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基于壳聚糖联合免疫策略的 P1a-P30a 重组 BCG 疫苗设计及免疫效应研究

申报人：郭书捷 申报日期：2025-03-27

基本情况

2025创新项目
基于壳聚糖联合免疫策略的 P1a-P30a 重组 BCG 疫苗设计及免疫效应研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生自主选题
二年期
后疫情时代，肺炎支原体感染在部分地区显著反弹，尤其在儿童中高发，且缺乏有效疫苗，防控压力大。本研究基于 BCG 疫苗平台，创新性地融合肺炎支原体 P1 基因的优势免疫区段 P1a（3862-4554 bp ） 与 P30 基 因 的 优 势 免 疫 区 段 P30a （ 49-822bp），构建 P1a-P30a 重组基因，并稳定转化至 BCG 菌株。经Western Blot 验证目的蛋白表达后，利用小鼠感染模型评估疫苗的免疫原性与保护效果。本研究采用“皮下初免+壳聚糖鼻内加强免疫”策略，增强 sIgA 介导的黏膜免疫和系统性免疫应答，提高疫苗的免疫持久性与保护效果。该疫苗不仅保留 BCG 的抗结核功能，同时可增强针对肺炎支原体的免疫保护。本项目创新性地提出基于 BCG 的双效疫苗策略，兼具安全性、黏膜免疫激活及产业化潜力，为呼吸道疫苗研发提供新思路。
自 2024.09 进入济宁医学院病原微生物实验室后，参与一系列实验课题，且熟练掌握多项实验操作。同时 2024 年作为负责人，带领团队参加了第十九届“挑战杯”竞赛，使用“瑞净安康”石墨烯季
铵盐复合消毒剂进行项目展示。
现主持山东省自然基金重点项目、省自然科学基金面上项目、省高等学校科技计划项目多项；各项科研资金总计 30 余万。
指导老师长期从事有关 rBCG 的构建与其免疫学特性的研究，可以给予项目正确有效的帮助。同时其申请的“预防疾病，护佑健康－重组疫苗研究与开发工作坊”已获得学校立项，本申请已获得指导教师的支持与指导。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
郭书捷 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 载体选择和 构建、动物 实验、论文 撰写
宋赛男 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2023 免疫学实验
王俊颖 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 构建重组质粒
韩承霖 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 统计学分析
杨斯童 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 SDS-PAGE 电泳
郝陶然 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 动物实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
薛庆节 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

本研究创新性地基于基因工程策略，利用大肠杆菌-BCG 穿梭分泌表达载体 pMV261 构建融合肺炎支原体（MP）免疫优势抗原 P1a 和 P30a 序列的双抗原疫苗，旨在突破目前单一BCG 疫苗的局限性，实现对结核分枝杆菌及 MP 的双重免疫保护，同时联合壳聚糖佐剂优化免疫策略，以增强黏膜免疫应答，提升免疫持久性。研究将通过小鼠动物模型系统评估 rBCG-P1a-P30a 疫苗的免疫原性和保护力，探索其在呼吸道疫苗领域的应用潜力。
2.融合基因 P1a-P30a 的获取
2.1 获取 P1a 和 P30a 基因序列
GenBank 查询 MP M129 株 P1 基因、P30 基因全长序列，选取 P1 基因 3862-4554 位核苷酸和 P30 基因 49-822 位核苷酸序列，分别作为 P1a 基因和 P30a 基因序列，并在 P1a 和P30a 基因后面分别添加 6×His 标签序列。
2.2 引物设计与合成
用Snapgene软件设计分别扩增P1 基因 3862-4554 位核苷酸和P30 基因 49-822 位核苷酸的特异性引物，根据pMV261 载体上的多克隆酶切位点，选择限制性内切酶。为构建P1a-P30a-pMV261 重组质粒，在P1a基因的下游和P30a基因的上游分别插入 1 个linker序列：GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACC
引物设计如下

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注：粗斜体部分为linker序列，下划线部分为酶切位点，酶切位点前为保护碱基。
2.2 目的基因片段扩增与纯化
注：因 P1 基因的 4881 个碱基中，含有 21 个“UGA”密码子，而“UGA”在大肠杆菌和哺乳动物细胞中均为终止密码子，所以一般需要先用 PCR 介导的定点突变将 P1 基因中的TGA 突变为 TGG ，再进行体外扩增。而本课题选取的肺炎支原体 M129 株 P1a（3862-4554bp）、P30a（49-822bp），即下图中所示的 RP14 和 RP30 所对应的序列，其中 RP30 的序列几乎覆盖了 P30 的全长序列，而 RP14 序列的选择则考虑到必须包含 P1 具有强免疫反应性同时介导粘附的区域和位点 ， 且避开了重复序列 RepMP4 、RepMP2/3 和 TGA 密码子，故不需要再单独进行定点突变。
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2.2.1 PCR 体外扩增 P1a 基因

