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多组学整合解析糖肝共病进展相关候选靶点及 mTOR 相关通路干预策略研究

申报人：邹可鑫 申报日期：2026-01-20

基本情况

2026创新项目
多组学整合解析糖肝共病进展相关候选靶点及 mTOR 相关通路干预策略研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生自主选题
二年期
2 型糖尿病（T2DM）与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是常见代谢性共病，二者相互促进肝脏脂肪变性、炎症及纤维化进展，但从遗传因果到细胞水平的跨层机制仍不清楚。 本项目以两样本孟德尔随机化为切入点，通过 SNP 邻近基因注释获得遗传线索，整合 Bulk 转录组、单细胞转录组及患者水平pseudobulk 分析筛选核心候选基因，结合 mTOR 通路解析与天然产物反向筛选，拟在 HepG2 脂毒性模型中验证候选靶点与干预成分，为”糖肝同调”的中西医结合防治策略提供可验证的分子依据。其中，MR-SNP 邻近注释筛选出 SUGP1 和 KL 等候选基因，而无偏倚的 GSEA 通路富集独立发现 mTORC1 和 PI3K- AKT-mTOR 等代谢程序在 T2DM 肝脏中方向性上调，两条线索在功能层面形成汇合，构成本项目”候选基因—mTOR 通路”并行研究的双重基础。
参与基于 miRNA-378d/MYC 通路调控线粒体自噬探讨加味逍遥散治疗肝气郁结型抑郁症的机制研究，负责网络药理学以及分子对接等任务
指导教师承担科研课题主持国家自然科学基金青年项目一项；山东省医药卫生科技发情况展计划项目一项；山东省中医药管理局项目一项；发表SCI文章6篇。
课题组一直致力于抗肝纤维化药物的筛选研究，尤其是从中药来源的化合物中筛选能够抑制肝纤维化进展的天然产物及有效作用靶点。指导教师对本项目的支持情况指导教师与项目成员共同分析讨论了本项目的研究价值及可行性，指导完善本项目的实验设计；指导教师团队成员具有成熟的实验技术，可以指导本项目成员顺利开展实验，并且可为本项目的顺利实施提供实验场地和实验设备，指导本项目结题后论文的写作投稿。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
邹可鑫 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2024 项目总体设计、单细 胞分析及论文撰写
田鹏飞 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2024 负责文献检索、中药 活性成分库筛选、成 分-靶点信息整理
刘安妮 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2023 负责候选化合物结构 整理、PDB 蛋白结 构获取、分子对接
杨馨月 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2023 负责双样本孟德尔随 机化（MR）分析， 及结果图表整理
李美利 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2024 负责单细胞数据整 理、候选基因表达定 位、通路分析

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
刘媛 中西医结合学院 否

立项依据

1.1 总体目的
本项目以 T2DM 与 NAFLD 糖肝共病为研究对象，基于两样本孟德尔随机化（MR）获得的遗传因果线索，整合 Bulk 转录组、单细胞转录组及患者水平 pseudobulk 分析，系统筛选 T2DM 促进 NAFLD 进展的关键候选基因，解析 mTOR 相关代谢通路在糖肝共病中的作用特征，并结合天然产物反向筛选与细胞功能验证，为“糖肝同调”的中西医结合防治策略提供可验证的分子靶点和候选干预方向。其中，MR-SNP 邻近注释筛选出SUGP1 和 KL 等候选基因，而无偏倚的 GSEA 通路富集独立发现 mTORC1 和 PI3K- AKT-mTOR 等代谢程序在 T2DM 肝脏中方向性上调，两条线索在功能层面形成汇合，构成本项目”候选基因—mTOR 通路”并行研究的双重基础。
1.2 具体目的
（1）明确 T2DM 对 NAFLD 的遗传因果效应并获取候选基因集合。
   基于 IEU OpenGWAS 与 FinnGen 数据库开展两样本 MR 分析，评估 T2DM 对 NAFLD的潜在遗传因果效应；通过 SNP 邻近基因注释获得候选基因，为后续多组学验证提供遗传学线索。
