成。
3.主持山东省自然科学基金面上项目，聚焦HIP1R调控EGFR内吞在神经元发育及功能中的机制，目前正在稳步推进中。
4.担任山东省高等学校青创团队“突触发育及神经环路形成机制研究创新团队”带头人，负责团队整体规划与组织实施，项目在研中。
以上课题为本项目的顺利实施提供了坚实的前期研究基础与经费保障。
指导教师在实验技术、经费以及精神上都能够充分的支持本项目可以顺利完成。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
魏怡欣 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 质粒构建、检测分析神经元形态功能、分子机制检验、数据分析
邵国宸 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 分子机制检验、数据分析
常伟丽 精神卫生学院 精神医学（本科） 2025 膜片钳检测、HIP1R与Cortactin的相互作用检测
刘文秀 精神卫生学院 精神医学（本科） 2025 细胞神经元培养、挽救实验
刘铠颉 精神卫生学院 精神医学（本科） 2025 HIP1R与Cortactin的相互作用检测、Cofilin定位

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
彭琳 精神卫生学院 否

立项依据

1.探索HIP1R与Cortactin相互作用对F-actin区域化分布及动态平衡的调控作用；
2.明确HIP1R缺失或其与Cortactin相互作用受损对神经元形态发育及突触传递功能的影响；
3.阐明HIP1R-Cortactin复合体通过调控Cortactin-Arp2/3通路活性影响F-actin聚合状态，进而调节突触后AMPA受体运输及突触功能的分子机制。
1.检测HIP1R与Cortactin相互作用对F-actin动态平衡的调控作用
（1）验证HIP1R与Cortactin的相互作用，寻找关键作用区域。
  用体外培养的海马神经元和相关细胞系（SH-SY5Y）进行蛋白提取。使用针对HIP1R和Cortactin的抗体进行免疫共沉淀。对共沉淀的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析，使用Cortactin和HIP1R特异性抗体进行检测。结果通过对比实验组和对照组的免疫共沉淀水平，确定两者是否存在内源性相互作用。在HEK293细胞中，转染表达HIP1R和Cortactin的绿色荧光标签（例如GFP-HIP1R）和红色荧光标签（例如mCherry-Cortactin），进行体外的免疫共沉淀实验，验证其相互作用；同时，使用免疫荧光染色，用抗体标记细胞中的两种蛋白，通过共聚焦显微镜观察，分析HIP1R和Cortactin是否在细胞内共定位，进一步验证两者的相互作用。参考文献分析其相互作用关键区域，并构建相关质粒验证。
（2）研究其相互作用对F-actin聚合的调控影响。
  构建HIP1R-shRNA及HIP1R 1018-1068过表达质粒，在SY5Y或HEK293细胞中转染相关质粒，使用流式细胞术（FACS）或荧光染料（如F-actin染色剂）进行F-actin的动态监测。通过激光共聚焦显微镜追踪F-actin的动态变化，观察F-actin聚合和解聚的过程。定量分析在不同实验组中F-actin的变化，确定HIP1R与Cortactin相互作用对F-actin动态平衡的具体调控机制。
  进一步构建HIP1R敲减慢病毒及干扰多肽，在培养的海马神经元中感染病毒敲减HIP1R或感染HIP1R与Cortactin相互作用，对海马神经元进行Phalloidin染色，用于标记F-actin。通过荧光显微镜观察F-actin在细胞胞体、树突及突触区的分布。比较在HIP1R敲减组、干扰相互作用组与对照组中，F-actin的分布和聚合状态。
2.分析HIP1R敲低或干扰其与Cortactin相互作用对神经元形态及功能的影响
（1）观察敲减HIP1R后神经元发育形态及功能的变化。
  培养海马神经元，通过shRNA敲减HIP1R，对细胞进行免疫荧光染色，使用抗MAP2抗体标记树突。使用图像分析软件（如ImageJ）分析树突长度、分支数量和树突棘密度。使用细胞形态学分析工具（如NeuroJ、NeuronStudio）进行自动化的树突分支分析。量化树突长度、分支复杂度及树突棘密度，系统评估神经元形态学的变化。统计并比较实验组与对照组在树突发育中的差异，评估HIP1R表达减少对神经元形态的影响。采用膜片钳技术（Patch-clamp）记录神经元的兴奋性微小突触后电流（mEPSC）、抑制性微小突触后电流（mIPSC）来评估神经元的突触传递功能，比较HIP1R敲减组与对照组突触传递功能的差异。
（2）检测干扰HIP1R与Cortactin相互作用后神经元形态及功能的变化。
