靶向PGLYRP1调控CD8+T细胞活化在再生障碍性贫血发生和治疗中的机制研究

申报人：马佳慧申报日期：2026-02-24

基本情况

所属批次:

2026创新项目

项目名称:

靶向PGLYRP1调控CD8+T细胞活化在再生障碍性贫血发生和治疗中的机制研究学生申报

项目类型:

创新训练项目

所属学科门类:

医学

所属专业类:

基础医学类

项目来源名称:

学生来源于教师科研项目选题

项目归属学院:

项目期限:

二年期

项目简介:

再生障碍性贫血（Aplastic anemia,AA）是一种由免疫异常介导的骨髓衰竭性疾病，现有免疫抑制治疗常面临复发与耐药等挑战，亟须更具靶向性的干预策略。本研究基于EGFP荧光示踪AA小鼠模型，结合单细胞转录组测序，确认CD8+T细胞的异常活化是AA发病中的核心病理事件。本项目将探究肽聚糖识别蛋白1（Peptidoglycan Recognition Protein 1，PGLYRP1，亦称Tag7）是否为调控AA中CD8+T细胞异常活化的关键靶基因，并评估其特异性抑制剂在动物模型中逆转AA进展的疗效。本研究有望为克服当前免疫抑制治疗耐药提供新靶点，推动AA迈向精准治疗新时代。

负责人曾经参与科研的情况:

本项目负责人参与了指导老师青年科学基金《靶向LGALS1/LGALS3协同调控CD8⁺T细胞活化在再生障碍性贫血发生和治疗中的机制研究》的研究，参与此项目中动物实验、细胞培养与分子层面相关的实验等，目前已经熟练掌握了多种实验技术，并对再生障碍性贫血，CD8⁺T细胞，PGLYRP1有了一定程度的了解，为本课题的实验材料准备、实验开展与数据分析及整理等打下坚实基础。

指导教师承担科研课题情况:

(1)国家自然科学基金委员会,青年项目,82500181,靶向LGALS1/LGALS3协同调控CD8⁺T细胞活化在再生障碍性贫血发生和治疗中的机制研究,2026-01至2028-12,30万元,在研,主持。

(2)山东省自然科学基金委员会,青年科学基金,ZR2021QH099,大黄素联合环孢霉素A对重型再生障碍性贫血的治疗作用及机制研究,2022-01至2024-12,15万元,结题,主持。

(3)济宁医学院,贺林院士新医学临床转化工作站科研基金,JYHL2019FZD02,Chidamide在再障骨髓脂肪化中的调控作用和分子机制研究,2020-01至2022-12,20万元,结题,主持。

指导教师对本项目的支持情况:

本课题为指导老师在研国基金项目的分支，指导老师已从事多年的AA相关研究，主持国家自然科学基金和山东省自然科学基金青年项目各1项、济宁医学院贺林院士重点研发项目1项，项目均围绕AA的发病机制和治疗展开。在研项目与本项目关系密切，且指导教师在研项目经费充足，全力支持本课题的开展，基本可以保证此课题的顺利完成。

项目级别:

省级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	马佳慧	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2025	统筹项目规划、设计并开展实验、动物模型的建立和撰写文章	第一主持人
2	刘宗炜	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2023	动物学及分子生物学实验的实施	成员
3	徐子俊	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2025	文献查找与汇总	成员
4	王英蓓	中西医结合学院	中西医临床医学（本科）	2024	细胞学实验的实施	成员
5	罗欣达	精神卫生学院	精神医学（本科）	2023	整理分析数据	成员
6	朱鑫越	临床医学院（附属医院）	临床医学（圣地卓越医师班）	2024	细胞学及分子生物学实验的实施	成员

指导教师

序号	教师姓名	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	张现宁	临床医学院（附属医院）	是	第一指导教师

立项依据

研究目的:

1. 探究PGLYRP1是否为调控再生障碍性贫血（AA）中CD8⁺T细胞异常活化的关键靶基因。

2. 靶向PGLYRP1是否能减轻或延缓再生障碍性贫血的发生。

研究内容:

1.研究AA发病过程中免疫细胞的异常变化，重点是确定CD8 Teff异常活化是AA的核心病理事件。

（1）荧光示踪AA小鼠模型的建立：利用EGFP^+/+转基因鼠作为外源淋巴细胞供体建立可追踪体内外源细胞变化的AA小鼠模型，并对AA表型和免疫细胞的骨髓浸润情况进行评估。（该部分研究已经完成，详见研究基础）

（2）单细胞测序分析异常的细胞亚群：对供体淋巴细胞、AA模型和正常以及辐射小鼠的骨髓细胞进行单细胞测序，比较AA模型骨髓中核心变化的细胞亚群。（该部分已经初步完成，详见研究基础）

（3）临床标本验证：检测AA患者骨髓细胞中不同T细胞的占比情况，从临床出发探究CD8 Teff是否是介导AA免疫异常的主要细胞群体。

2. 探究PGLYRP1在AA中调控CD8⁺T细胞异常活化的功能。

通过对单细胞测序中的CD8 Teff细胞亚群进行了二次分群分析，与正常骨髓细胞相比，AA模型中的CD8 Teff并没有新出现的亚群，仅仅是数量上的增加，因此将研究重点聚焦在基因层面的改变是否影响CD8⁺T细胞异常活化。

（1）单细胞测序层面分析：通过对单细胞测序中不同组间CD8⁺T细胞亚型的差异基因确定PGLYRP1的变化显著情况。（该部分研究已经完成，详见研究基础）

（2）AA小鼠和人样本的验证：检测淋巴细胞、AA模型脾脏和骨髓中PGLYRP1的表达情况。检测临床AA标本和公开的AA患者单细胞测序中CD8⁺T细胞PGLYRP1的表达情况。