PCR 体外扩增配制体系，液体总量为 50μl，在 0.5mlEp 管中加入：

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反应条件：95℃ 5 min → [95℃ 30s → 58℃ 30s → 72℃ 1 min] ×30 → 72℃ 5 min
2.2.2 P30a 基因扩增
PCR 体外扩增配制体系，液体总量为 50μl，在 0.5mlEp 管中加入：
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反应条件：95℃ 5 min → [95℃ 30s → 62℃ 30s → 72℃ 1 min] ×30 → 72℃ 5 min
2.2.3 PCR 扩增产物纯化及回收
使用 1％琼脂糖凝胶电泳验证 P1a、P30a 基因扩增产物，在紫外透视仪中切下目的基因条带，并使用DNA纯化回收试剂盒对 PCR 产物进行纯化回收，回收步骤具体如
下：
（1）将切碎的目的条带加入 600μl溶胶液，按照每克胶加入 1 ml溶胶液的比例配制，55℃加热溶解 10 分钟。同时，向吸附柱 CA1 加入 500 μl 平衡液Bl，13,000rpm离心 30 秒，弃去废液，以完成柱平衡。
（2）待溶胶液冷却至室温后，将其转移至吸附柱，13,000 rpm 离心 1 分钟。随后，依次加入两次 700μl含乙醇的PWT漂洗液，每次 13,000 rpm 离心 30 秒，弃去废液。
（3）空离 2 分钟后，将吸附柱转移至无菌离心管，开盖晾干 5 分钟。
（4）采用 65℃预热的 30 μl EB洗脱液进行洗脱，分两次悬空滴加，每次静置 2分钟后，以 13,000 rpm离心 2 分钟，合并两次洗脱液。如有需要，可重复洗脱以提高DNA回收率。
2.3 重叠延伸 PCR 构建融合基因 P1a-P30a
2.3.1 重叠 PCR
扩增体系的总体积为（50μl）在 0.5ml Ep 管中加入：
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反应条件：98℃预变性 4min → 98℃变性 10s → 60℃退火 15s → 68℃延伸 1min× 30 → 68℃ 5min（采用热启动法减少引物二聚体的产生）
重叠 PCR 示意图：
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2.3.2 融合基因 P1a-P30a 的纯化与回收
P1a-P30a 基因扩增产物经 1％琼脂糖凝胶电泳纯化后，在紫外透视仪中切下目的基因条带，对 PCR 产物纯化回收。最后通过 Sanger 测序验证读码框及序列准确性。
3.重组质粒 pMV261-P1a-P30a 的构建与鉴定
纯化的 P1a-P30a 基因和 pMV261 质粒用 BamHⅠ和 EcoRⅠ双酶切，将纯化回收的酶切产物用 T4 连接酶连接。
3.1 P1a-P30a和pMV261 载体的双酶切线性化处理
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加入试剂后，振荡混匀后离心至无液体挂壁，放置 37℃ 过夜孵育。
3.2 连接融合基因与载体
同源重组连接反应体系：
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加入试剂后，振荡混匀后离心至无液体挂壁，置于 16℃孵育 4-16h。模板体积按照融合基因酶切产物质量：pMV261 酶切产物质量=5:1 计算。
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pMV261-P1a-P30a 重组质粒示意图
3.3 同源重组产物 DH5α热激发转化及抗性筛选
取出保存在-80°C 的 DH5α感受态细胞，迅速插入冰盒中缓慢融化。将同源重组连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴 30 分钟，随后在 42°C 热激 90 秒，接着冰浴 5 分钟。加入 800 μl 不含抗性的 LB 液体培养基，37°C、160 rpm 振荡培养 60 分钟。取 200 μl 培养液均匀涂布于 LB 固体培养基平板，待表面水分蒸发后盖上盖子，37°C 培养 14 至 18小时，以筛选阳性克隆。
3.4 菌落 PCR-琼脂糖凝胶电泳法阳性克隆分子鉴定
从 LB 平板上挑选 10 个生长出的单克隆菌落，接种至含卡那霉素的 LB 液体培养基中，在 37℃、200 rpm 条件下振荡培养 60 分钟。随后，取 1μl 菌液作为 PCR 模板，使用 P1a-F 和 P30a-R 引物进行扩增，并对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，仅保留出现目标条带的菌株。
3.5 重组质粒的提取与鉴定
3.5.1 质粒提取
离心收集阳性菌体，使用质粒小提试剂盒提取质粒，具体步骤如下：
（1）12,000 rpm 离心 1 分钟收集细菌沉淀。
（2）用 250 μl P1 溶液重悬菌体，充分涡旋至悬浮均匀。依次加入 250μl P2 裂解液轻柔翻转混匀，再加入 350 μl P3 中和液温和翻转 8-10 次，以 12,000 rpm 离心 10 分钟去除沉淀。
（3）将上清转移至 CP3 吸附柱，12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管废液。
（4）PD 去蛋白液 500μl 加入 CP3 吸附柱，12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管废液。
（5）加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心1分钟，后空转2min去除残余漂洗液。
