1.微生物群落演替在腐败尸体PMI推断中的可行性
宿主死亡后与其相伴的微生物群落被称为 “死亡微生物组”[1],这种微生物群落在分解过程中起着至关重要的作用，它是死亡生物体内外微生物群落演替的特征体现[2]，同时法医微生物学也被认为是法医调查中预测PMI的一种有前景的工具[3]，Metcalf等[4]证实尸体腐败过程中微生物群落演替演替是显著的、可测量的和可重复的，进一步推动了法医微生物学发展。Payne根据尸体腐败程度将腐败尸体分为6个阶段（新鲜期、肿胀期、快速腐败期、高度腐败期、干化期以及白骨化期），随着尸体腐败程度的进一步加深，微生物群落演替也会产生变化（葡萄球菌→大肠菌群→厌氧菌混合种群）。
不同微生物种类在尸体腐败的不同阶段分别占据主导地位，反映了资源和环境条件的变化。例如，新鲜期的腐败分解开始于皮肤、口腔、胃肠道等部位的本土微生物，如大肠杆菌(Enterobacteriaceae)，王萌萌等还发现拟杆菌门（Bacteroides)和厚壁菌门(Firmicutes）也在早期分解阶段占优势[5]；随着腐败的进行，气体积累导致尸体膨胀，梭菌属微生物增殖，参与腐败分解过程[6]。在快速腐败阶段，腐败液泄漏形成尸体分解岛（CDI），需氧条件下的微生物如芽孢杆菌（Bacillus）和假单胞菌属(Pseudomonas）变得常见。随着尸体腐败的进一步发展，其他微生物如黄杆菌属（Flavobacterium）可能变得更加突出，真菌如曲霉属(Aspergillus)、青霉属（Penicillium)和念珠菌（Candida)属在膨胀和腐烂阶段占主导地位[7]。在白骨化阶段中，外界环境微生物可以和尸体原生微生物相互发生共生作用或竞争作用，土壤类型和温湿度等环境因素会影响遗骸上的微生物群落。
赵兴春等人将尸体腐败过程中腹腔自然破裂这一关键事件，作为腐败程度划分以及死亡时间推断的关键节点，称为“破溃点”[8]，其作为微生物菌群结构变化（需氧微生物的快速增殖,如Bacillus、Pseudomonas、Proteus[9, 10]）等表征构建PMI推断模型时的分界点，能够分段构建模型以提升本实验PMI推断模型的准确度。随着高通量测序与人类微生物组计划（HMP）的发展，提出可以将零散的人体死后微生物组研究逐渐扩展到人体死后微生物组计划（Human Postmortem Microbiome Project，HPMP）。
2.腐败尸体中微生物群落演替的影响因素
1)土壤对微生物群落演替的影响
微生物群落在不同地理上有显著差异。两个土壤群落相距越远，即使在相同的土壤类型中，它们的差异也就越大[11]。宋国庆等[12]发现上海不同环境（草地、树林、沙滩）微生物群落差异显著，若尸体暴露于草地环境中，酸杆菌门可能通过分解植物残留物加速腐败，而在树林环境中，变形菌门（Proteobacteria)可能因适应高有机质环境而主导分解过程；此外刘文丽等[13]指出黑龙江、青海、西藏土壤微生物多样性递减，虽然各省份的土壤中均含有变形菌门Proteobacteria)、放线菌门（Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria），但各门类的细菌分布存在显著差异。这种地理特异性表明，尸体腐败的微生物群落可能携带地域“指纹”，可为死亡地点或尸体迁移路径推断提供依据；此外MetaSUB联盟[14]证实全球城市微生物群落具有地理特异性（如纽约地铁微生物异于香港和波士顿等）。
尸体在土壤中埋藏深度的不同也可以显著影响死后群落微生物的演替与组成。王雅雅等[15]对埋葬于深度20cm的土壤中的大鼠腐败尸体进行16SrRNA基因测序及数据分析，利用机器学习算法构建了预测死亡时间的随机森林模型。另有研究通过分析尸体分解过程中土壤微生物的变化，尸体分解导致土壤碳和养分（尤其是氨）的脉冲式变化，并刺激了微生物活动。细菌总丰度没有变化，但我们观察到微生物功能和群落组成都发生了明显变化，在活跃分解期（死后7 - 12天），呼吸作用和生物量产生速率较高，群落主要由变形菌门（Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes）主导，酸杆菌门(Acidobacteria）的丰度降低。一旦分解速率放缓（死后10 - 23天），呼吸作用仍然较高，但生物量产生速率急剧下降，这种生长效率较低的群落主要由厚壁菌门和其他厌氧类群主导，这些现象表明尸体腐败分解显著改变了土壤微生物的组成[16]。而在白骨化阶段，变形菌门在墓土中的丰度相对较低，而延长埋葬时间时，所有层中微生物多样性的缺乏变化，尸体、死尸和土壤之间的内源微生物交换已经停止。这些结果为土壤微生物演替变化提供了确凿的证据，并将用于估计PMI[17]。
2)水域对微生物群落演替的影响