（3）体内模型验证：构建PGLYRP1基因敲除的小鼠，分离这些转基因小鼠的淋巴细胞作为供体，通过体重变化、生存时间、血常规三系变化、骨髓病理切片、脾脏和骨髓T细胞浸润这些指标评价PGLYRP1敲除后对AA成模的影响。探究其是否影响AA的发生发展。（目前已经构建了PGLYRP1^-/-的转基因小鼠，正在繁育中，已经明确这个基因单独敲除后的纯合子可以正常存活。）

（4）细胞水平的验证：体外分离并检测人和小鼠CD8⁺T细胞活化过程中PGLYRP1的表达情况，探究转基因小鼠的CD8⁺T细胞增殖、活化和趋化能力的变化。同时探究PGLYRP1抑制剂对CD8⁺T细胞增殖和活化的影响。

3. 探究靶向PGLYRP1是否能延缓AA小鼠的进展。

（1）药物治疗评估：在AA小鼠造模之后，给予使用PGLYRP1抑制剂，探究对 AA 治疗的作用。

（2）研究药物对免疫系统的影响：分离不同用药组小鼠的外周血、脾脏和骨髓细胞，检测 CD4⁺、CD8⁺T细胞所占比例，提取血清检测 INF-γ、TNF-α等细胞因子的表达情况。

（3）研究药物对骨髓浸润的影响：分离小鼠股骨和胫骨，通过骨髓病理切片染色，研究不同用药组小鼠的骨髓造血干细胞、骨髓脂肪细胞变化情况。

（4）药物毒性实验：将药物给予正常小鼠，分离不同组别药物组小鼠的器官组织，进行病理观察，研究用药后是否产生毒副作用。

国、内外研究现状和发展动态:

1. 再生障碍性贫血的免疫发病机制与治疗瓶颈

再生障碍性贫血（AA）是一种由于骨髓造血功能衰退或者丧失导致的致命性全血细胞减少型贫血，以造血干细胞及祖细胞（HSPC）严重耗损为特征，病理上以“空”的骨髓基质（造血干细胞数量极少）为特征，临床以贫血、出血和感染为主要表现[1]。根据病情严重程度分为重型AA（SAA）和非重型AA（NSAA）。大量证据表明，它是一种由异常活化的T淋巴细胞介导的骨髓衰竭综合征，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对HSPC的自身免疫攻击是疾病发生的核心环节[2]。现在，AA免疫异常的认识已从单一的T细胞攻击扩展至多免疫细胞网络的协同失衡。当前AA的一线治疗仍以免疫抑制治疗（IST）和造血干细胞移植（HSCT）为主。目前，SAA患者若年龄岁且存在HLA相合同胞供体，造血干细胞移植（HSCT）为首选治疗方案，治愈率可达90%以上；而无法移植或NSAA患者则依赖免疫抑制疗法（IST）联合促造血方案（如ATG/ALG+环孢素A+血小板生成素受体激动剂TPO-RA）作为一线治疗[3]。然而，我国AA患者仍受限于经济条件、年龄及供体稀缺，造成HSCT应用率不足；IST虽可使70%的AA患者获得血液学缓解，但约30-40%患者出现复发，并且复发后再次使用IST的反应率仅25%左右[4]。尽管艾曲泊帕等TPO-RA类药物虽能加速短期血液学反应，但其疗效受限于HSCs耗竭程度，长期生存获益与单纯IST方案无统计学差异[5]。

其他探索性治疗（如抗CD52单抗、雄激素、雷帕霉素、环磷酰胺等）虽对部分患者有效，但存在肝毒性、感染风险升高等副作用，且缺乏多中心随机对照研究验证其安全性及普适性[6]。复发患者多依赖成分输血维持生存，尚无根治手段，长期面临感染、出血及克隆进化风险（约15%-20%进展为MDS/AML），生活质量严重受损[7]。

综上所述，AA的免疫发病机制已较为清晰——T细胞异常活化是疾病驱动的核心，其背后涉及遗传、环境及免疫调节网络的多层次失调。然而，调控T细胞活化与维持免疫耐受的关键上游分子仍未完全阐明。目前AA患者多采用对症治疗的方式，尚没有安全有效的靶向药，其根本原因在于AA的病理机制尚未完全解析，缺乏特异性靶点。因此，揭示AA核心发病机制并开发新型疗法是亟待解决的重大科学问题。

2.PGLYRP1是潜在CD8⁺T细胞异常活化调控开关。

再生障碍性贫血在免疫病理本质方面体现了CD8⁺T细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对造血干/祖细胞（HSPC）的特异性杀伤。大量研究证实，AA患者外周血及骨髓中CD8⁺T细胞呈现明显的克隆性扩增及活化表型，此异常活化现象涉及表观遗传调控、代谢重编程及多信号通路的协同失衡[8-10]。我们前期的单细胞测序分析也验证了上述结论，在深入分析CD8⁺T细胞异常活化的分子机制时，我们发现PGLYRP1在CD8⁺T细胞活化过程中表达显著上调，这暗示我们这可能对AA患者发病起到关键作用。