（6）将CP3吸附柱转移至无菌离心管，EB缓冲液洗脱，以12,000 rpm离心2分钟收集质粒。最终，使用分光光度计测定质粒浓度，OD260/280比值应在1.8至2.0之间，分装后置于-20℃保存。
3.5.2 鉴定重组质粒
取 1 μg 质粒，使用 BamHⅠ和 EcoR I 双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳验证载体与插入目的基因片段大小是否正确。随机选取 5 份阳性重组质粒进行测序，以排除移码或点突变。
3.6 扩大培养与质粒纯化
测序比对确认序列正确后，将阳性菌液划线传代纯化，连续纯化两次后，挑取单克隆菌落接种于200 ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。随后，使用质粒大提试剂盒提取高纯度质粒，并置于-20℃保存备用。
4. 重组卡介苗（rBCG）的构建与鉴定
4.1 电转化法构建rBCG
（1）制备 BCG 感受态细胞
BCG 菌株接种于 Middlebrook 7H9 培养基（含 0.05% Tween 80 和 10% ADC），于37℃、200 r/min 摇床培养至对数生长期（OD600=0.60）。取 50 ml 菌液，冰浴 1.5 h 后，在4℃、5000 rpm 离心 10 min，弃去上清。沉淀经 10%预冷甘油洗涤，重复离心及洗涤步骤 3次，以获得高纯度 BCG 感受态细胞。最终，细胞悬液储存于-80℃，以备后续实验。
（2）电转化
电转化前，将电转杯置于 20℃预存，并依次经蒸馏水冲洗、70%乙醇浸泡 5 min、紫外照射 30 min 后，置于冰上预冷。无菌条件下，将 100 μl 感受态 BCG 与 10 μl 重组质粒混合，冰浴 15 min。随后，在 2.3 kV 电压下进行电穿孔，并立即加入 1 ml 的 Middlebrook7H9 培养基复苏。菌液转接至含 50 μg/ml 卡那霉素的苏通培养基中，37℃、180 rpm 振荡培养 24 h，以筛选重组 BCG 阳性克隆。
4.2 抗酸染色
菌悬液经接种环以螺旋轨迹均匀涂布于载玻片，自然晾干后，经酒精灯火焰热固定 3次。随后，按照试剂盒操作步骤，依次加入石炭酸复红染色液，加热染色 5 min，经 3%盐酸乙醇脱色至载玻片呈淡粉色，最终以亚甲蓝复染液复染 30 s。染色完成后，在油镜下观察，抗酸阳性菌呈亮红色杆状，确认无杂菌污染后判定为合格样本，以用于后续实验。
4.3 rBCG 生长曲线检测
BCG 与 rBCG 分别以 5×106 CFU/ml 接种于 10 ml 含 10% OADC 的 Middlebrook 7H9 培养基，rBCG 培养基中补加 25μg/ml 卡那霉素。每 24 h 取 100μl 培养物至 96 孔板，检测OD600值，连续监测 2 周，试验重复 3 次，绘制生长曲线。
4.4 P1a-P30a 基因转录水平检测
4.4.1 RNA 提取
取对数生长期 BCG/rBCG 菌体，经液氮预冷的研钵充分研磨至粉末状，加入 1 mlTrizol 裂解，室温静置 5 min。随后加入 200 μl 氯仿，剧烈振荡 15 s，室温静置 3 min后，4℃、12000 rpm 离心 15 min，取上层水相。加入 500 μl 异丙醇充分混匀，室温静置10 min，4℃、12000 rpm 离心 10 min 后弃去上清。沉淀经 1 ml 预冷 75%乙醇洗涤，4℃、7500 rpm 离心 5 min，弃去上清，开盖干燥 RNA 5-10 min。最终，RNA 经 20 μl DEPC 水溶解，测定纯度（A260/A280=1.8-2.1），-80℃保存，并用于后续逆转录 cDNA 合成。
4.4.2 实时荧光定量 PCR 检测
（1）反应体系：10 μl，包括cDNA 2 μl、上下游引物各0.5 μl、2×AcθQ qPCRSYBR Green 5 μl，ddH2O 2 μl（每个样品设3个重复孔）。
（2）反应条件：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。溶解段：95℃15秒，60℃60秒，95℃15秒。
5. P1-C-P30 重组蛋白的 rBCG 诱导表达及鉴定
5.1 rBCG 中 His 标签重组蛋白的诱导表达
将 PCR 鉴定为阳性的 rBCG 扩大培养，诱导His标签重组蛋白表达，具体方法如下：
（1）挑取表达重组蛋白的单克隆，接种到100-200ml含Kana的苏通培养液中，培养过夜。
（2）按照1:100的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37℃并含Kana的苏通培养液中,并在37℃下培养至菌液OD600接近0.6。
（3）加入IPTG至中终浓度为1mM，继续培养4-5小时。
（4）收集菌液至离心管中，4℃4,000g离心20min或4℃15,000g离心1min，弃上清，收集沉淀。
5.2 His 标签重组蛋白的纯化
（1）向收集好的沉淀中加入 100μl 变性裂解液，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的涡旋振荡(尽量避免产生气泡)。
（2）冰上超声裂解细菌。超声功率 200-300W，每次超声处理 10s，每次间隔 10s，共15min。
（3）4℃离心(15000g×10min)，取 10μl 上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。
（4）加入 20μl 混合均匀的 50% BeyoGoldTM His-tag Purifcation Resin(耐变性剂型)，4℃在摇床上缓慢摇动 30min。
（5）4℃离心(1000g×10s)沉淀凝胶，取20μl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
（6）加入50μl变性裂解液重悬凝胶，4℃离心(1000g×10s)，取20μl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