  培养海马神经元，使用多肽干扰Cortactin与HIP1R的相互作用，对细胞进行免疫荧光染色，使用抗MAP2抗体标记树突。统计并比较实验组与对照组在树突发育中的差异。采用膜片钳技术（Patch-clamp）记录神经元的兴奋性、抑制性微小突触后电流（mEPSC、mIPSC）来评估神经元的突触传递功能，评估HIP1R与Cortactin的相互作用对神经元形态及突触传递功能的影响。
3.HIP1R-Cortactin调控F-actin动态平衡影响神经元突触形态及功能的机制研究
（1）检测HIP1R缺失对F-actin动态周转率的影响。
  为证实HIP1R缺失导致F-actin处于“聚合易、解聚难”的失衡状态，采用光漂白恢复（FRAP）活细胞成像技术。在海马神经元中转染GFP-actin，对树突棘区域进行光漂白后记录荧光恢复曲线，若HIP1R敲减组的恢复半衰期显著延长且平台期降低，则证明F-actin解聚速度减慢、动态更新能力下降。同时，使用低浓度解聚药物Latrunculin A处理神经元进行F-actin稳定性压力测试，正常组F-actin丝状结构迅速消失，而HIP1R敲减组胞体及树突内的F-actin堆积块对药物表现出更强的耐受性，进一步证实F-actin处于“僵化”状态。
（2）探索HIP1R调控Cortactin-Arp2/3通路的关键分子机制。
  通过免疫共沉淀检测Cortactin与Arp2/3的结合强度，若HIP1R敲减组中Cortactin与Arp3的共沉淀量显著增加，则说明HIP1R缺失解除了对Cortactin-Arp2/3结合的抑制。其次，通过Western blot检测Arp2、Arp3、p34-Arc等亚基的蛋白表达水平，排除因亚基上调导致的F-actin聚合增加。此外，检测Cortactin的空间分布变化，利用免疫荧光观察HIP1R敲减后Cortactin的亚细胞分布变化，验证其是否从树突棘“泄漏”至胞体并与F-actin聚集块共定位，从而证实HIP1R作为Cortactin“空间锚定器”的作用，统计Cortactin在胞体异常聚集的细胞比例，与树突长度、分支数做相关性分析。
（3）验证“Cortactin过度激活”导致突触功能受损的因果关系
  采用遗传学和药理学两种策略抑制Cortactin-Arp2/3通路活性，观察能否挽救HIP1R敲减导致的表型。遗传学方案：在HIP1R敲减神经元中共转显性负性Cortactin突变体（如Cortactin-W525K，SH3结构域突变，无法与Arp2/3有效协同）或Arp2/3亚基的显性负性突变体；药理学方案：使用低剂量Arp2/3特异性抑制剂（如CK-666）处理HIP1R敲减神经元，部分抑制F-actin分支成核。通过膜片钳记录微小突触后电流及树突棘形态扫描评估挽救效果，突触电位频率恢复且胞体F-actin聚集减少，则证明“Cortactin过度激活”是突触功能受损的真实病因。
      HIP1R（Huntingtin-interacting protein 1-related protein）属于一种重要的内吞相关蛋白，它具有多个功能结构域，这些结构域决定了其在细胞内的多种功能。具体而言，HIP1R的结构域包括N末端的ENTH结构域、中间的coiled-coil结构域，以及C末端的Talin-like结构域[1]。Talin-like结构域位于HIP1R的C末端，具有与F-actin结合的能力，并被认为是连接肌动蛋白骨架与细胞膜之间的重要桥梁。研究表明，Talin-like结构域对F-actin的结合是调控细胞骨架重塑的关键[2]。Coiled-coil结构域位于HIP1R的中间部分，该结构域能够与网格蛋白的轻链结合，这一相互作用对于网格蛋白装配以及内吞小窝的形成至关重要[3]。HIP1R在细胞内的主要功能之一是调控肌动蛋白的动态变化，通过与F-actin的相互作用，HIP1R能够影响肌动蛋白在内吞小窝处的聚合与解聚过程，进而影响细胞的内吞作用。研究表明，HIP1R通过与Cortactin和Arp2/3复合体的相互作用调控肌动蛋白网络的形成[4]。
  在哺乳动物中，HIP1R不仅参与内吞作用，还参与许多细胞过程，如细胞形态变化和膜的稳定性等[5,6]。尽管HIP1R在细胞内具有重要的功能，但其缺失并不总是导致明显的表型。研究表明，HIP1R基因敲除小鼠并未表现出明显的发育缺陷或内吞功能异常。然而，利用RNA干扰技术降低HIP1R的表达时，细胞内却出现了明显的肌动蛋白异常聚集，表明HIP1R在肌动蛋白调控中的作用不可忽视。在与Sla2p的功能相似性上，HIP1R缺失导致的表型与Sla2p缺失时相似，细胞形态发生显著变化，肌动蛋白在内吞小窝及其他位置聚集[7]。这些研究结果表明，HIP1R在内吞和细胞形态重塑过程中发挥着重要作用，尤其是对肌动蛋白聚合的调控。同时还有研究表明，HIP1R在神经系统中也发挥作用树突发育以及兴奋性突触的形成和功能中起着重要作用。