肽聚糖识别蛋白1（PGLYRP1）是先天免疫系统中一类高度保守的模式识别受体，传统上被认为主要通过识别细菌肽聚糖参与宿主防御[11]。然而，近年来研究揭示，PGLYRP1的功能远不止于抗菌免疫，其在调控适应性免疫应答、尤其是T细胞活化方面发挥着至关重要的调节作用。研究证实，PGLYRP1的N端肽段（N3）是TREM-1的新型天然配体，能够诱导TREM-1二聚化及信号转导，促进单核细胞分泌促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6），并最终驱动CD8⁺T细胞及CD4⁺T细胞分化为具有抗肿瘤活性的细胞毒性淋巴细胞[12]。这一发现提示，PGLYRP1-TREM-1信号轴是CD8⁺T细胞获得效应功能的“上游开关”——在AA中，这一开关的异常激活可能导致自身反应性CD8⁺T细胞的病理性扩增。此外，PGLYRP1还可通过与其他免疫调节蛋白相互作用拓展其功能网络。研究显示，PGLYRP1的C端肽段17.1可与Mts1（S100A4）蛋白形成高亲和力复合物（Kd=12.9 nM），该复合物能够结合TNFR1受体并诱导肿瘤细胞发生凋亡与坏死性凋亡。

综上所述，我们可以考虑研究PGLYRP1在再生障碍性贫血中的表达谱、生物学功能及其与CD8⁺T细胞活化的关系。因为考虑到AA同样是一种CD8⁺T细胞驱动的自身免疫性骨髓衰竭综合征，且PGLYRP1已被证实能够通过TREM-1信号轴调控CD8⁺T细胞的分化与杀伤功能[12-14]，亦可通过与其他免疫调节蛋白（如Mts1）协同作用影响免疫应答格局[15]，我们有充分理由推测：PGLYRP1可能在AA的免疫病理过程中扮演关键角色，并有望成为干预CD8⁺T细胞异常活化的新型靶点。

3.靶向免疫治疗在AA中的前沿探索与启示

再生障碍性贫血的治疗模式在过去数十年经历了从经验性免疫抑制到精准靶向联合策略的重要演变。自抗胸腺细胞球蛋白（ATG）和环孢素A（CsA）组成的标准免疫抑制治疗（IST）确立以来，其疗效已通过联合血小板生成素受体激动剂（TPO-RA）艾曲泊帕得到进一步提升[16]。与此同时，异基因造血干细胞移植（HSCT）领域亦取得显著进展，尤其以移植后环磷酰胺（PTCy）方案为基础的单倍体相合移植在初治及难治性AA中均显示出优异的总生存率[16]。然而，IST后仍存在部分患者无应答、复发及克隆演化风险，而HSCT仍受限于移植物抗宿主病及供者可及性等挑战[16]。因此，开发更具特异性的分子靶向疗法已成为AA研究的前沿焦点。

近年来，靶向造血调控信号通路的策略已在AA中取得实质性突破。艾曲泊帕作为一种口服小分子TPO-RA，通过激活c-MPL信号通路促进造血干/祖细胞增殖，已被证实可显著提高难治性AA患者的血液学反应率。ESCALATE II期临床试验进一步将艾曲泊帕联合IST拓展至儿童重型AA人群，结果显示该联合方案具有良好的耐受性及令人鼓舞的疗效，为儿童AA提供了新的治疗选择[17]。这一成功范例表明，针对特定造血调控分子的靶向干预能够与传统免疫抑制形成协同效应，为AA的精准治疗开辟了新路径。靶向免疫细胞表面分子的新型生物制剂亦开始进入AA治疗视野。血小板输注无效是AA患者临床管理中的棘手问题，常由抗HLA抗体介导的免疫清除所致。达雷妥尤单抗（daratumumab）是一种靶向CD38的单克隆抗体，通过清除产生抗体的浆细胞，已被成功应用于AA合并血小板输注无效的患者[18]。这一创新应用不仅为难治性血小板减少提供了有效干预手段，更展示了将肿瘤免疫治疗药物跨病种拓展至自身免疫性骨髓衰竭疾病的可行性，为AA的免疫靶向治疗提供了全新范式。综上所述，AA的治疗已从单一的、非特异性的免疫抑制逐步发展为包含造血调控剂（艾曲泊帕）、免疫检查点靶向制剂（达雷妥尤单抗）以及新型细胞疗法（单倍体移植）在内的多元化精准治疗体系[16-18]。这些进展共同证明：从免疫网络的特定节点进行干预，而非全面抑制免疫系统，是提升AA疗效、降低治疗相关并发症的关键方向。

上述靶向策略的成功证明，从免疫网络的特定节点进行精准干预是AA治疗发展的必然趋势。然而，调控CD8⁺T细胞异常活化的上游免疫检查点仍未被充分开发[2,7]。PGLYRP1作为连接先天免疫与适应性免疫的新型调控分子，其在AA中的表达及功能尚无任何研究报道。因此，本课题聚焦PGLYRP1，旨在填补AA免疫靶向治疗领域的这一空白，为开发基于PGLYRP1的免疫调节策略提供理论基础与实验依据。

参考文献

[1] YOUNG N S.Aplastic anemia[J].The New England journal of medicine,2018,379(17):1643-1656.

[2] PAN P, CHEN C, HONG J, et al.Autoimmune pathogenesis,immunosuppressive therapy and pharmacological mechanism in aplastic anemia[J].International Immunopharmacology,2023,117: 110036.

[3] 中华医学会血液学分会红细胞疾病（贫血）学组.再生障碍性贫血诊断与治疗中国指南（2022年版）[J].中华血液学杂志,2022,43(11):881-888.

[4] SCHEINBERG P, WUC O, NUNEZ O, et al.Long term outcome of pediatric patients with severe aplastic anemia treated with anti-thymocyte globulin and cyclosporine[J].The Journal of pediatrics,2008,153(6):814-819.

[5] ZHANG Y, LI J, LI X, et al.Efficacy and safety of immunosuppressive therapy combined with eltrombopag for severe aplastic anemia: a systematic review and meta-analysis[J]. Systematic Reviews,2024,13(1):101.

[6] MIANO M, DUFOUR C.The diagnosis and treatment of aplastic anemia: a review[J]. International Journal of Hematology,2015,101(6):527-535.