（2）筛选并分层验证糖肝共病的关键候选基因。
   整合 GSE15653 Bulk 转录组与 GSE202379 单细胞转录组数据，完成候选基因的组织表达验证、细胞类型定位，并引入患者水平 pseudobulk 分析建立 Tier 1/Tier 2 分层体系，降低单细胞伪重复偏倚。
（3）解析 mTOR 相关代谢通路在糖肝共病进展中的变化特征。
   通过单细胞通路活性评分与 Bulk GSEA，系统评估 mTORC1、PI3K-AKT-mTOR 及糖脂代谢通路在 T2DM 肝组织和 NAFLD 不同分期中的活性变化，构建候选基因—mTOR 通路并行机制假说。
（4）基于多组学证据筛选候选天然活性成分并开展细胞功能验证。
   围绕核心候选基因及 mTOR 相关通路，利用数据库筛选与分子对接确定 3-5 个优先候选化合物，在 HepG2 高糖/棕榈酸脂毒性模型及 LX2 星状细胞活化模型中验证其干预效果。
3.1 总体思路
本项目围绕“T2DM 促进 NAFLD 进展”这一核心科学问题，构建五阶段递进研究体系（图 1）：以两样本 MR 遗传因果分析为起点获取候选基因集合，经 Bulk 转录组和单细胞转录组逐级验证，引入患者水平 pseudobulk 策略建立候选基因 Tier 1/Tier 2 分层，进而解析 mTOR 相关代谢通路的阶段特异性变化并构建并行机制模型，最终以多组学证据约束天然产物反向筛选并在 HepG2/LX2 双细胞模型中完成功能验证。
3.2 具体研究内容
（1）T2DM 影响 NAFLD 的遗传因果分析及 SNP 邻近候选基因注释
科学问题：T2DM 对 NAFLD 是否存在遗传因果效应？哪些基因位点可能介导这一效应？
基于 IEU OpenGWAS 和 FinnGen 数据库，以 T2DM 为暴露、NAFLD 为结局开展两样本 MR 分析。通过 LD clumping（r²<0.001, clumping window=10000kb）筛选独立工具变量，采用 IVW 为主要分析方法，辅以 MR-Egger、加权中位数和加权模型进行敏感性分析，以 Cochran Q 检验评估异质性，以 MR-Egger intercept 和 MR-PRESSO 检测水平多效性，以 leave-one-out 验证单 SNP 驱动效应。工具变量强度以 F 统计量评估（F>10 为合格）。对 harmonised SNPs 进行邻近基因注释（±500kb 窗口），结合 ANNOVAR 功能注释和 GTEx eQTL 数据筛选潜在功能相关基因，获得候选基因集合。该模块产出的遗传因果估计和候选基因列表，是后续所有多组学验证的起点。
（2）Bulk 转录组筛选、单细胞定位及患者水平 pseudobulk 核心基因筛选
科学问题：MR 候选基因在 T2DM 肝组织中是否发生表达改变？在哪种肝脏细胞类型中表达？经患者水平统计过滤后哪些基因信号保持稳健？
Bulk 转录组验证：基于 GSE15653 肝组织转录组数据，采用 limma 方法以|logFC|>0.5且 adj.P<0.05 筛选 T2DM 相关差异表达基因，将 MR 候选基因与 DEG 列表交叉验证，
明确各候选基因的表达方向和显著性。单细胞转录组定位：基于 GSE202379 单核 RNA-seq 数据（99,809 个细胞），采用Seurat v5 进行标准化、高变基因筛选和 PCA 降维，Harmony 校正批次效应后进行 UMAP可视化和 Louvain 聚类，结合已知 marker 基因鉴定肝脏主要细胞类型。将候选基因映射至 UMAP 空间和细胞类型分布，明确其在不同 NAFLD 分期（健康/NAFLD/NASH/肝硬化）中的表达定位。患者水平 pseudobulk 筛选（核心创新步骤）：以肝细胞为重点，采用 Pseudobulk 将同一患者来源的肝细胞表达按基因加和聚合，以患者而非单个细胞为统计单位，通过limma-trend 比较不同分期间的候选基因表达差异。基于 pseudobulk 结果建立 Tier 1（患者水平 P<0.05 且方向致）/Tier 2（cell-level 有信号但患者水平未达显著）候选基因分层体系。
（3）mTOR 相关代谢通路活性解析与候选基因-通路并行机制模型构建
本模块的方法论前提：mTOR 相关通路来源于前期 Bulk GSEA 对全部 3,745 个DEGs 的无偏倚富集，而非对 MR 候选基因的功能注释。通路分析与候选基因筛选是并行
的两条发现路径。
科学问题：mTOR 相关代谢通路在 T2DM 肝组织和 NAFLD 进展中发生怎样的阶段特异性变化？核心候选基因与各 mTOR 分支通路之间存在何种关联模式？