      Cortactin是一种主要的F-肌动蛋白（F-actin）结合蛋白，在细胞的形态变化、迁移、内吞以及细胞分裂过程中起着关键作用。Cortactin由多个功能结构域组成，其中最为关键的是其N端的F-actin结合结构域以及C端的SH3（Src同源3）结构域。F-actin结合结构域赋予了Cortactin直接与F-肌动蛋白相互作用的能力，而SH3结构域则使其能够与其他蛋白质相互作用，参与信号传导和蛋白复合体的形成[8]，Cortactin在F-actin的聚合和分支过程中起着重要作用，通过与Arp2/3复合体结合，Cortactin能够促进F-actin的分支生长，从而加速肌动蛋白网络的形成[4]。此外，Cortactin在内吞作用中也具有重要功能，内吞过程依赖于细胞膜的局部弯曲和肌动蛋白的动力学变化，Cortactin通过促进F-actin的聚合来参与内吞小窝的形成[9]。
  神经元形态建成是一个动态过程，F-actin作为细胞骨架的核心组成部分，在神经元形态塑造、轴突和树突的延伸以及突触的形成和塑性中发挥着关键作用。神经元高度极化的形态和功能高度依赖于F-actin的动态重塑。这种动态平衡并非简单的聚合与解聚，而是在特定时空受到精密调控的“区域性”过程——F-actin需要在生长锥、树突棘等亚细胞结构中高度聚合以驱动形态变化与信号传递，同时在神经元胞体等区域维持相对稳定，HIP1R与Cortactin作为两个关键的肌动蛋白调控因子，它们之间的直接相互作用构成了实现这种区域化动态平衡的核心分子开关。
  HIP1R与Cortactin的相互作用具有明确的分子特异性。HIP1R的C末端含有一个富含脯氨酸（Proline-rich）的结构域，该结构域可作为典型的SH3结构域配体。而Cortactin的C端则包含一个保守的SH3结构域。生物化学与蛋白质相互作用研究证实，正是HIP1R的脯氨酸富集区与Cortactin的SH3结构域实现了直接且特异的结合[8]。HIP1R通过其N端的ENTH结构域锚定于富含特定磷脂酰肌醇（如PIP2）的细胞膜区域（如内吞小窝或特定膜微域），同时通过其C端的Talin-like结构域结合F-actin。而Cortactin则通过其N端F-actin结合结构域与肌动蛋白丝结合，并通过其中间的重复序列激活Arp2/3复合体，促进F-actin分支化网络的形成。因此HIP1R-Cortactin复合物在物理上桥接了细胞膜、既有的F-actin骨架以及负责新生F-actin分支的Arp2/3复合体[10,11,12]。
  有研究表明，HIP1R与Cortactin的结合，可能竞争性地阻碍了Cortactin的SH3结构域与其他促肌动蛋白聚合蛋白（如N-WASP、Dynamin）的结合，从而改变了Cortactin参与的蛋白质互作网络，将信号流向从“促进聚合”转向“受控聚合”[13,14]。还有研究表明，游离或错误定位的Cortactin在神经元胞体等区域异常激活Arp2/3复合体，引发F-actin的异位、过度聚合与堆积。这种异常的骨架重组不仅消耗了肌动蛋白单体库，还可能破坏胞体的细胞器定位、运输通道和机械稳定性，最终反馈性影响神经元的整体健康和突触功能[11,15]。
总之，HIP1R和Cortactin之间的相互作用不仅在维持F-actin动态平衡方面起着至关重要的作用，也直接影响神经元的形态建成和突触功能。研究这一相互作用的机制有助于深入理解神经发育过程中的细胞骨架调控，并为相关神经退行性疾病或神经发育障碍的治疗提供潜在的靶点。
  我们在培养的海马神经元中通过shRNA干扰HIP1R表达，观察到神经元树突复杂性降低，树突棘密度降低，突触功能异常[16]。我们的研究结果表明HIP1R的缺失或其与Cortactin相互作用的受损会对F-actin的聚合和解聚产生显著影响。缺乏HIP1R的神经元在细胞胞体区域会出现F-actin异常聚集的现象，而树突及突触区域F-actin分布明显减少。
  基于上述结果，我们提出如下核心机制假说：在正常神经元中，HIP1R通过与Cortactin形成具有特定时空定位的功能复合体，作为"空间锚定与导向模块"，精密调控F-actin的动态聚合与分布。该复合体将Cortactin的促肌动蛋白分支活性精准限制于树突棘、生长锥等突触功能区，驱动局部骨架重塑以支持神经元的形态发育与突触可塑性，同时有效隔离Cortactin在胞体区域的活性，防止F-actin的异位聚合。当HIP1R缺失或其与Cortactin的特异性结合受损时，这一空间约束机制被破坏，导致Cortactin的空间定位紊乱：一方面，树突及突触功能区因缺乏有效的Cortactin活性而出现F-actin聚合不足，表现为树突复杂性降低、树突棘密度减少及突触功能异常；另一方面，游离的Cortactin在胞体区异常激活Arp2/3复合体[17]，引发F-actin的失控性聚合与异常堆积，形成从功能区"泄漏"至胞体区的病理现象。这种F-actin区域化分布的失衡，直接破坏了神经元的结构稳态与功能完整性。