[7] ENACHE A, CARTYS A, BABUSHOK D V.Origins of T-cell-mediated autoimmunity in acquired aplastic anaemia[J].British Journal of Haematology,2025,206(4):1035-1053.

[8] QI W, ZHANG Y, WANG Y, et al.Abnormal expression of histone acetylases in CD8⁺T cells of patients with severe aplastic anemia[J].Journal of Clinical Laboratory Analysis,2022, 36(4):e24339.

[9] YOU X, YANG Q, YAN K, et al.Multi-Omics Profiling Identifies Pathways Associated With CD8⁺T-Cell Activation in Severe Aplastic Anemia[J].Frontiers in Genetics,2021,12:790990.

[10] JIA H, LIN Z H, LI W, et al. [The characterization analysis of pathogenic T cells in immune-mediated aplastic anemia mouse model][J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi = Zhonghua Xueyexue Zazhi,2022,43(7):587-593.

[11] POOL E S, KOOY-WINKELAAR Y, VAN UNEN V, et al.Mass cytometric analysis unveils a disease-specific immune cell network in the bone marrow in acquired aplastic anemia[J]. Frontiers in Immunology,2023,14:1274116.

[12] SHARAPOVAT N, IVANOVAO K, ROMANOVAE A, et al.N-Terminal Peptide of PGLYRP1/Tag7 Is a Novel Ligand for TREM-1 Receptor[J].International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(10):5752.

[13] BHUSAL A, LEE W H, SUK K. PGLYRP1 protein as a novel mediator of cellular dialogue in neuroinflammation[J].Neural Regeneration Research,2025,20(7):1993-1994.

[14] YURKINA D M, SHCHERBAKOV K A, ROMANOVA E A, et al.Shortened PGLYRP1 Peptides Regulate Antitumor Activity of Cytotoxic Lymphocytes via TREM-1 Receptor: From Biology to Bioinformatics[J].International Journal of Molecular Sciences,2025,26(9):4069.

[15] YURKINA D M, ROMANOVA E A, SHCHERBAKOV K A, et al.Mts1(S100A4)and Its Peptide Demonstrate Cytotoxic Activity in Complex with Tag7(PGLYRP1)Peptide[J].International Journal of Molecular Sciences,2024,25(12):6633.

[16] ONISHI Y. Aplastic anemia: history and recent developments in diagnosis and treatment[J].International Journal of Hematology,2024,119(3):217-219.

[17] SHIMAMURA A, MASCHAN A, BENNETT C, et al.Eltrombopag in combination with immunosuppressive therapy in pediatric severe aplastic anemia: phase 2 ESCALATE trial[J]. Blood Advances,2025,9(15):3728-3738.

[18] GAO Z, PAN H, ZHANG L, et al.Targeting CD38 with daratumumab for platelet transfusion refractoriness in aplastic anemia[J].Blood,2025,145(26):3189-3193.

创新点与项目特色:

创新点

1.本研究基于EGFP荧光示踪AA小鼠模型，结合单细胞转录组测序，确认CD8⁺T细胞的异常活化是AA发病中的核心病理事件。通过单细胞测序交叉分析筛选出PGLYRP1，发现PGLYRP1在CD8 Teff中较高表达，所以推测PGLYRP1在AA背景下调控CD8⁺T细胞异常活化的功能。

2.目前PGLYRP1在再生障碍性贫血免疫治疗领域尚属研究空白，国内外文献检索均未见该基因在AA免疫病理机制或治疗干预中的直接报道。然而，综合现有基础研究成果，PGLYRP1的免疫功能特征与AA的免疫病理机制之间存在多重潜在交叉点，具备重要的探索价值和创新性。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

技术路线

图1 总路线

1. 研究AA发病过程中核心变化的免疫细胞群体 [技术路线一(已完成，详见研究基础)]

我们进行了AA小鼠模型的建立、评估、活体成像追踪AA的发病过程和EGFP^+/+小鼠追踪AA发病过程中免疫细胞的变化。

图2 技术路线一：AA小鼠模型构建和多角度评估（已完成）

2.探究PGLYRP1基因是CD8⁺T细胞异常活化的关键基因[技术路线二(拟开展)]

（1）单细胞测序探究AA中免疫细胞亚型分布

1）可荧光示踪的单细胞测序：选择AA发病过程中骨髓浸润在50%左右的（AA）、经过辐射的（TBI）、正常的（NC）小鼠的骨髓细胞和EGFP^+/+C57BL/6雄性小鼠的淋巴结细胞（LNs）进行单细胞测序。（该部分研究已经完成，详见研究基础）

2）单细胞分析思路：分析单细胞测序中AA、TBI、NC、LNs四组中细胞亚群的分布，并通过EGFP的表达区分AA骨髓细胞中的外源细胞和内源细胞，探究每个细胞亚群中外源细胞的占比，明确AA中主要增加的细胞群体是来源于供体细胞的CD8 Teff。（该部分研究已经完成，详见研究基础）

3）临床病例统计：统计临床AA患者病例中淋巴细胞、CD8⁺、CD4⁺T细胞的占比情况。

4）临床患者标本检测：分离AA患者骨髓单个核细胞，流式检测CD3/4/8细胞的比例，检测CD8⁺T细胞中CD25/CD69的活化情况。

（2）单细胞分析PGLYRP1为核心变化基因

将CD8 Naïve T到CD8 Teff阶段变化的基因定义为T细胞活化基因，分别将TBI、NC、LNs各自组中的CD8 Teff与CD8 Naïve T进行对比作为正常情况下的活化基因，再将AA中CD8 Teff与LNs中的CD8 Naïve T进行对比作为AA发病中的活化基因，将4组的活化基因进行交叉分析，进行对PGLYRP1分析，观察PGLYRP1上调是否显著。（该部分研究已经完成，详见研究基础）最后再提取AA模型发病后脾脏和骨髓细胞以及供体淋巴细胞的RNA和蛋白质，检测PGLYRP1的表达情况。