单细胞通路活性评分：采用 AUCell 或 ssGSEA 方法，计算每个细胞中 mTORC1signaling、PI3K-AKT-mTOR、glycolysis、fatty acid metabolism、adipogenesis 和 E2Ftargets 等通路的活性评分，比较不同细胞类型和 NAFLD 分期间的差异。重点关注通路活性在疾病过渡阶段（NAFLD→NASH、NASH→肝硬化）的变化模式。Bulk GSEA 分析以 T2DM vs 正常为表型对比，采用 fgsea 对 Hallmark 和 KEGG基因集进行 GSEA 分析，以 NES 和 FDR 评估通路富集的方向和显著性。候选基因-通路关联分析：计算SUGP1/KL/FTO 表达量与各 mTOR 分支通路评分的Spearman 相关系数，结合文献挖掘和通路拓扑分析，构建“SUGP1（翻译起始支路）—KL（独立代谢适应）—mTOR 代谢通路（营养感知枢纽）”的并行机制模型。该模型认为三者从翻译调控、代谢保护和营养感知三个维度共同参与糖肝共病，而非形成单一线性调控轴。
（4）多组学证据约束的天然产物反向筛选与分子对接
科学问题：基于 SUGP1、KL 和 mTOR 相关通路，哪些天然活性成分可能成为”糖肝同调”的候选干预分子？
反向筛选流程：以 SUGP1 和 KL 为直接靶点，以 mTOR、S6K、4EBP1、PI3K 和AKT 为通路靶点，检索 TCMSP 和 HERB 数据库中具有调控关系的天然活性成分，通过
PubChem 获取 3D 结构，SwissTargetPrediction 预测靶点谱进行反向验证，构建“成分—靶点—通路”网络。筛选标准：口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18、靶点交集≥2 个多组学支持靶点。分子对接：采用 AutoDock Vina 将候选成分与关键靶点蛋白（PDB 数据库获取晶体结构，AlphaFold2 补充无结构蛋白）进行半柔性对接，以结合能≤-7.0 kcal/mol 为初步筛选阈值，综合对接打分和靶点覆盖度排序，优先筛选 3-5 个候选化合物进入细胞实验。
（5）HepG2/LX2 双细胞模型功能验证
科学问题：筛选出的候选天然活性成分能否在脂毒性条件下调控候选基因表达、改善脂质沉积并影响 mTOR 通路活性？
HepG2 脂毒性模型：以高糖（25mM）+棕榈酸（0.2mM）联合诱导 HepG2 细胞构建糖脂毒性模型。CCK-8 确定候选化合物安全浓度范围后，设置对照组、模型组和低/中/高
剂量干预组。通过 Oil Red O 染色和甘油三酯（TG）定量评估脂质沉积；qPCR 检测SUGP1、KL、FTO 及脂质代谢标志基因（SREBP1c、FASN、CPT1α）的 mRNA 水平；Western blot 检测 p-mTOR/mTOR、p-S6/S6、p-4EBP1/4EBP1 及候选基因蛋白水平。LX2 星状细胞活化模型：以 TGF-β1 诱导 LX2 细胞活化，检测候选化合物对α-SMA和 COL1A1 表达的影响，初步评估候选成分对肝纤维化关键环节的干预潜力。必要时引入 AML12 正常小鼠肝细胞进行平行验证，排除 HepG2 肿瘤来源细胞的 Warburg 效应干扰。
该模块的产出将形成“候选基因调控—代谢通路信号变化—细胞表型改善”的完整功能验证闭环，为后续深入研究提供实验依据。
2.1 T2DM-NAFLD 共病与 mTOR 相关代谢通路
  T2DM 与 NAFLD 是全球范围内最常见的代谢性共病，二者在流行病学、病理生理学和临床治疗层面均存在深刻的交互关系。一项纳入 80 项研究的系统综述和 meta 分析显示，T2DM 患者中 NAFLD 的全球汇总患病率为 55.48%（95% CI：47.26%–63.67%），其中欧洲（68%）和西亚（67%）的共病率最高[1]。在经活检证实的 NAFLD 人群中，合并 T2DM 者进展为 NASH、晚期纤维化、肝硬化及肝细胞癌（HCC）的风险显著升高，且肝脏相关死亡率约为非糖尿病患者的 3 倍[2][3]。Jarvis 等对 12 项基于人群的队列研究（共 2280 万受试者，中位随访 10 年）的 meta 分析进一步证实，T2DM 使严重肝脏事件的风险增加 2.25 倍（HR：2.25，95% CI：1.83–2.76，P<0.001），致死性肝脏事件风险升高 63%[4]。这种双向促进关系构成了“糖肝共病”的临床核心特征：NAFLD 通过胰岛素抵抗和肝源性因子释放增加 T2DM 发病风险，而 T2DM 则通过加重脂代谢紊乱和炎症微环境加速肝脏病变进展[5][6]。