（7）重复步骤6，再进行一次洗涤。
（8）加入20μl变性洗脱液，轻轻重悬凝胶。4℃离心(1000g×10s)，收集上清及凝胶。重复2次该步骤，上清即为纯化的带有His标签的目的蛋白。
5.3 蛋白定量与初步分析
5.3.1 SDS-PAGE 分析
（1） 采用SDS-PAGE预制胶（雅酶Omni-Easy一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒），4℃解冻后垂直安装至电泳槽，加入预冷 1× Tris-Glycine-SDS 电泳缓冲液，确保液面完全覆盖加样孔。
（2）取10μg总蛋白，与 5×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，99℃变性10min，降温后上样。
（3）120 V 恒压电泳 90min，待溴酚蓝前沿到达胶底时停止。
（4）凝胶经coomassie brilliant blue R-250 染色 30 min，随后使用 50% 甲醇 +10% 醋酸 脱色至背景透明。
（5）使用凝胶成像仪拍摄条带，并采用 ImageJ 软件进行半定量分析。
5.3.2 Bradford法测定重组蛋白浓度
（1）配制 0、100、250、500、1000、1500、2000 μg/ml BSA 标准品系列梯度，与考马斯亮蓝溶液等体积混合，室温避光反应 30 min。测定 595 nm 吸光度，并绘制标准曲线，确保线性相关系数 R²≥0.99。
（2）待测蛋白溶液 12,000 rpm 离心 10 min 去除杂质，取上清按 1:19 体积比例与考马斯亮蓝溶液混合，室温避光反应 30 min。
（3）以 0.15 mol/l NaCl 溶液为空白对照，测定样品在 595 nm 处的吸光度值（比色杯用无水乙醇清洗并润洗 3 次）。
（4）根据标准曲线方程计算样品蛋白浓度，复测超范围样本。实验重复 3 次，计算变异系数（CV）确保 CV＜10%，以保证数据可靠性。
5.3.3 目的蛋白免疫反应性的 Western blot 法分析
（1）取 4℃ 预冷的转膜缓冲液备用，活化 PVDF 膜（浸入甲醇 2 min），随后置于转膜缓冲液中平衡 5 min。
（2）蛋白转印（湿转法）：
①电泳结束后，根据预染蛋白 Marker 切割目标分子量区域的凝胶，置于预冷转膜缓冲
液中平衡 10 min。
②按顺序组装转印夹层结构：阳极板→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→阴极板，确保无气
泡
③采用 100 V 恒压湿转 100 min，确保蛋白成功转移至 PVDF 膜。
（3）PVDF 膜浸入 5% 脱脂牛奶溶液，室温摇床（50 rpm）封闭 2 h。
（4）弃封闭液，加入 TBST，快速洗涤 10 min，重复 6 次。
（5）加入 小鼠抗His-tag单克隆抗体（1:10000），用 5% BSA 配制，4℃ 摇床孵育过夜。次日回收抗体，TBST 快速洗脱 10 min，每次更换洗脱液，共 6 次。
（6）加入 山羊抗小鼠二抗（HRP 标记，1:3000），5% BSA 配制，室温慢速孵育 2h。TBST 快速洗涤 10 min，更换洗脱液 6 次，确保背景噪声最低。
（7）曝光。二抗孵育完毕并经过数次洗涤后，用平头镊将 PVDF 膜取出，用吸水纸吸去过多的液体，将膜平铺在托盘上；按超敏 ECl 化学发光 A 液：B 液=1:1 的比例配置曝光液，将曝光液迅速且匀地铺满 PVDF 膜后进行曝光，观察结果。
5.3.4 P1a-P30a 重组蛋白与壳聚糖的偶联
本研究采用离子凝胶法，在酸性环境中制备壳聚糖-P1a-P30a抗原复合物。重组蛋白透析完成后，在 0.1 M 乙酸中制备 1.8 mg/ml 的蛋白储备液。取 0.5 ml 该溶液等分液置于圆底离心管中。在 1250 rpm 搅拌下，滴加1.5 ml的壳聚糖溶液。室温搅拌 4h 后，加入0.5 ml 1m 氨标准溶液，沉淀络合物。离心(3300 g×10 min),仔细除去上清液。用800μlPBS洗涤蛋白-壳聚糖复合物，再次离心以消除氨残留。测定两种上清液中的蛋白浓度后，可以计算P1a-P30a复合物的负载。P1a-P30的初始浓度约为成品蛋白壳聚糖的50%。最终湿凝胶复合物在 8℃ 下短期保存（≤ 2 h），用于后续动物实验。
6.动物实验
6.1 实验动物分组与标准化管理
取 6-8 周龄 SPF 级 C57Bl/6 小鼠（雌雄各半），随机分为 7 组，每组 6-8 只（ n=6-8 ） 。 所 有 小 鼠 按 SPF 级 屏 障 环 境 饲 养 ， 自 由 摄 食 饮 水 ， 标 准 昼 夜 节 律（12h/12h）。室温 22±2°C，湿度 50-60%。
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所有小鼠按SPF级屏障环境饲养，实验期间保持标准昼夜节律（12h/12h）。所有疫苗组小鼠于第 0天接受皮下(s.c)初次免疫（ rBCG-P1a-P30a , 200μ l PBS + 100μl 完全弗氏佐剂 )，然后于第 14、28、42 天进行联合壳聚糖三次鼻内(i.n)加强免疫，对照组接种相应 PBS 或标准阳性疫苗。鼻内加强免疫时需让鼠仰卧，每只鼻内滴入20 μl（10 μl/鼻孔）rBCG-P1a-P30a（450μg）+ 壳聚糖（0.1% w/v），确保疫苗覆盖上呼吸道。
6.2 免疫学分析
6.2.1.1 血清体液免疫检测（ELISA）
（1）血清采集：
免疫后第 0、2、4、6 周，对小鼠尾静脉采血（100 μl），3000 rpm 离心 10 min，分离血清（-80℃ 保存）。
（2）血清 IgG 抗体滴度测定：
①96 孔板包被 10 μg/ml P1a-P30a 融合蛋白，4℃ 过夜孵育。
②加入5% BSA 封闭 1 h，随后加入 1:100 至 1:12800 梯度稀释血清，37℃ 孵育 1h，洗涤 6 次。