（3）从AA患者中分析PGLYRP1的表达

1）在AA临床患者单细胞数据中分析：分析GSE145669公开单细胞测序数据，包括了正常人、NSAA、SAA患者骨髓细胞的单细胞测序数据。将CD4和CD8细胞的群体单独分离出来，用marker CCR7、LEF1、SELL、TCF7定义CD8 Naïve T，用marker NKG7、PRF1、GNLY、GZMB、GZMA定义CD8 Teff，然后分析PGLYRP1在不同组中CD8 Naïve T和CD8 Teff中的表达情况。

2）在AA患者临床样本中分析：收集10-15对缺铁贫患者或者正常人和AA患者的骨髓样本，用分选磁珠分离出CD8⁺T细胞，然后进行细胞涂片和免疫荧光染色，在超高分辨显微镜下成像，用CD69和PGLYRP1进行染色，将CD69阴性细胞定义为未活化的CD8 Naïve T，将CD69阳性定义为活化后的CD8 Teff，通过对比正常人和AA患者中CD69阴性和阳性细胞中PGLYRP1的荧光强度，验证PGLYRP1在AA患者CD8⁺T细胞亚型中的表达情况。

（4）体内利用基因敲除鼠探究PGLYRP1对AA发病的影响

用PGLYRP1^-/-转基因小鼠以及同窝出生的野生型小鼠作为淋巴结细胞的供体进行AA造模，然后通过体重变化、生存时间、血常规三系变化、骨髓病理切片、脾脏和骨髓T细胞浸润这些指标评价PGLYRP1敲除后对AA成模的影响。

（5）探究PGLYRP1对CD8⁺T细胞功能的影响

1）检测PGLYRP1在体外CD8⁺T细胞活化中的表达：利用CD8⁺T细胞磁珠在体外进行人或者小鼠CD8⁺T细胞的分选，人标本收集缺铁贫患者或者AA患者的骨髓组织，CD8⁺T细胞用CD3、CD28和IL2的组合进行活化诱导；小鼠CD8⁺T细胞用CD3和CD28的组合诱导活化。收集诱导第0、3、6、9天的细胞，通过流式利用CD25和CD69检测活化状态；然后提取RNA和蛋白质，通过qPCR和western检测PGLYRP1在CD8⁺T细胞活化过程中的表达情况。

2）探究PGLYRP1的基因敲除对CD8⁺T细胞功能的影响：分离正常小鼠、PGLYRP1^-/-转基因小鼠的CD8⁺T细胞，进行活化诱导，然后通过细胞计数、CCK8检测细胞活力、上清检测IFN-γ和TNF-α、流式检测凋亡、CD5和CD69的表达、Transwell小室检测趋化实验评价PGLYRP1敲除后对CD8⁺T细胞增殖活化和趋化能力的影响。

3）探究PGLYRP1的抑制剂对CD8⁺T细胞功能的影响：分离人或者小鼠CD8⁺T细胞后，用维持培养基进行培养，然后在96孔板中加入不同浓度PGLYRP1的抑制剂，培养5天后用CCK8检测每种抑制剂在CD8⁺T细胞中的IC50，最后选择无毒性的最大浓度进行功能实验。随后将CD8⁺T细胞诱导活化的同时加入不同抑制剂，诱导6天后，通过细胞计数、CCK8检测细胞活力、上清检测IFN-γ和TNF-α、流式检测凋亡、CD5和CD69的表达评价抑制剂对增殖活化的影响；然后将5×10⁵的细胞转移到Transwell小室上层中，下层加入SDF-1趋化因子，3小时后对下层细胞进行计数，检测抑制剂对趋化的影响。

图3 技术路线二：探究PGLYRP1基因是CD8+T细胞异常活化的关键基因(拟开展)

3.研究PGLYRP1的小分子抑制剂对AA的治疗情况[技术路线三(拟开展)]

利用PGLYRP1的抑制剂，探究PGLYRP1靶向能否治疗AA。

实验流程为给AA小鼠自建模后1小时内开始每天给药，10只每组，每天监测体重和健康状态，记录生存时间。两周后，将每组的小鼠进行眼球取血以及取脾脏、胫骨和股骨，通过血常规分析、血清中细胞因子检测、脾细胞和骨髓细胞中免疫细胞的流式检测以及骨髓病理活检评估对 AA 小鼠的治疗作用。

（1）确定最佳用药浓度：设置 0、5、10、20 mg/kg 的浓度梯度，用生理盐水配制为混悬液，经灌胃给药。

（2）药物毒性实验：将实验探究中的抑制剂所用浓度给予正常小鼠，监测体重和健康状态，两周后，分离药物处理后小鼠的肝、肾、脾，做病理切片，观察形态变化，评估药物的毒副作用。

图4 技术路线三: 研究PGLYRP1的小分子抑制剂对AA的治疗情况(拟开展)

拟解决的问题

1. PGLYRP1是否可作为AA治疗的新靶点缺乏证据。

PGLYRP1作为连接先天免疫与适应性免疫的新型调控分子，其在AA中的表达及功能尚无任何研究报道。而综合现有基础研究成果，PGLYRP1的免疫功能特征与AA的免疫病理机制之间存在多重潜在交叉点，我们将逐步探究PGLYRP1是否为调控AA中CD8⁺T细胞异常活化的关键靶基因。