  2023 年，三大国际肝病学会联合发布多学会 Delphi 共识声明，正式将 NAFLD 更名为代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），将 NASH 更名为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）[7]。这一命名更新的核心依据在于：代谢功能障碍（包括胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱和肥胖）是驱动疾病发生发展的根本病理基础。2024 年 6 月，欧洲肝病学会（EASL）、欧洲糖尿病学会（EASD）和欧洲肥胖学会（EASO）联合发布了新版MASLD 管理临床实践指南，将 T2DM 列为脂肪性肝病进展的关键驱动因素和首要筛查对象，推荐对所有 T2DM 患者进行 MASLD 及纤维化风险的系统评估[8]。该指南基于牛津循证医学中心标准，共推出 72 项推荐意见和 33 项声明，标志着 MASLD 的临床管理进入了以代谢调控为核心的精准防治时代[8]。
  在发病机制层面，NAFLD 的病理生理认知已从经典的“二次打击”模型演进为“多因素并行打击”模型[9]。传统"二次打击"模型将胰岛素抵抗驱动的肝脏脂质沉积视为"第一打击"，将氧化应激和炎症反应介导的肝细胞损伤视为“第二打击”[9]。然而，近十年的研究表明，NAFLD 的发生发展是多种损伤因素协同作用的结果，包括胰岛素抵抗与脂毒性、内质网应激、线粒体功能障碍、肠道菌群紊乱、免疫炎症激活及遗传易感性等因素并行交织、相互放大[10]。在这一框架下，胰岛素信号与脂质代谢通路的交互紊乱成为连接糖代谢异常与肝脏病变的核心环节。肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官，在胰岛素抵抗状态下出现代偿性高胰岛素血症，一方面通过持续激活 AKT-mTORC1-SREBP1c 信号轴促进肝脏从头脂肪合成（DNL），另一方面因 AKT 对 FOXO1 的抑制减弱导致糖异生失调，形成"糖脂代谢双紊乱"的恶性循环[11][12]。
mTOR（雷帕霉素靶蛋白）是细胞代谢的中枢调控激酶，以 mTORC1 和 mTORC2 两种复合体形式协调营养感知、胰岛素信号、脂质合成与自噬等关键生命过程[13]。在肝脏代谢调控中，mTORC1 通过多条下游通路实现对脂质稳态的精密控制：①通过 S6K 介导的 SREBP1c 切割与激活促进 DNL 关键酶（FASN、ACC 等）的转录；②通过 PPARα调控脂肪酸氧化；③通过 ULK1 磷酸化抑制自噬流，减少肝细胞内脂质清除[14]。值得注意的是，近年来研究表明 mTORC1 在 NAFLD 中具有双向调控特征——除促进脂质合成外，肝脏 mTORC1 的度激活可通过上调磷脂酰胆碱合成酶 CCTα促进 VLDL-TAG 分泌，发挥脂质输出的保护性作用[15]。Gosis 等（2022）在 Science 发表的研究进一步揭示了 mTORC1 的非经典调控分支：选择性抑制 mTORC1-RagC/D-FLCN-TFE3 信号轴可在不影响 p70S6K 活性的情况下抑制 SREBP1c 加工和 DNL，为 NAFLD 的靶向治疗提供了新策略[16]。在 NAFLD 向 NASH 进展过程中，mTORC1 活性呈现动态变化——早期脂肪变性阶段 mTORC1 活性升高以支持脂质合成和分泌，而在晚期炎症纤维化阶段mTORC1 活性下降，导致 VLDL 分泌障碍和脂毒性加剧。
  mTORC2 同样在肝脏糖脂代谢中发挥关键作用。mTORC2 通过直接磷酸化 AKT 的Ser473 位点实现 AKT 的完全活化，进而调控 FOXO1 依赖性糖异生抑制和 SREBP1c 诱导的脂肪生成[17]。研究表明，肝脏特异性敲除 mTORC2 关键组分 Rictor 可损害 AKT信号，导致胰岛素抵抗和葡萄糖耐量异常，但 paradoxically 降低 SREBP1c 活性和肝脏脂肪变性[18]。此外，Sestrin2 被证实可通过 SESN2-GATOR2-mTORC2 复合物间接激活AKT，进而抑制 LXRα-SREBP1c 轴，减少肝脏脂质沉积[19]。这些发现揭示了
mTORC1/mTORC2 平衡在维持肝脏代谢稳态中的核心地位。
  本团队前期 Bulk GSEA 分析显示，T2DM 肝组织中 MTORC1_SIGNALING（NES=1.41）、PI3K_AKT_MTOR（NES=1.37）、GLYCOLYSIS（NES=1.33）等代谢程序呈方向性上调，单细胞通路评分进一步证实 mTOR 通路活性随NAFLD 分期（健康→NAFLD→NASH→肝硬化）呈梯度变化（P<0.0001），提示 mTOR 相关通路是连接糖脂代谢紊乱与肝脏病变进展的重要机制交汇点。然而，该通路在糖肝共病中的上游遗传调控因子和下游效应靶点仍不清楚，亟待通过整合遗传因果推断与细胞功能验证予以系统解析。
2.2 候选靶点 SUGP1 与 KL 的生物学基础