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2.Ren Y, Yang J, Fujita B, Zhang Y, Berro J. Cross-regulations of two connected domains form a mechanical circuit for steady force transmission during clathrin-mediated endocytosis. Cell Rep. 2024;43(9):114725. Published 2024 Sep 14. doi:10.1016/j.celrep.2024.114725
3.Jin M, Shirazinejad C, Wang B, et al. Branched actin networks are organized for asymmetric force production during clathrin-mediated endocytosis in mammalian cells. Nat Commun. 2022;13(1):3578. Published 2022 Jun 22. doi:10.1038/s41467-022-31207-5
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13.Hu HT, Huang TN, Hsueh YP. KLHL17/Actinfilin, a brain-specific gene associated with infantile spasms and autism, regulates dendritic spine enlargement. J Biomed Sci. 2020;27(1):103. Published 2020 Dec 1. doi:10.1186/s12929-020-00696-1
14.Zhu S, Xu H, Chen R, et al. DNA methylation and miR-92a-3p-mediated repression of HIP1R promotes pancreatic cancer progression by activating the PI3K/AKT pathway. J Cell Mol Med. 2023;27(6):788-802. Published 2023 Feb 14. doi:10.1111/jcmm.17612
15.Enshoji M, Miyano Y, Yoshida N, et al. Eps15/Pan1p is a master regulator of the late stages of the endocytic pathway. J Cell Biol. 2022;221(10):e202112138. Published 2022 Sep 12. doi:10.1083/jcb.202112138
16.Peng L, Yang Q, Xu X, et al. Huntingtin-interacting protein 1-related protein plays a critical role in dendritic development and excitatory synapse formation in hippocampal neurons. Front Mol Neurosci. 2017;10:186. Published 2017 Jun 15. doi:10.3389/fnmol.2017.00186
17.Liu T, Cao L, Mladenov M, Jegou A, Way M, Moores CA. Cortactin stabilizes actin branches by bridging activated Arp2/3 to its nucleated actin filament. Nat Struct Mol Biol. 2024;31(5):801-809. Published 2024 Feb 5. doi:10.1038/s41594-023-01205-2
1.研究视角新颖：本研究系统探讨了HIP1R与Cortactin的相互作用调控F-actin动态平衡在神经元中作用及机制；
2.机制解析深入：联合FRAP活细胞成像与药物压力测试，从动态周转率角度揭示HIP1R缺失导致F-actin“聚合易、解聚难”的僵化失衡状态，并明确Cortactin-Arp2/3通路过度激活为其分子基础；
3.潜在治疗靶点：研究结果为神经发育障碍（如自闭症、智力障碍）和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）提供了潜在的分子靶点。