2. 靶向PGLYRP1干预AA的转化潜力未明。

PGLYRP1小分子抑制剂对AA的治疗效果、最佳给药方案及潜在毒副作用尚未在动物模型中进行系统评估。

预期成果

1.明确靶点地位：阐明PGLYRP1在AA中调控CD8⁺T细胞异常活化的关键作用，证实其可作为延缓AA进展的药物治疗新靶点。

2.验证转化潜力：通过PGLYRP1的小分子抑制剂，系统明确其在AA动物模型中的疗效、最佳给药方案及毒副作用特征。

3.发表学术论文1-2篇，在全国大学生生命科学竞赛等科研项目竞赛中获得省级及以上奖励。

项目研究进度安排:

2026.06-2027.05：多角度证明PGLYRP1在CD8 Teff中高表达。探究PGLYRP1是否为调控AA中CD8⁺T细胞异常活化的关键靶基因。

2027.06-2027.12：探究PGLYRP1的小分子抑制剂对AA的治疗情况。

2028.01-2028.06：系统整理所有实验数据，进行统计分析，绘制图表，撰写研究论文。完成学术论文的初稿，根据指导老师意见进行修改完善。同时，整理实验记录、图片等材料，为项目结题做准备。

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

本课题指导老师已从事多年的AA相关研究，主持国家自然科学基金和山东省自然科学基金青年项目各1项、济宁医学院贺林院士重点研发项目1项。项目均围绕AA的发病机制和治疗展开。

针对探究PGLYRP1是否是调控AA中CD8⁺T细胞异常活化的关键靶基因的相关研究，将从以下方面做简单介绍。

（1）免疫介导的AA小鼠模型及评估

申请者团队根据国际认可的造模方案已经建立了稳定的AA小鼠发病模型，目前建模成功率为100%，得到的AA小鼠发病急，基本只能存活两周左右，其变化指标符合临床对于AA的评价标准。

AA模型的建立：将C57BL/6雄性小鼠与Balb/c雌雄小鼠进行杂交繁殖子一代CB6F1小鼠，选择2月龄以上的CB6F1小鼠建立AA模型。将CB6F1小鼠在60 Co-γ射线下进行总剂量为5 Gy的辐射，然后分离两月龄以上C57BL/6雄性小鼠的淋巴结细胞，在辐射5-6 h后通过尾静脉将5×10⁶淋巴细胞注射到CB6F1小鼠体内。

评估AA模型：每隔3天称量小鼠的体重，颌下静脉收集外周血检测血常规白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板的变化。当造模在10-14天之间，小鼠体重下降显著，行动迟缓，出现死亡时认为已经发生AA，造模成功，记录生存曲线。

为了探究AA的发病机制和药物治疗，我们通过辐射加注射父本异源淋巴细胞的方式建立了AA小鼠模型（图5A）。AA小鼠发病急，体重在一周后持续下降，多数存活不超过两周（图 5B-C）。与正常以及单纯接受辐射的小鼠相比，AA小鼠血常规中白细胞、红细胞、血红蛋白以及血小板数量随模型的发展逐渐下降（图5D-G），下降程度符合临床对AA的评判标准。AA小鼠发病后，骨髓中的细胞数量显著降低，并且超过90%都是CD3⁺T细胞，其中CD8⁺T细胞占比超过80%，CD4⁺T细胞的占比没有明显变化（图5H-K），这表明浸润到AA小鼠骨髓中的主要是CD8⁺T细胞。骨髓病理切片HE染色同样表明AA小鼠骨髓中有核细胞极少，成脂细胞增多（图5L），这同样符合临床AA的骨髓病理像。随后为了观察供体淋巴细胞在AA模型小鼠体内的动态浸润情况，我们用Dir红色染料标记了供体淋巴细胞的的细胞膜，可以在活体成像仪中识别成像。结果表明，供体淋巴细胞在AA小鼠体内最开始聚集在胸腔肝脾部位，随着时间逐渐向全身扩散，基本在第8-12天左右能浸润至大部分器官，而同样数量的淋巴细胞移植到未经过辐射的小鼠体内后不能进行扩散（图5M）。

图5.免疫介导的AA小鼠模型及评估。

（A）AA造模流程图。（B）AA小鼠体重变化。（C）AA小鼠生存曲线。（D-G）AA小鼠血常规随时间的变化（n=10）：（D）白细胞（WBC）、（E）红细胞（RBC）、（F）血红蛋白（HGB）、（G）血小板（PLT）。在AA造模第15天，分离股骨和胫骨的骨髓细胞，进行细胞计数（H）；然后通过流式检测CD3+T细胞占总细胞的比例（I），以及CD3⁺CD8⁺T细胞（J）和CD3⁺CD4⁺T细胞（K）占CD3⁺T细胞的比例（n=5）。（L）股骨骨髓病理切片HE染色显示AA小鼠骨髓有核细胞极少，并且发生严重脂肪化。（M）利用Dir染料标记淋巴结细胞后在活体成像追踪外源细胞在AA小鼠体内的浸润情况：（左）模式图，（右）不同时间点活体成像图。N为正常小鼠，C为正常小鼠注射同等细胞数量淋巴细胞的对照组，TBI为辐射对照组，AA为模型组。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