SUGP1 编码含 SURP 和 G-patch 结构域的 RNA 结合蛋白，参与 pre-mRNA 剪接调控。SUGP1 于 2003 年首次被鉴定为 pre-mRNA 剪接因子，其 C 端含有 SURP 基序和G-patch 结构域，提示其具有 RNA 结合功能[22]。SUGP1 与 TM6SF2 均位于 19 号染色体的 NCAN 基因座，该区域多个 SNP 与血浆脂质浓度、肝脏脂肪变性、小叶炎症和纤维化显著相关[24]。特别是 rs10401969（SUGP1 第 8 内含子区）与肥胖患者和 NAFLD 患者的肝脏脂质含量强相关[23]。Kim 等发现 rs10401969 导致 SUGP1 mRNA 通过无义介导的降解途径降解，SUGP1 过表达可增加小鼠血浆胆固醇水平；相反，SUGP1 敲低促进HMGCR 的可变剪接，降低胆固醇合成并增加 LDL 摄取[25]。这些结果与 SUGP1 的可变剪接功能及其在脂质代谢中的作用一致。SUGP1 功能缺失可加重 SF3B1 剪接体基因突变引起的剪接缺陷，表明 SUGP1 的病理作用可能与可变剪接失调密切相关[26]。Zhang 等进一步证实，SUGP1 通过其 G-patch 结构域招募 DEAH-box RNA 解旋酶 DHX15 至 U2snRNP 并激活其 ATP 水解活性，在分支位点识别的最早期阶段发挥关键作用[27]。RNA剪接失调已被证实参与胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱，SUGP1 可通过调控可变剪接影响MAPK 和 PI3K-AKT 通路关键节点的异构体表达，但其在 T2DM-NAFLD 共病中的表达特征和功能意义尚未见报道[28][29]。
  KL 基因编码的 Klotho 蛋白在肝脏中高表达，具有多重代谢保护功能。Klotho 蛋白以膜结合型和可溶性（sKL）两种形式存在，主要在肾脏和肝脏表达[30]。Zheng 等的研究阐明，sKL 可通过调控 IGF1R/PI3K/AKT/mTORC1/PPARα信号轴改善 T2DM 的肝脏糖脂代谢稳态，提示 sKL 可能是 T2DM 和 NAFLD 进展的潜在治疗靶点[30]。具体而言，sKL与 IGF1 受体相互作用，抑制 PI3K/AKT/mTORC1 信号通路，上调 PPARα表达，从而改善胰岛素敏感性和肝脏糖脂代谢[30]。临床研究显示，KL 基因 rs495392 多态性与NAFLD 患者严重脂肪变性的低风险相关，提示 Klotho 对肝脂肪变性具有保护作用[31]。此外，Klotho 通过抑制 IGF-1/PI3K-AKT 信号改善胰岛素敏感性，通过调控超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶活性抵抗氧化应激[30]。值得注意的是，β-Klotho（KLB）作为FGF19 和 FGF21 的共受体，已成为 MASLD 的新型治疗靶点——FGF19 和 FGF21 类似物在 MASH 治疗中显示出改善肝脏损伤和代谢的强大疗效[32][33]。然而，Klotho 在T2DM 驱动 NAFLD 进展中的表达变化及其与 mTOR 通路的功能关联尚未被系统研究。FTO 和EIF2S2 在本团队前期 pseudobulk 分析中分别为 P=0.71 和 P=0.21，作为Tier 2 探索性候选基因保留。FTO（脂肪量和肥胖相关基因）编码 m⁶A 去甲基化酶，在肝脏中高表达，其表达水平受循环葡萄糖和脂质的代谢信号调控[34]。肝脏 FTO 过表达与糖异生关键基因（G6PC、PCK1）上调相关，促进肝脏葡萄糖产生并降低胰岛素敏感性[34]。NAFLD 患者肝脏 FTO 表达升高，与脂质积累增加和脂肪酸合成促进相关[35]。EIF2S2（真核翻译起始因子 2 亚基β）在肝细胞癌中可见 mRNA 上调[36]，其在 NAFLD中的角色有待进一步探索。
2.3 现有研究空白与本项目切入点
  综上，当前 T2DM-NAFLD 共病研究存在以下关键空白：第一，缺乏从遗传因果到细胞功能的连续证据链——现有研究多停留在单一组学层面的关联分析，MR 发现的候选基
因往往缺乏下游的转录组验证和细胞功能实验；第二，单细胞候选基因筛选中 pseudobulk策略应用不足——多数研究仍以 cell-level 差异分析为主，假阳性控制不严格，导致候选基因的可靠性存疑；第三，SUGP1 和 KL 在糖肝共病中的功能角色及其与 mTOR 通路的关联尚未被系统研究——尽管 SUGP1 的脂质代谢调控作用和 Klotho 的代谢保护功能已有个别报道，但二者在 T2DM-NAFLD 共病背景下的表达变化、细胞类型特异性分布及与mTOR 通路的交互作用仍是未知领域；第四，中药天然产物筛选缺乏多组学证据约束——传统网络药理学预测靶点过多且缺乏实验验证，导致后续活性筛选的精准性受限。