水域环境对腐败或溺死尸体微生物群落的演替具有显著影响，不同水域（如淡水、海水或河流）具有独特的微生物组成，在池塘中厚壁菌门(Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroides)先增加然后减少，而厚壁菌(Firmicutes）在整个分解过程中占据主导地位[18]；淡水溪流微生物群落演替中发现变形杆菌(Proteus）在分解早期占主导地位，而厚壁菌(Firmicutes）在夏季月份浸没 21 天后占主导地位[19]，海洋腐肉微生物群落以变形杆菌、拟杆菌和厚壁菌为主[20]。据此，可通过对微生物组成进行16S rRNA测序结合随机森林模型精准定位溺死地点，有效缩小排查范围。此外人体溺亡后，肠道菌群剧烈变化，对此张福元等人[21]通过随机森林(RF)算法建立了回归模型，对比分析了溺水组和死后浸泡组肠道细菌群落的时间变化，得出肠道微生物群落演替将是估计水生栖息地中尸体的死后浸泡间隔（PMSI）的一个有价值标记的结论，提出了肠道菌群演替对从水中打捞的尸体进行法医调查的潜在用途（如Firmicutes和Proteobacteria的相对丰度随死亡时间（PMI）延长呈显著变化，Firmicutes在腐败后期占主导，而Proteobacteria在早期分解阶段更丰富）。同时环境参数也会影响水中的腐败过程同时伴随着微生物群落的变化如水温、盐度、溶解氧等因素，例如珠江入海口耐盐菌（Rhodobacteraceae）富集[22]，水流速度和水体营养状态也可能通过改变微生物的扩散和竞争关系影响群落结构[23]。微生物群落分析为法医学提供了多维度证据，包括溺死地点推断、死亡时间估算和生前溺水诊断。然而，当前研究仍面临挑战，如水体流动性导致的微生物标志物时空异质性，以及内源性菌群与外来微生物的相互作用机制尚未完全明确。未来需结合宏基因组学、代谢组学及环境参数监测等相关技术，系统解析微生物群落演替的驱动机制，并开展人体样本验证研究，优化检测技术，推动微生物证据在法医学实践中的标准化应用。
3.毒（药）物对微生物群落演替的异质性
因毒（药）物死亡的尸体与自然死亡的尸体在微生物群落的组成和演替过程中存在显著差异。不同类型的毒物通过不同的机制影响尸体的腐败过程及微生物群落的变化。常见的毒物包括化学毒物、药物和毒气等，它们不仅直接作用于尸体内部的生理过程，还间接影响微生物的生长环境。
化学毒（药）物（如农药、重金属或工业化学品等）可能抑制或改变微生物的生长模式，改变特定微生物的丰度，进而改变腐败速率。研究表明，有机磷农药对微生物群落的演替会产生影响，好氧细菌如假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas)、硫杆菌属(Thiobacillus)和不动杆菌属(Acinetobacter)在表层土壤中相对丰度较高，因为它们代谢和降解有机磷农药需要氧气；而兼性厌氧细菌如乳杆菌属（Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)在深层土壤中也能保持一定丰度，它们可以在有氧和无氧环境下生存[24]，Xia等人发现小菜蛾（Plutella xylostella）中肠微生物群在接触敌百虫后，变形菌门（Proteobacteria)的比例降低，而厚壁菌门(Firmicutes）和乳杆菌目（Lactobacillales)的比例升高[25]。Chen等人基于敌敌畏中毒研究了肉鸡盲肠菌群的变化，研究发现放线菌属(Actinomycetes)、酸杆菌属（Acidobacterium)、不动杆菌属（Acinetobacter)等29种属在敌敌畏处理组盲肠中的相对丰度显著降低，而志贺氏菌属（Shigella)、巴奈氏菌属（Barnetella)和链霉菌属（Barnetella)等14种属的相对丰度显著增加[26]。至于重金属，Abdu等人经研究发现重金属对土壤微生物的影响具有两面性。一方面，高浓度重金属会抑制土壤微生物的生长、降低其多样性和活性，影响微生物的代谢和功能，甚至导致微生物死亡；另一方面，某些土壤微生物（如假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、链霉菌、曲霉和节杆菌）能够适应并利用重金属，参与重金属的转化和固定过程，在生物修复中发挥重要作用[27]。Sun等人证实对于果蝇及其后代，铅暴露也会导致肠道菌群组成的显著改变，其中乳杆菌（Lactobacillus)和双歧杆菌（Bifidobacterium)两属的比例显著降低[28]。对于抗生素而言，也会影响生物体内以及环境中的微生物群落演替，其直接针对构成微生物组的微生物，即使某些抗生素的浓度很低，动物肠道微生物组的组成也可能发生变化，同时Cerqueira等人发现经抗生素处理过的土壤中β变形菌门（Betaproteobacteria)的相对丰度明显增加、鞘氨醇单胞菌属相对丰度降低[29]。据Barak等人研究表明，工业废水的排放可显著驱动受体环境微生物群落结构重构，如无色杆菌属（Achromobacter)、不动杆菌属（Acinetobacter）、盐单胞菌属（Halomonas）、假单胞菌属（Mononas）等微生物的丰度变大[30]。而本课题研究的溴敌隆（Bromadiolone）具有高脂溶性与生物富集性，导致误食、自杀及投毒等引发的中毒及死亡率较高[31]，如在我国有关溴敌隆急性中毒的死亡率通常10%-15%，儿童误食的死亡率可达7%-10%[32]，但是对于溴敌隆暴露后对微生物群落演替规律影响及其在PMI推断中的应用研究尚显不足。