（2）AA小鼠模型的发病主要由外源CD8⁺T细胞所介导。

由于Dir示踪技术更多应用于活体成像，且淋巴结细胞经过标记后活性降低，AA造模成功率下降，不适合应用于常规的实验。为了更好的追踪AA发病过程中移植的外源细胞的变化，我们构建了EGFP^+/+转基因C57BL/6小鼠，所有细胞均表达绿色荧光蛋白，然后分离它的淋巴结细胞作为供体进行AA造模（图2A）。我们检测了不同时间点骨髓和脾脏中EGFP⁺细胞的比例，随着时间的增长，骨髓中EGFP⁺细胞的占比逐渐增加，最后达到90%以上（图2B），荧光显微镜下可以明显观察到绿色荧光的表达（图2C）；而脾脏中EGFP⁺细胞出现时间要早于骨髓，在第5天时已经占据一半左右（图2D），这表明外源细胞先在脾脏中进行克隆增殖，然后逐渐浸润到骨髓中去。接下来我们检测了所有器官中EGFP⁺细胞的浸润情况，结果表明这些细胞主要分布在血液、脾脏中，肝脏中存在小部分，这说明外源细胞主要浸润于血液和免疫系统（图2E）。接着我们分析了骨髓、血液和脾脏中T细胞的占比情况，流式结果表明不管是骨髓、血液还是脾脏细胞，在AA模型中90%以上都是CD3⁺T细胞，这些CD3⁺T细胞中95%以上都是EGFP⁺细胞（图2F-H）；而且CD3⁺EGFP⁺的细胞中80%以上均为CD8⁺T细胞，CD8⁺与CD4⁺的比值显著增加（图2I-K），这些结果充分证明AA小鼠模型是由外源植入的CD8⁺T细胞异常增殖活化所介导。值得注意的是，在AA模型中EGFP阴性的CD3⁺T细胞尽管占比低于5%，但是其中也是CD8⁺T细胞占据主要亚群，甚至CD8⁺与CD4⁺的比值高于EGFP⁺细胞部分（图2I-K），这表明外源植入的CD8⁺T细胞浸润到骨髓中除了发挥杀伤功能，还能促进内源的CD8⁺T细胞异常增值活化。

图6.AA小鼠模型的发病主要由外源CD8+T细胞所介导。

（A）EGFP^+/+转基因小鼠作为供体进行AA造模的模式图。AA造模后分别在第5、7、9天分离脾脏和骨髓细胞进行检测：（B）不同时间点骨髓细胞中EGFP⁺细胞占总细胞的比例；（C）荧光显微镜下观察第7天骨髓细胞中绿色荧光表达情况；（D）不同时间点脾脏细胞中EGFP⁺细胞占总细胞的比例。（E）AA模型第9天收集血液、脾、心、肝、脾、肺、肾、脑、胃和小肠的单个细胞悬液，用流式检测EGFP阳性细胞在每个器官的浸润情况。（F-K）对AA模型第9天骨髓、血液和脾脏细胞中T细胞的占比进行检测（n=5）：（F-H）为不同组的细胞中CD3⁺T细胞占总细胞的比例；（F）骨髓，（G）血液；（H）脾脏；（I-K）为不同组的细胞中CD8⁺或者CD4⁺T细胞占CD3⁺T细胞的比例，其中蓝色为CD8⁺T细胞，绿色为CD4⁺T细胞，左边纵坐标代表其占CD3⁺T细胞的比例；红色折线为CD8⁺与CD4⁺T细胞的比值，在右边纵坐标表示，显著性为AA-EGFP阳性组和AA-EGFP阴性组分别与TBI组相比较，显著性颜色与各组颜色一致：（I）骨髓，（J）血液；（K）脾脏。N为正常小鼠，TBI为辐射对照组，AA为模型组，又分为AA-EGFP阳性组和AA-EGFP阴性组。BM：骨髓单个核细胞，Spleen：脾脏单个核细胞。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

（3）CD8Teff异常活化是AA的核心病理事件。

为了进一步确定外源植入的CD8⁺T细胞在AA发病过程中发生了何种变化，我们将AA模型进展到一半（骨髓中EGFP阳性细胞占30%-50%）左右的骨髓细胞和正常小鼠、辐射小鼠的骨髓细胞以及供体的淋巴结细胞进行了单细胞测序（图3A）。所有的细胞被分为了20个细胞亚群，包括非免疫细胞亚群和免疫细胞亚群。在非免疫细胞亚群中，GMP、HSCs、B cells和pDCs在辐射组和AA中逐步降低；ProNeutrophil则在辐射和AA中逐步升高；而ProEryth辐射后大量增多，AA发生后逐渐耗竭；免疫细胞中CD8 Teff和Helper T比例在辐射和AA中逐步显著上调；NK、NKT、CD4 NaiveT、CD8 NaiveT、CD4Treg在辐射和AA中轻微上调（图3B-C）。总体来看，与其他3个对照组相比，在AA中变化比例最大的是CD8 Teff和Helper T，其中CD8 Teff是增加最为显著的细胞亚群（图3D-E）。这揭示CD8 Teff是AA发生的主要功能细胞亚群，Helper T是主要的辅助细胞亚群。为了确定EGFP阳性细胞在单细胞层面的检测敏感性，我们分析了淋巴结细胞中EGFP阳性细胞的占比情况，结果表明T细胞中90%以上的细胞均可以检测到EGFP的表达（图3F），这说明利用EGFP可以对AA骨髓内的细胞区分外源和内源。随后我们分析了AA组每个细胞亚群中EGFP阳性细胞的占比情况，结果表明AA中的CD4 NaiveT、CD8 NaiveT、CD4Treg、CD8 Teff和Helper T这些来源于CD3⁺T细胞的亚群基本上都是EGFP阳性细胞（图3G），进一步证明了AA小鼠模型的发病是由外源植入的CD8⁺T细胞异常增殖活化导致，其中CD8 Teff是核心功能细胞。