  本项目拟以两样本 MR 遗传因果线索为起点，整合 Bulk 转录组验证、单细胞定位及患者水平 pseudobulk 筛选，锁定 SUGP1 和 KL 为核心候选靶点，解析其与 mTOR 相关代谢通路的并行机制关系，并通过多组学证据约束的天然产物反向筛选与 HepG2/LX2 细胞模型验证，为"糖肝同调"的中西医结合防治策略提供从遗传到细胞、从靶点到干预的完整证据链。
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（1）遗传因果驱动的多层筛选体系。
以两样本 MR 为起点，依次经 Bulk 转录组验证、单细胞定位和患者水平 pseudobulk 筛选，逐层收缩候选基因范围，较常规单组学差异筛选具有明确的因果推断起点和可追溯的证据链。
（2）患者水平 pseudobulk 策略克服单细胞伪重复。
不以单个细胞为统计单位，而是以患者为统计单位进行肝细胞 pseudobulk 聚合分析，遵循 Murphy（2022）和 Nguyen（2023）等国际方法论共识，在此基础上建立 Tier 1/Tier 2 候选基因分层体系。
（3）并行机制模型替代线性调控假说。
提出 SUGP1（翻译起始支路）—KL（代谢保护维度）—mTOR 通路（营养感知枢纽）三线并行模型，而非简单表述为“候选基因调控mTOR 通路”，更真实地反映代谢性共病的多因素并行打击特征。
（4）多组学证据约束的天然产物反向筛选。
以 MR 遗传线索、转录组验证和 pseudobulk筛选结果为约束条件开展网络药理学和分子对接，解决传统网药靶点过宽、机制泛化的问题，实现”数据驱动”而非”数据库驱动”的活性成分发现。
（5）HepG2/LX2 双模型验证闭环。
覆盖脂质沉积（HepG2 代谢模型）和纤维化（LX2星状细胞模型）两个关键病理环节，形成”候选靶点—代谢通路—天然产物—细胞表型”的完整验证链。

5.1 技术路线
本项目以 T2DM→NAFLD 的遗传因果线索为起点，整合两样本孟德尔随机化分析、SNP 邻近候选基因注释、Bulk 转录组验证、单细胞转录组定位、患者水平 pseudobulk 筛
选及 mTOR 相关通路解析，进一步结合天然产物反向筛选、分子对接和 HepG2 高糖联合棕榈酸模型进行功能验证，构建”遗传线索—多组学验证—通路机制—天然产物干预”的
研究体系。
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图 1 技术路线图
5.2 拟解决的问题
本项目拟重点解决以下问题：
（1）T2DM 是否对脂肪性肝病进展具有稳定遗传支持；
（2）哪些候选基因能够同时获得 Bulk、单细胞定位和患者水平分析的共同支持；
（3）mTORC1、PI3K-AKT-mTOR、糖脂代谢等通路是否参与糖肝共病进展；
（4）SUGP1、KL、FTO 等候选基因与 mTOR 相关代谢通路之间是否存在可验证的功能联系；
（5）如何以多组学证据约束天然产物反向筛选，提高中药活性成分发现的精准性和可验证性。
5.3 预期成果
本项目预期形成：
（1）T2DM→NAFLD 两样本 MR 分析和 SNP 邻近候选基因注释结果；
（2）GSE15653 Bulk 转录组和 GSE202379 单细胞转录组整合分析结果；
（3）SUGP1、KL 为核心的患者水平候选基因筛选结果；
（4）mTORC1、PI3K-AKT-mTOR、糖酵解、脂肪酸代谢及脂肪生成等通路的 GSEA 分析结果；
（5）候选天然活性成分筛选和分子对接结果；
（6）HepG2 高糖高脂模型下候选基因、候选化合物及 mTOR 相关指标的功能验证数据；
（7）完整的研究图表、计算代码、技术报告和生物医学类论文 1 篇。
前期基础 2025.09–2026.05
已完成 MR、Bulk、scRNA 初步分析及课题设计
第一阶段 2026.06–2026.12
完善 pseudobulk、GSEA 分析，确立候选机制模型及结果图表打磨
第二阶段 2027.01–2027.08
开展全面天然产物反向筛选、构建成分-靶点-通路网络及分子对接计算
第三阶段 2027.09–2028.02
细胞脂毒性模型构建，完成候选靶点、通路及天然产物干预的功能验证
第四阶段 2028.03–2028.06
数据全面整合、结题报告撰写、SCI 论文初稿成文与答辩材料准备
7.1 数据与分析基础
本项目已完成 T2DM-NAFLD 糖肝共病全部公开数据的收集、预处理和核心分析。
(1) GWAS 与 MR 分析：已获取 IEU OpenGWAS（T2DM 暴露数据）和 FinnGen（NAFLD 结局数据），完成 118 个 harmonised SNPs 的工具变量筛选（最小F=29.9）、LD clumping、等位基因协调及 IVW/MR-Egger/加权中位数敏感性分析（见图 2）。