1.技术路线
第一阶段：HIP1R与Cortactin相互作用及其对F-actin动态平衡的调控。
  首先在SH-SY5Y细胞、HEK293细胞及原代海马神经元中，通过免疫共沉淀、免疫荧光共定位及质粒构建，验证HIP1R与Cortactin的内源及外源相互作用，并确定关键结构域。在此基础上，构建HIP1R-shRNA敲减质粒、HIP1R（1018-1068）过表达质粒以及干扰二者结合的多肽。利用流式细胞术、Phalloidin染色及共聚焦显微镜，在细胞系和海马神经元中分别检测F-actin的聚合动态及其在胞体、树突、突触区的亚细胞分布变化。
第二阶段：HIP1R敲低或干扰其与Cortactin互作对神经元形态及突触功能的影响。
  在海马神经元中通过慢病毒介导的HIP1R-shRNA敲减或加入干扰多肽，采用MAP2免疫荧光染色结合图像分析软件，系统评估树突长度、分支复杂度及树突棘密度；同时利用膜片钳技术记录微小兴奋性/抑制性突触后电流（mEPSC/mIPSC），评估突触传递功能。此外，通过免疫荧光观察Cortactin在胞体与树突棘的分布差异，统计胞体异常聚集比例并与树突发育指标进行相关性分析。
第三阶段：HIP1R-Cortactin-Arp2/3通路调控突触功能的分子机制。
  首先通过FRAP光漂白恢复实验和Latrunculin A压力测试，证实HIP1R缺失导致F-actin解聚减慢、网络僵化。其次，利用免疫共沉淀检测Cortactin与Arp2/3（Arp3）的结合强度，Western blot检测Arp2/3亚基表达，免疫荧光观察Cortactin是否从树突棘“泄漏”至胞体，明确HIP1R作为“空间锚定器”的作用。最后，采用显性负性Cortactin突变体（Cortactin-W525K）或Arp2/3抑制剂CK-666进行挽救实验，通过膜片钳及树突棘形态学评估，验证Cortactin过度激活Arp2/3是突触功能受损的真实病因，完整揭示“HIP1R缺失→Cortactin过度激活Arp2/3→F-actin过度聚合/僵化→突触后受体被困→突触功能受损”的因果链条。

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2.拟解决问题
（1）HIP1R与Cortactin的相互作用调控F-actin在神经元胞体、树突及突触区的区域化分布
（2）HIP1R缺失或其与Cortactin互作受损导致的F-actin解聚障碍是树突发育异常和突触功能损伤的关键原因
（3）F-actin动态失衡通过分子路径（如Cofilin失活、AMPA受体运输受阻）最终损害突触传递功能
3.预期成果
（1）阐明HIP1R-Cortactin复合体调控F-actin区域化动态解聚的新机制，证实其解聚障碍是导致树突发育异常和突触功能损伤的关键上游事件。
（2）揭示F-actin“僵化”通过Cortactin-Arp2/3通路过度激活及AMPA受体侧向扩散受阻损害突触传递的完整信号通路，为突触功能异常相关的神经精神疾病供潜在干预新靶点。
（3）通过组会汇报和分工协作，提升团队成员的科研表达能力和团队合作精神。
1.第一阶段：实验准备与HIP1R-Cortactin互作验证（已完成）
  完成文献调研与实验方案细化，采购所需抗体、质粒、慢病毒及多肽等试剂，建立原代海马神经元、SH-SY5Y及HEK293细胞培养体系。通过免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光共定位，验证HIP1R与Cortactin的内源及外源相互作用，并构建相关截短质粒确定关键结合区域。
2.第二阶段：F-actin聚合调控及分布检测（2026年6月-2026年12月）
  构建HIP1R-shRNA敲减质粒、HIP1R（1018-1068）过表达质粒以及干扰互作的多肽，在细胞系中转染后利用流式细胞术和Phalloidin染色检测F-actin聚合水平。在原代海马神经元中通过慢病毒感染敲减HIP1R或加入干扰多肽，采用Phalloidin染色结合共聚焦显微镜，观察F-actin在胞体、树突及突触区的分布变化。
3.第三阶段：神经元形态与突触功能评估（2027年1月-2027年6月）
  对HIP1R敲减或互作干扰后的海马神经元进行MAP2免疫荧光染色，利用ImageJ等软件分析树突长度、分支复杂度及树突棘密度。同时采用膜片钳技术记录微小兴奋性/抑制性突触后电流（mEPSC/mIPSC），评估突触传递功能。此外，通过免疫荧光检测Cortactin在胞体与树突棘的亚细胞分布，统计其异常聚集比例并与树突发育指标做相关性分析。
4.第四阶段：动态机制与分子通路研究（2027年6月-2027年12月）