图7.CD8Teff异常活化是AA的核心病理事件。

（A）单细胞测序流程图，共分为EGFP^+/+小鼠来源的淋巴结细胞（LNs）、AA模型小鼠（AA）、正常（NC）和辐射小鼠（TBI）的骨髓细胞4组，其中LNs、NC和TBI组每组各3只，AA组共9只，每3只混合后作为1组。（B）单细胞层面不同的细胞分群和不同组中细胞亚群的分布情况；（C）不同组中不同亚群占总细胞的比例。（D）4组中CD8 Teff亚群占总细胞的比例；（E）4组中Helper T亚群占总细胞的比例。（F）LNs中每个细胞亚群EGFP阳性细胞的占比。（G）AA中每个细胞亚群EGFP阳性细胞的占比，由柱形图表示，左边纵坐标代表所占比例；绿色折线图为每个细胞亚群占总细胞的比例，由右边纵坐标表示。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

（4）PGLYRP1在CD8 Teff中较高表达。

为了探究AA中为何CD8⁺T细胞发生了异常增殖活化，我们首先通过对单细胞测序中的CD8 Teff细胞亚群进行了细分群分析。与正常骨髓细胞相比，AA模型中的CD8 Teff并没有新出现的亚群，仅仅是数量上的增加，这表明AA中并不是由某一群CD8 Teff细胞导致，因此我们将研究重点聚焦在基因层面的改变是否影响CD8⁺T细胞异常活化。我们将CD8 Naïve T到CD8 Teff阶段变化的基因定义为T细胞活化基因，分别将TBI、NC、LNs各自组中的CD8 Teff与CD8 Naïve T进行对比作为正常情况下的活化基因，再将AA中CD8 Teff与LNs中的CD8 Naïve T进行对比作为AA发病中的活化基因，将4组的活化基因进行交叉分析，AA组与其他3组之间的674个差异基因为AA中的特殊变化基因，其中PGLYRP1上调较显著。

图8.PGLYRP1在CD8 Teff中较高表达。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

已具备的条件

（1）该课题指导老师认真勤奋，具有多年的研究基础，从实验设计到具体分子、细胞、动物实验均能够熟练应对。一直围绕AA的发病机制和治疗进行研究。以第一或通讯作者共发表SCI论文5篇，其中4篇JCR 1区，1篇JCR 2区，主持山东省自然科学基金青年项目1项，山东省医药卫生项目1项，济宁医学院贺林院士重点研发项目1项，累计经费60万元，项目均围绕AA的发病和治疗开展，为本项目的顺利进行奠定了扎实的技术基础。

（2）本课题负责人及项目组成员为我校2023级，2024级，2025级临床医学专业，中西医临床医学专业，精神医学专业的本科学生，学生学科交叉优势明显，人员架构合理，可互为补充，且学生都有较强的基础实验知识储备，并参加了项目的前期研究，掌握了一定的实验技术。本项目负责人参与了指导老师青年科学基金《靶向LGALS1/LGALS3协同调控CD8⁺T细胞活化在再生障碍性贫血发生和治疗中的机制研究》的研究，参与此项目中动物实验、细胞培养与分子层面相关的实验等，目前已经熟练掌握了多种实验技术，并对再生障碍性贫血，CD8⁺T细胞，PGLYRP1有了一定程度的了解，为本课题的实验材料准备、实验开展与数据分析及整理等打下坚实基础。

（3）本课题将在济宁医学院附属医院医学研究中心完成，具有良好的学科研究基础和完善的科学研究公共平台。包括基因组学分析平台、蛋白组学分析平台、代谢组学检测平台、活细胞分析平台、分子生物学平台、活体动物成像平台等平台单元。拥有FEI 120KV透射电镜、蔡司Elyra 7超高分辨显微成像系统、蔡司PALM MicroBeam激光显微切割系统、安捷伦Seahorse XFe24细胞能量代谢分析仪、蔡司Axio Observer 7全电动倒置荧光显微镜、Lifecanvas SB+组织透明化染色系统、Particle Metrix Zetaview纳米颗粒分析仪、蔡司Axio Zoom.V16体视显微镜、BioruptorUCD-200非接触式超声波细胞破碎仪、小动物活体成像、microCT、激光片层扫描显微镜、德国蔡司Cell Discover 7活细胞自动化显微成像监控平台、德国蔡司LSM810激光共聚焦显微镜（带Airyscan模块）、蔡司Axio Imager Z2正置荧光显微镜（带ApoTome 2）、蔡司Axio Observer A1倒置荧光显微镜、德国美天旎密闭式流式细胞分选仪（MACSQuant Tyto）和美国贝克曼分析型流式细胞仪（DxFLEX）、细胞牵张拉伸应力加载培养系统、美国ABI Q5和BioRad荧光定量PCR仪、多色荧光成像仪、小动物超声等一系列高、精、尖的仪器设备以及进行核酸和蛋白实验的常规设备，设备总值9000余万元。本项目指导老师团队依托山东省血液精品学科研究团队和山东省细胞生物医疗技术重点实验室，从事相关研究的泰山学者特聘专家、泰山学者青年专家10余位，具备完整的研究梯队，无论是实验设计还是实验条件都能够有很好的支持。

尚无缺少的条件

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	20000.00	实验探究	10000.00	10000.00
1. 业务费	7500.00	实验探究	1500.00	6000.00
（1）计算、分析、测试费	3000.00	分析及测试	1000.00	2000.00
（2）能源动力费	0.00	无	0.00	0.00
（3）会议、差旅费	1000.00	国内学术交流会2次，每次约500元	500.00	500.00
（4）文献检索费	0.00	无	0.00	0.00
（5）论文出版费	3500.00	论文查重，论文出版	0.00	3500.00
2. 仪器设备购置费	0.00	无	0.00	0.00
3. 实验装置试制费	0.00	无	0.00	0.00
4. 材料费	12500.00	实验所需需动物用品、细胞相关用品、所需的各类试剂及抗体等	8500.00	4000.00

结束

大学生创新创业训练计划管理系统

创新创业管理系统

详情