(2) Bulk 转录组：基于 GSE15653 肝组织数据，完成 limma 差异分析，获得 3,745 个DEGs（1,823 上调/1,922 下调），完成 18 个 MR 候选基因与 DEG 列表的交叉验证
（见图 3）。
(3) 单细胞转录组：基于 GSE202379 数据（99,809 个细胞），完成 Harmony 整合、Seurat 降维聚类及 10 种肝脏细胞类型注释，完成候选基因在不同细胞类型和 NAFLD
分期中的表达定位（见图 4）
(4) 患者水平 pseudobulk 筛选：以肝细胞为重点，采用 Pseudobulk 将同一患者来源的肝细胞表达按基因加和聚合，以患者而非单个细胞为统计单位，通过 limma-trend 比较不同分期间的候选基因表达差异。基于 pseudobulk 结果建立 Tier 1（患者水平P<0.05 且方向一致）/Tier 2（cell-level 有信号但患者水平未达显著）候选基因分层体
系见（图 5）。
(5) Bulk GSEA 分析和候选基因-通路关联分析：计算 SUGP1/KL/FTO 表达量与各mTOR 分支通路评分的 Spearman 相关系数，构建了“SUGP1（翻译起始支路）—KL（独立代谢适应）—mTOR 代谢通路（营养感知枢纽）”的并行机制模型（见图 6 图7）。
(6) 部分候选成分选择：通过中药数据库通过靶点反向挖掘相关中药化合物，依据 OB、DL 值 5 进行筛选后得到部分候选成分化合物，随后通过 autodock vina 软件进行软
对接，得到部分具有良好结合能的候选化合物（图 8）。
(7) 分析环境：已搭建 R/Bioconductor 生信分析环境（TwoSampleMR、limma、Seuratv5、Harmony、clusterProfiler、fgsea、ggplot2 等），后续分子对接拟使用 AutoDock
Vina、TCMSP、SwissTargetPrediction 等。
7.2 已完成的核心成果
MR 分析
T2DM→NAFLD IVW OR=1.210（P=0.040），MR-Egger intercept P=0.447，无显著方向性多效性
SNP 邻近注释
18 个候选基因（SUGP1/KL/FTO/EIF2S2 等），统一表述为”SNP 邻近候选基因”
Bulk 验证
4/18 候选基因存在差异表达；FTO logFC=-0.924（纠正为下调）
scRNA
定位10 种细胞类型，肝细胞占 69.6%，完成候选基因UMAP 表达定位
Pseudobulk（59 例）
Tier 1: SUGP1（P=0.0003）、KL（P=0.008）；
Tier 2: FTO（P=0.71）、EIF2S2（P=0.21）
GSEA
MTORC1_SIGNALING NES=1.41、PI3K_AKT_MTOR NES=1.37、GLYCOLYSISNES=1.33 等方向性上调
候选基因-mTOR 关联
SUGP1 关联 translation initiation 支路；FTO 关联
PI3K-AKT-mTOR 支线；KL 无 mTOR 特异性关联
图表
已生成 MR/Bulk/scRNA/pseudobulk/GSEA 全套结果图
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图 2 MR 分析及 SNP 邻近候选基因注释.(A)不同 MR 方法评估 T2DM 对 NAFLD 的潜在遗传因果效应，IVW 结果提示 OR=1.210，P=0.0401。(B)MR 散点图显示 118 个 harmonised SNPs 的暴露效应与结局效应分布。(C)基于 MR 工具变量进行 SNP 邻近基因注释，共获得 18 个 SNP 邻近候选基因。该结果作为后续多组学验证的遗传学线索，不直接等同于确定因果基因。
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图 3 Bulk 转录组差异分析及候选基因验证.(A)GSE15653 肝组织转录组差异表达火山图，共识别 3,745个差异表达基因，其中 1,823 个上调、1,922 个下调。(B)差异表达基因数量统计。(C)18 个 SNP 邻近候选基因与 Bulk 差异表达结果交叉验证，显示 4/18 个候选基因具有组织水平表达证据。(D)FTO 探针
209702_at 在 Bulk 数据中呈下调方向，logFC=-0.924，P=0.013。