  利用FRAP光漂白恢复实验检测GFP-actin转染神经元中树突棘区域F-actin的周转率（半衰期），结合Latrunculin A压力测试验证F-actin“僵化”状态。通过Co-IP检测Cortactin与Arp3的结合强度，Western blot检测Arp2/3亚基（Arp2、Arp3、p34-Arc）表达水平，免疫荧光观察HIP1R敲减后Cortactin是否从树突棘“泄漏”至胞体，阐明HIP1R作为Cortactin“空间锚定器”的分子机制。在HIP1R敲减神经元中采用显性负性Cortactin突变体（Cortactin-W525K）或Arp2/3抑制剂CK-666进行挽救干预，通过膜片钳及树突棘形态学评估功能恢复情况，验证Cortactin过度激活Arp2/3是突触功能受损的真实病因。
5.第五阶段：数据整理与成果撰写（2027年12月-2028年3月）
  整理全部实验数据，完成统计分析及图表绘制，整理课题材料进行总结，完成结果分析，撰写论文初稿，准备结题材料及专利申请。
在本项目之前的研究中，我们在培养的海马神经元中通过shRNA干扰HIP1R表达，观察到跟对照组相比，敲减HIP1R后神经元树突复杂性降低（图1），树突棘密度降低（图2），且神经元的胞体内会形成F-actin异常聚集（图3）。这些结果都符合我们的实验假设，为课题的进一步深入研究提供了坚实的基础。summernote-img
图1. 敲减HIP1R后培养的海马神经元树突发育受到抑制。（A）DIV6培养的海马神经元分别转染GFP-shRNA和GFP-scramble shRNA的质粒，DIV12时用MAP2的抗体做免疫荧光染色标记树突，绿色GFP表示质粒转染成功，红色代表MAP2，蓝色染的是DAPI，Scale bar, 10 μm。（B）用Sholl analysis的方法对树突分支的复杂性进行分析，结果显示KD组的树突分支复杂性明显比Ctl组低。（C,D）是对树突总长度和数目进行统计分析，统计结果显示相比于CTL组，KD组的树突总长度有显著性降低。n＞40；#p＜0.0001。summernote-img
图2. 降低HIP1R表达后培养的海马神经元树突棘密度减少。（A）DIV6培养的海马神经元分别转染GFP-shRNA-3和GFP-scramble shRNA-3的质粒，DIV18-21用GFP的抗体做免疫荧光染色，有GFP表达的神经元代表质粒转染成功。Scale bar, 10 μm。（B）用Imaris对神经元的树突棘数目进行分析。树突棘密度代表每微米树突上树突棘的个数。结果显示KD组的树突棘密度明显比CTL组低。n＞40； #p＜0.0001。summernote-img
图3. 在培养的海马神经元中HIP1R影响肌动蛋白聚合。（A）在培养的海马神经元细胞DIV6时将GFP-shRNA的质粒转染入细胞内，另外转染GFP-scramble shRNA作为阳性对照，在DIV14时进行免疫荧光染色，GFP（绿色）代表质粒转染成功，用Phalloidin（红色）来标记F-肌动蛋白的结构，在敲减了HIP1R的神经元胞体中可见明显的F-肌动蛋白异常聚集。Scale bar, 10 μm。
（1）已具备的条件：
  项目成员：主要为济宁医学院本科学生，接受过相关理论知识和实验操作的学习，能够通过查阅相关资料,深入地了解课题，具备数据整合、分析、处理的能力。学习态度端正，做实验认真，能够坚持集体主义为原则，负责人能够合理地分配任务。
  指导老师：已经做过大量HIP1R相关的研究，掌握相关的背景知识。实验导师自博士期间开始抑制从事HIP1R研究，具备丰富的相关背景知识，主持国家自然科学基金青年基金、山东省博士基金、面上基金等多项科研项目，作为山东省高校青创团队带头人，发表多篇高水平论文，实践与理论经验丰富。
项目依托单位配备完善的分子生物学实验室、细胞培养室等实验室，基础设施完善，足以保证实验顺利进行。
（2）尚缺少的条件及解决方法
  无

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 本项目的实施 12000.00 8000.00
1. 业务费 8000.00 检测和论文出版 2000.00 6000.00
（1）计算、分析、测试费 3000.00 无 0.00 3000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 2000.00 无 2000.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 无 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 12000.00 购买试剂耗材 10000.00 2000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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