综上所述，本课题拟建立在溴敌隆暴露下的腐败尸体微生物群落演替-PMI关联模型，阐明溴敌隆影响微生物群落演替过程的规律，从微生物的角度探究其在PMI推断中的可行性，以实现溴敌隆中毒腐败尸体PMI推断的快速化和高效化，旨在填补溴敌隆暴露后对微生物群落演替规律影响及其在PMI推断中的空白。
参考文献
[1] JAVAN G T, FINLEY S J, ABIDIN Z, et al. The Thanatomicrobiome: A Missing Piece of the Microbial Puzzle of Death [J]. Front Microbiol, 2016, 7: 225.
[2] JAVAN G T, FINLEY S J, SMITH T, et al. Cadaver Thanatomicrobiome Signatures: The Ubiquitous Nature of Clostridium Species in Human Decomposition [J]. Front Microbiol, 2017, 8: 2096.
[3] METCALF J L. Estimating the postmortem interval using microbes: Knowledge gaps and a path to technology adoption [J]. Forensic Sci Int Genet, 2019, 38: 211-8.
[4] METCALF J L, WEGENER PARFREY L, GONZALEZ A, et al. A microbial clock provides an accurate estimate of the postmortem interval in a mouse model system [J]. Elife, 2013, 2: e01104.
[5] 王萌春. 利用微生物群落演替规律预测大鼠尸体埋葬时间的探索研究 [D], 2021.
[6] CARTER D O, YELLOWLEES D, TIBBETT M. Cadaver decomposition in terrestrial ecosystems [J].Naturwissenschaften, 2007, 94(1): 12-24.
[7] METCALF J L, XU Z Z, WEISS S, et al. Microbial community assembly and metabolic function during mammalian corpse decomposition [J]. Science, 2016, 351(6269): 158-62.
[8] 赵兴春, 杨帆, 胡胜, et al. “破溃点”——尸体腐败过程中腹腔自然破裂时刻的实验研究 [J].中国法医学杂志, 2024, 39(01): 68-74.
[9] Metcalf JL, Xu ZZ, Weiss S, et al. Microbial community assembly and metabolic function during mammalian corpse decomposition. Science. 2016;351(6269):158-162.
[10] HYDE E R, HAARMANN D P, LYNNE A M, et al. The living dead: bacterial community structure of a cadaver at the onset and end of the bloat stage of decomposition [J]. PLoS One, 2013, 8(10): e77733.
[11] HABTOM H, PASTERNAK Z, MATAN O, et al. Applying microbial biogeography in soil forensics [J]. Forensic Sci Int Genet, 2019, 38: 195-203.
[12] 宋国庆, 曹禹, 李辉, et al. 16S rRNA基因测序在法医学中的研究进展 [J]. 法医学杂志, 2018, 34(05): 542-8.