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图 4 单细胞图谱及候选基因表达定位.(A)GSE202379 单细胞数据按细胞类型展示的 UMAP 图。(B)不同疾病分期样本在 UMAP 空间中的分布。(C)主要肝脏细胞类型组成，提示肝细胞为主要细胞群体。(D)SUGP1、KL、FTO 和 EIF2S2 在不同细胞类型中的表达分布。单细胞结果主要用于细胞定位和表达描述，候选基因优先级以后续患者水平 pseudobulk 分析为主要依据。
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图 5 患者水平 pseudobulk 候选基因筛选.(A)基于 59 例患者肝细胞聚合表达的 pseudobulk 分析结果。红色表示患者水平支持较强的 Tier 1 候选基因，灰色表示探索性 Tier 2 候选基因。(B)SUGP1 在不同NAFLD 分期中的表达变化，患者水平分析显示显著差异，P=0.0003。(C)KL 在不同 NAFLD 分期中的表达变化，患者水平分析显示显著差异，P=0.008。该图支持将 SUGP1 和 KL 作为本项目优先验证的核心候选基因。
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图 6 mTOR 相关通路及 Bulk GSEA 分析.(A)单细胞通路评分显示 mTOR pathway score 在 NAFLD 不同分期中存在显著变化，P<0.0001。(B)Bulk Hallmark GSEA 显示 T2DM 肝组织中 ADIPOGENESIS、MTORC1_SIGNALING、PI3K_AKT_MTOR、GLYCOLYSIS 和 FATTY_ACID_METABOLISM 等代谢程序呈方向性上调，E2F_TARGETS 呈下调趋势。(C)多通路活性热图展示 mTOR signaling、insulin signaling、glycolysis、fatty acid metabolism、ECM organization 等通路在不同疾病阶段的变化趋势。该结果支持 mTOR 相关代谢通路作为糖肝共病进展的重要机制方向。
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图 7 候选基因与 mTOR 相关分支的探索性关联.(A)候选基因与 mTOR 相关分支通路的 Spearman 相关性分析，显示部分候选基因与 PI3K-AKT-mTOR、MTORC1、translation initiation 等分支存在相关趋势。(B)SUGP1 与 translation initiation score 的相关性分析，提示其可能与翻译起始相关功能分支有关。(C)FTO 与 PI3K-AKT-mTOR score 的相关性分析，提示其可能与 PI3K-AKT-mTOR 探索性支线相关。上述结果仅代表探索性关联，不能证明候选基因直接调控 mTOR 通路，需在后续细胞实验中进一步验证。

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图 8.候选化合物与关键靶点对接结合能得分热图.候选化合物与部分关键靶点结合能均低于-7.0kcal/mol，表明具有良好的结合性，该批化合物可以作为后续研究的重点化合物进行验证。

（1）具备高通量计算的条件，组内成员熟练掌握生物信息学相关操作，熟练使用R语言进行分析绘图

（2）组内条件充足，具备细胞实验等验证手段的基础平台

（3）缺少实际细胞层面的验证信息，后续进行细胞实验进行机制探究以及确定

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 开展实验 5000.00 15000.00
1. 业务费 10000.00 进行研究需要的业 务费用 3000.00 7000.00
（1）计算、分析、测试费 4000.00 购买高通量计算服 务器 2000.00 2000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 2000.00 参加省内或国内学 术会议的交通与住 宿费用 1000.00 1000.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 4000.00 论文撰写、图表整 理、语言润色及成 果发表相关费用论文撰写、图表整 理、语言润色及成 果发表相关费用 0.00 4000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 10000.00 细胞培养试剂及相 关功能验证实验的 耗材 2000.00 8000.00
结束

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