③加入 HRP 标记山羊抗小鼠 IgG（1:5000）或 IgA（1:2000），37℃ 孵育 45 min，TMB 显色，450 nm 读取 OD 值。
（3）IgG亚型分析（Th1/Th2 免疫）：
加入 HRP 标记 IgG1（1:3000）和 IgG2a（1:3000），计算 IgG2a/IgG1 比值，并进行One-way ANOVA 统计分析，以评估 Th1/Th2 免疫应答特征。若IgG2a / IgG1 高 ，则为Th1 免疫增强，反之则为 Th2 免疫增强。
6.2.1.2 黏膜体液免疫检测（ELISA）
（1）样本采集：
免疫后第 0、2、4、6 周，采集 BAlF（支气管肺泡灌洗液）、鼻洗液、咽拭子冲洗液。BAlF 采集方法为对小鼠气管插管，缓慢注入 1 ml PBS，回收液 1500 rpm 离心 10min，取上清 -80℃ 保存。鼻洗液、咽拭子的采集方法为分别用 100 μl PBS 洗鼻腔和口咽部，离心收集上清。
（2）ELISA 检测 sIgA：
①96孔板包被 P1a-P30a 蛋白（10 μg/ml），4℃ 过夜孵育
②加入5% BSA 封闭 1 h，加入样本孵育 1 h。
②加入HRP 标记抗小鼠 sIgA（1:2000），37 ℃ 孵育 45 min ，TMB 显色检测，450nm 读取 OD 值。
6.2.2.1 T 细胞亚群分析及功能评估（流式细胞术）
（1）末次免疫后2周，处死小鼠并分离脾脏，置于冷PBS中。使用无菌研磨器在70 μm细胞筛上研磨脾脏组织，过滤得到单细胞悬液。
（2）向细胞悬液中加入5 ml红细胞裂解液，室温静置5分钟后加入5 ml PBS终止裂解，1500 rpm离心5分钟去除上清，重复裂解步骤直到红细胞完全去除。
（3）调整细胞浓度至2×106/ml，加入10 μg/ml P1a-P30a蛋白，37℃、5% CO2孵育6小时。孵育后，细胞使用PBS洗涤并进行表面染色，使用CD3-APC、CD4-FITC、CD8-PerCP抗体，4℃避光孵育30分钟。
（4）固定破膜后，加入IFN-γ-PE、IL-4-PE-Cy7进行胞内染色，室温避光孵育20分钟。最后，细胞经PBS洗涤、重悬于200 μl PBS，并通过流式细胞仪检测CD4+ T细胞的IFN-γ/IL-4比值，评估Th1/Th2免疫偏向。
6.2.2.2 细胞免疫检测（ELISPOT）
（1）用96 ELISPOT 板包被抗小鼠 IFN-γ/IL-4 捕获抗体，孵育脾细胞（2×10⁵/孔）+10 μg/ml P1a-P30a。
（2）加入生物素二抗，DAB 显色，计数 IFN-γ/IL-4 斑点，计算 SI （刺激指数）。
（3）采用 Kruskal-Wallis 非参数检验，比较各实验组 IFN-γ 及 IL-4 斑点数。
6.3 攻毒保护效能验证
6.3.1攻毒模型建立
末次免疫2周后，小鼠滴鼻感染2×10⁷ CFU M. pneumoniae，感染后7天处死，取肺组织分装，部分用于4%多聚甲醛固定，部分液氮速冻保存。
6.3.2病原体负荷检测
(1) qPCR分析支原体定植（ΔCt 法）：
①以 16S rRNA 作为内参基因，提取之前采集的鼻洗液、BAl、肺组织匀浆中的 DNA。
②用qPCR检测P1基因拷贝数，使用特异性引物（F: 5'-CAGGGTCTTCGTAACCTGCT-3'；R:5'-GTTGATGTTGCCGTGGTAGT-3'），PCR 95℃ 预变性 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共扩增40个循环，计算相对病原载量。
(2) CFU计数：肺组织匀浆梯度稀释后，接种于 SP4 琼脂平板，37℃ 5% CO2培养5-7天，计算CFU/g组织。
6.3.3 组织病理学分析+免疫荧光检测
（1）肺组织样本经4%多聚甲醛固定48 h，依次进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理，并石蜡包埋。石蜡块切割为4 μm厚的组织切片，烘干备用。切片脱蜡后，依次经苏木素染色10 min、流水冲洗、0.7%盐酸乙醇分化、再次冲洗，经95%乙醇浸泡30 s，并行伊红复染30 s。经95%和100%乙醇梯度脱水后，二甲苯透明，最终封片。染色完成后，在显微镜下观察肺组织病理学变化，并采用双盲法评分（0-26分），其中0分表示无病变，1-5分为局灶性支气管炎症，6-10分为弥漫性淋巴细胞浸润，>10分提示严重肺泡损伤。
（2）免疫荧光检测肺内 M. pneumoniae 分布，使用抗 His-tag 蛋白 IgG + Alexa Fluor 488 二抗标记。
6.3.4 肺组织免疫细胞浸润分析
将肺组织剪碎后置于含有胶原酶 D 和 DNase I 的消化缓冲液中，37℃孵育30 min，以充分消化组织基质。经70 µm细胞筛过滤后，使用红细胞裂解液去除红细胞，离心重悬后制备单细胞悬液。随后，通过流式细胞术检测CD45+总免疫细胞，进一步标记CD4+、CD8+ T细胞及F4/80+巨噬细胞，分析各亚群的浸润情况，以评估疫苗对肺部局部免疫环境的调控效应。
6.3.5 肺组织中 IL-6、TNF-α 细胞因子水平检测
取冻存的肺组织，超声匀浆后 4℃ 12,000 rpm 离心 10 min，取上清备用。按照前述ELISA 方法（见 5.2.1.1），采用相应试剂盒检测肺组织匀浆中 IL-6 和 TNF-α 含量，450 nm 读取 OD 值，并依据标准曲线计算蛋白浓度。实验重复 3 次，数据以 Mean ± SD表示，组间差异分析采用 One-way ANOVA，P < 0.05 具有统计学显著性。
6.4疫苗毒性及免疫记忆分析
6.4.1急性毒性评估
（1）体重变化曲线：免疫后0-8周，每周测量小鼠体重，观察是否出现异常下降。
（2）脏器系数分析：处死小鼠后称量心、肝、脾、肺、肾质量，计算脏器质量比（脏器质量/终末体重×100%）。
6.4.2 免疫记忆分析（流式细胞术）