[13] 刘文丽, 程凤, 钱嘉林, et al. 基于土壤宏基因组分析的法医学个体来源地理位置推断 [J]. 法医学杂志, 2021, 37(03): 366-71+77.
[14] The Metagenomics and Metadesign of the Subways and Urban Biomes (MetaSUB) International Consortium inaugural meeting report [J]. Microbiome, 2016, 4(1): 24.
[15] 王雅雅, 张君, 余代静, et al. 基于埋葬大鼠的骨骼微生物群落演替规律推断死亡时间 [J]. 中国法医学杂志, 2023, 38(05): 541-5.
[16] COBAUGH K L, SCHAEFFER S M, DEBRUYN J M. Functional and Structural Succession of Soil Microbial Communities below Decomposing Human Cadavers [J]. PLoS One, 2015, 10(6): e0130201.
[17] THOMAS T B, FINLEY S J, WILKINSON J E, et al. Postmortem microbial communities in burial soil layers of skeletonized humans [J]. J Forensic Leg Med, 2017, 49: 43-9.
[18] KASZUBINSKI S F, RECEVEUR J P, WYDRA B, et al. Cold Case Experiment Demonstrates the Potential Utility of Aquatic Microbial Community Assembly in Estimating a Postmortem Submersion Interval [J]. J Forensic Sci, 2020, 65(4): 1210-20.
[19] BENBOW M E, PECHAL J L, LANG J M, et al. The Potential of High-throughput Metagenomic Sequencing of Aquatic Bacterial Communities to Estimate the Postmortem Submersion Interval [J]. J Forensic Sci, 2015, 60(6): 1500-10.
[20] DICKSON G C, POULTER R T, MAAS E W, et al. Marine bacterial succession as a potential indicator of postmortem submersion interval [J]. Forensic Sci Int, 2011, 209(1-3): 1-10.
[21] ZHANG F, WANG P, ZENG K, et al. Postmortem submersion interval estimation of cadavers recovered from freshwater based on gut microbial community succession [J]. Front Microbiol, 2022, 13: 988297.
[22] 向青青, 陈立方, 苏秦, et al. 微生物群落演替在死亡时间推断中的研究进展 [J]. 法医学杂志, 2023, 39(04): 399-405.
[23] MU X, ZHANG S, LV X, et al. Water flow and temperature drove epiphytic microbial community shift: Insight into nutrient removal in constructed wetlands from microbial assemblage and co-occurrence patterns [J]. Bioresour Technol, 2021, 332: 125134.
[24] YANG J, LI G, YANG Y. Unraveling soil geochemical, geophysical, and microbial determinants of the vertical distribution of organic phosphorus pesticide pollutants [J]. Environ Pollut, 2024, 362: 124946.
[25] XIA X, ZHENG D, ZHONG H, et al. DNA sequencing reveals the midgut microbiota of diamondback moth, Plutella xylostella (L.) and a possible relationship with insecticide resistance [J]. PLoS One, 2013, 8(7): e68852.
[26] CHEN J, ZHANG Y, JIANG C, et al. Dichlorvos poisoning caused chicken cerebellar autophagy and changes of Caecal microflora [J]. Poult Sci, 2025, 104(4): 104939.
[27] ABDU N, ABDULLAHI A A, ABDULKADIR A. Heavy metals and soil microbes [J]. Environmental Chemistry Letters, 2016, 15(1): 65-84.
[28] SUN Y, TANG Y, XU X, et al. Lead exposure results in defective behavior as well as alteration of gut microbiota composition in flies and their offsprings [J]. Int J Dev Neurosci, 2020, 80(8): 699-708.
[29] CERQUEIRA F, CHRISTOU A, FATTA-KASSINOS D, et al. Effects of prescription antibiotics on soil- and root-associated microbiomes and resistomes in an agricultural context [J]. J Hazard Mater, 2020, 400: 123208.
[30] BARAK H, BRENNER A, SIVAN A, et al. Temporal distribution of microbial community in an industrial wastewater treatment system following crash and during recovery periods [J]. Chemosphere, 2020, 258: 127271.
[31] BERNY P, VELARDO J, PULCE C, et al. Prevalence of anticoagulant rodenticide poisoning in humans and animals in France and substances involved [J]. Clin Toxicol (Phila), 2010, 48(9): 935-41.
[32] ZHANG S, LI Q L, JIAN X D, et al. [An investigation of a mass incident of bromadiolone poisoning] [J]. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi, 2017, 35(5): 356-7.