记忆T细胞分析：提取脾细胞，以CD44-PE、CD62l-FITC、CD27-APC标记T细胞，流式细胞仪检测CD44hi CD62l+（TCM）和CD44hi CD62l-（TEM）细胞比例，评估疫苗诱导的免疫记忆。
6.5数据分析与统计方法
（1）ELISA数据归一化：采用重组rP1a-P30a蛋白作为内参，进行跨板数据标准化，以消除实验批次效应。
（2）统计分析：使用GraphPad Prism软件进行统计分析，数据以均值±标准差（Mean±SD）表示。数据两两比较采用T检验，组间差异显著性分析采用单因素方差分析（One-wayANOVA），事后检验采用Tukey法进行多重比较，以P<0.05为统计学显著性标准。
（1)肺炎支原体与结核病联合疫苗研发仍处探索阶段，尚未有整合二者的疫苗进入临床。现有肺炎支原体疫苗以单价亚单位疫苗为主，面临免疫持久性不足及黏膜免疫激活困难等问题。国际研究聚焦于BCG表达单一异源抗原，虽能提升抗体水平，但未能有效阻断病原体定植或增强免疫清除。本研究首次提出将P1免疫优势区P1a与P30a抗原融合于BCG载体，结合P1a介导的黏附机制与P30a的免疫清除作用，突破单靶点设计局限，构建高效的多靶点免疫策略。
（2）关于 P1 蛋白的研究
肺炎支原体P1蛋白作为核心毒力因子，通过P40/P90复合体介导宿主细胞黏附（P1a保守区抑制黏附，I-III结构域驱动滑动运动），其RepMP重组导致的P1-2型菌株显著增加儿童下呼吸道感染风险。科学研究表明，P1 蛋白的 N 末端位于细胞内部而 C 末端暴露于细胞外部，暴露在外的C端蛋白含有抗原决定簇，因此其具有免疫原性。根据Schurwanz等人的研究[1],发现P1a的RP14序列具有强免疫应性同时介导的粘附区域和位点。避开了重复序列RepMP4 、RepMP2/3 和TGA密码子，避免了定点突变的繁琐步骤。本研究通过整合P1关键结构域与结核抗原的融合策略，突破抗原稳定性瓶颈并构建跨病原体防护体系，未来将结合Th1型佐剂与多组学指导的多表位设计突破疫苗效力瓶颈[2]。
（3）关于 P30 蛋白的研究
P30 蛋白是肺炎支原体的核心黏附素，负责介导与呼吸道上皮细胞的黏附和滑动运动[3,4]。P30 需要通过信号肽切割才能成熟，前体形式显著降低其黏附和滑动能力[5]。P30a 为P30 片段上的免疫显性片段，使 P30 蛋白具有免疫原性，进而引发自身免疫反应[6]。国内研究主要聚焦于突变与亚单位疫苗的开发，而国际研究则侧重于结构域与互作机制的探索[3，7]。
（4）研究表明，P1-P30 嵌合蛋白具有良好的免疫原性，可有效诱导针对肺炎支原体的保护性抗体。Schurwanz 等人通过构建涵盖 P1 黏附素主要区域和 P30 蛋白的重组蛋白，发现其能在豚鼠体内引发强免疫反应，并在体外粘附抑制实验中显著抑制 MP 对人支气管上皮细胞的粘附能力[1]。Hausner 等人进一步采用先皮下初次免疫（辅以完全弗氏佐剂）联合壳聚糖两次鼻内加强免疫的策略，在豚鼠模型中成功诱导高水平、持久的肺部和鼻咽部 IgA 抗体。这一免疫策略不仅在血清和支气管肺泡灌洗液（BAl）中诱导出强烈的特异性抗体反应，还显著降低了 MP 在动物呼吸道中的基因拷贝数，提高了免疫保护效果[13]。这些研究为P1a 和 P30a 重组蛋白的制备，以及采用壳聚糖联合免疫策略进行小鼠实验提供了坚实的理论依据。
（5）肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）是一种缺乏细胞壁的非典型社区获得性肺炎病原体，其基因组较小，代谢功能受限，体外培养需复杂培养基[8]。MP 通过顶端的粘附细胞器与宿主呼吸道上皮细胞结合，这一过程依赖 P1、P30 等膜蛋白与 HMW1-5 等细胞骨架样蛋白的协同作用，形成功能性粘附网络[9]。其中，P30 蛋白通过羧基端锚定于 MP 细胞膜，是其关键黏附素和免疫原；P30 基因 3'端或全基因缺失的突变株会丧失黏附能力并致毒力消失，针对 P30 的单克隆抗体可有效阻断其黏附作用[10]。MP 的致病机制涉及直接细胞毒性、免疫损伤及免疫逃逸[11]。当前研究聚焦于整合 MP 黏附相关蛋白与结核抗原（如 Ag85B）的疫苗策略，以突破单一靶点局限，但需进一步优化抗原稳定性及免疫平衡设计。
（6）卡介苗（BCG）对成人肺结核的保护效力不稳定，且因牛型结核分枝杆菌免疫原性受限[12]。本研究通过基因重组技术，构建了重组 BCG 疫苗，既能阻断肺炎支原体黏附，又保留了对结核的防护作用。该疫苗通过激活黏膜免疫和记忆 T 细胞，显著降低肺炎支原体载量，为结核和耐药肺炎支原体的防控提供了新方案。
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P1 结构域构建体多克隆抗体黏附测定
参考文献
[1] Schurwanz N, Jacobs E, Dumke R. Strategy to create chimeric proteins derivedfrom functional adhesin regions of Mycoplasma pneumoniae for vaccine development[J]. Infection and Immunity, 2009, 77(11): 5007-5015.
[2] Vizarraga D, Kawamoto A, Matsumoto U, et al. Immunodominant proteins P1 and P40/P90 from human pathogen Mycoplasma pneumoniae[J]. Nat Commun, 2020, 11(1):5188.
[3] Zuo Y, Zhang R, Li S. Reviewing advancement in Mycoplasma pneumoniae P30 adhesin protein provides insights for future diagnosis and treatment[J]. Front Microbiol, 2024, 15:1515291.
[4] Dallo SF, Lazzell AL, Chavoya A, Reddy SP, Baseman JB. Biofunctional domains of the Mycoplasma pneumoniae P30 adhesin[J]. Infection and Immunity, 1996,64(7): 2595-2601.
[5] Chang HY, Prince OA, Sheppard ES, Krause DC. Processing is required for a fully functional protein P30 in Mycoplasma pneumoniae gliding and cytadherence[J]. Journal of bacteriology, 2011, 193(20): 5841-5846.
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[7] Chang HY, Jordan JL, Krause DC. Domain analysis of protein P30 in Mycoplasma pneumoniae cytadherence and gliding motility[J]. Journal of Bacteriology, 2011,193(7): 1726-1733.
[8] 李平翠. 重组肺炎支原体 P1 蛋白基因流感载体活毒株的构建及免疫效果研究[D]. 昆明: 昆明理工大学, 2021.
[9] Hasselbring BM, Sheppard ES, Krause DC. P65 truncation impacts P30 dynamicsduring Mycoplasma pneumoniae gliding[J]. Journal of Bacteriology, 2012, 194(11):3000-3007.
[10] Hasselbring BM, Jordan JL, Krause DC. Mutant analysis reveals a specific requirement for protein P30 in Mycoplasma pneumoniae gliding motility[J].Journal of Bacteriology, 2005, 187(18): 6281-6289.
[11] Jiang Z, Li S, Zhu C, Zhou R, Leung PHM. Mycoplasma pneumoniae Infections: Pathogenesis and Vaccine Development[J]. Pathogens, 2021, 10(2): 119.
[12] Qu W, Guo Y, Xu Y, Zhang J, Wang Z, Ding C, Pan Y. Advance in strategies to build efficient vaccines against tuberculosis[J]. Frontiers in Veterinary Science, 2022, 9: 955204.
[13]Schurwanz N, Jacobs E, Dumke R. Strategy to create chimeric proteins derived from functional adhesin regions of Mycoplasma pneumoniae for vaccine development[J]. Infection and Immunity, 2009, 77(11):5007 - 5015.
1.技术创新：双功能融合抗原与优化 BCG 载体的结合
传统 BCG 仅能防护结核病，本研究首次将其用于肺炎支原体疫苗开发，突破 BCG 在呼吸道感染防控中的局限性。通过构建 P1a-P30a 融合抗原，整合 P1蛋白的黏附抑制功能与P30的免疫增强作用，优化抗原暴露，提高免疫原性。采用柔性 linker 连接策略确保融合抗原的结构稳定性，并结合优化信号肽设计增强外源蛋白在 rBCG 中的表达水平，使疫苗在发挥结核防护作用的同时，赋予其针对肺炎支原体的免疫保护能力。同时结合皮下初免+壳聚糖佐剂+三次鼻内加强免疫策略，优化疫苗递送途径，提升黏膜免疫响应。
2. 理论创新：黏膜免疫、细胞免疫与系统免疫协同增强机制研究
目前肺炎支原体疫苗主要依赖体液免疫，本研究系统评估 rBCG-P1a-P30a 诱导的Th1/Th2 免疫应答，填补 BCG 诱导支原体特异性免疫的研究空白。通过流式细胞术、ELISA、qPCR 等手段，综合分析疫苗诱导的 CD4+ T 细胞活化、IFN-γ/IL-4 免疫偏向、及BAlF sIgA 水平，系统解析其免疫机制。结合小鼠攻毒实验评估疫苗的保护效能，并通过肺组织病理分析及肺组织中 IL-6、TNF-α 细胞因子水平检测，揭示 rBCG-P1a-P30 在肺部病理损伤控制中的作用。同时系统分析了壳聚糖佐剂在增强鼻内免疫诱导sIgA及T细胞记忆形成中的作用，揭示其在疫苗递送中的免疫调节效应。为 BCG 载体疫苗在呼吸道感染防控中的应用提供理论支撑。
3.应用创新：BCG 载体疫苗在呼吸道感染防控中的新拓展
rBCG-P1a-P30a 疫苗兼具肺炎支原体与结核病的双重免疫保护，拓展了 BCG 作为载体疫苗在跨病原防控中的应用潜力。优化的免疫策略（皮下初免+鼻内加强+壳聚糖）使疫苗同时激活系统性免疫和黏膜免疫，增强免疫持久性。疫苗利用 BCG 载体的长期免疫记忆特性，减少接种频次，提高免疫持久性，适用于儿童、老年人等高风险人群，并可作为现有 BCG 疫苗的升级版，为全球结核病防控策略提供更优选择。本研究的抗原优化及 rBCG 载体构建策略可进一步推广至新冠、结核、百日咳等呼吸道疫苗研发，
具有广泛的公共卫生价值。
4.产业化与临床转化价值
rBCG 载体疫苗可依托现有 BCG 生产体系进行规模化制备，工艺成熟，生产成本低，便于大规模推广。采用 冷冻干燥技术 提高疫苗稳定性，降低储存和运输成本，适用于资源有限地区的肺炎支原体防控。本研究疫苗设计可结合 肺炎支原体流行病学数据进一步优化免疫策略，为进入临床试验阶段奠定基础。同时，壳聚糖联合免疫策略可与现有儿童免疫接种程序结合，推动其在肺炎支原体高发国家和地区的推广应用。
5.1 技术路线

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5.2 拟解决问题
本研究旨在开发基于 BCG 载体的 P1a-P30a 双抗原融合疫苗，针对肺炎支原体感染提供创新性免疫防护策略。具体拟解决以下关键科学问题：
（1）验证 P1a-P30a 融合抗原在 rBCG 中的稳定表达及其遗传稳定性，并评估其对宿主生长特性的影响，确保其可行性和安全性。
（2）系统评估 rBCG-P1a-P30a 疫苗对肺炎支原体感染的免疫保护作用，包括对病原黏附的阻断效力及结核病的协同防护效果。
（3）建立基于 rBCG 载体的免疫应答多维度评价体系，涵盖体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫等多个方面，并优化免疫评价指标，为 BCG 载体疫苗在其他病原防控中的应用提供理论支撑。
5.3 预期成果
（1）成功构建稳定表达 P1a-P30a 融合抗原的 rBCG 菌株，并优化其遗传稳定性，确保疫苗株在体内外均可高效表达目的蛋白。
（2）荧光定量 PCR（qPCR）验证 rBCG-P1a-P30a 菌株中融合基因的转录水平，Western blot 及 ELISA 进一步确认 P1a-P30a 蛋白的表达和分泌情况。
（3）小鼠免疫实验表明，rBCG-P1a-P30a 能有效诱导特异性细胞免疫及体液免疫应答，刺激 CD4+ 和 CD8+ T 细胞活化，并促进 IgG、IgA 抗体生成。
（4）流式细胞术分析结果显示，rBCG 免疫组的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞比例显著高于对照组，且 IFN-γ/IL-4 比值升高，提示 Th1 免疫应答增强。
（5）小鼠攻毒实验证实 rBCG-P1a-P30a 能有效降低肺炎支原体的定植水平，并减少肺部病理损伤，炎症评分及 IL-6、TNF-α 细胞因子水平显著下降。
（6）发表 1-2 篇 SCI 论文，申请 1 项国家发明专利 ，并探索疫苗在临床前研究及产业化方面的可行性。

本项目预计自 2024 年 9 月至 2027 年 6 月完成，分阶段推进。
2024 年 9 月 – 2025 年 5 月：基因构建及重组质粒筛选
（1）获取肺炎支原体 P1a 与 P30a 基因序列，并进行序列优化分析。
（2）设计特异性引物，并验证扩增特异性及扩增效率。
（3）PCR 扩增 P1a 与 P30a 基因，并进行产物纯化与回收。
（4）采用重叠 PCR 技术构建 P1a-P30a 融合基因，并测序验证序列正确性。
（5）对 P1a-P30a 融合基因与 pMV261 质粒进行双酶切，并完成连接反应，构建重组质粒。
（6）重组质粒转化至大肠杆菌 DH5α，筛选阳性克隆，并进行质粒扩增与提取。
2025 年 5 月 – 2026 年 12 月：重组 BCG 构建与蛋白表达分析
（1）提取并鉴定重组质粒，制备 BCG 感受态细胞，并采用电转化法导入重组质粒。
（2）筛选 rBCG 菌株，并通过 PCR 鉴定 P1a-P30a 目的基因的整合情况。
（3）进行抗酸染色及生长曲线分析，评估 rBCG 的生长特性及遗传稳定性。
（4）提取 RNA 并使用 qPCR 检测 P1a-P30a 的基因表达水平。
（5）提取并纯化 P1a-P30a 融合蛋白，评估其表达量及分泌情况。
（6）采用 SDS-PAGE 和 Western blot 分析 rBCG 表达的融合蛋白，并进行 ELISA 量化检测。
2026 年 1 月 – 2026 年 9 月：小鼠免疫实验及免疫应答分析
（1）开展小鼠免疫实验，评估 rBCG-P1a-P30a 在 C57Bl/6 小鼠中的免疫原性。
（2）ELISA 检测免疫小鼠血清 IgG、IgG 亚型及 sIgA 水平，分析体液免疫应答。
（3）流式细胞术检测 CD4+ 和 CD8+ T 细胞比例，分析 rBCG 疫苗诱导的细胞免疫反应。
（4）评估 Th1/Th2 免疫应答，检测 IFN-γ、IL-4 及相关细胞因子水平。
（5）开展小鼠攻毒实验，分析 rBCG 免疫后肺炎支原体的定植情况及肺组织病理变化。
（6）HE 染色观察肺部炎症程度，并进行肺组织病理评分。
2026 年 9 月 – 2027 年 3 月：疫苗安全性评估与长期免疫分析
（1）采用 ELISA 检测小鼠肺组织及细胞匀浆中的 TNF-α、IL-6 水平，评估疫苗的炎症调控能力。
（2）开展疫苗安全性实验，监测小鼠体重变化及脏器系数，评估疫苗的生物安全性。
（3）进行小鼠肺组织病理切片分析，观察长期免疫反应及组织损伤情况。
（4）分析免疫记忆，采用流式细胞术检测 CD44hi CD62l+（TCM）和 CD44hi CD62l- （TEM） 记忆 T 细胞比例，评估 rBCG 诱导的长期免疫应答。
2027 年 3 月 – 2027 年 6 月：数据分析与研究成果总结
（1）对实验数据进行统计学分析，采用 GraphPad Prism 进行数据可视化及统计检验。
（2）撰写并整理研究论文
（3）申请国家发明专利，准备进一步优化疫苗工艺，为临床前研究奠定基础。
（4）完成项目结题报告，汇总实验数据，归纳研究结论，并为后续研究提供改进方向。
1.与本项有关且已取得的成绩
1.1PCR 扩增 P1a、P30a 目的基因
P1a目的基因大小 692bp，P30a基因大小为 774bp ,如电泳结果显示，PCR扩增产物P1a 大小约为 692bp，P30a 大小约为 774bp，与预期结果相符。
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M：DNA 标志物（Dl2000）
1：P1a 基因 PCR 产物
2：P30a 基因 PCR 产物
1.2 重叠 PCR 获得融合目的基因 P1a-P30a
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M：DNA 标志物（Dl5000）
1： P1a-P30a 融合基因
1.3 pMV261 载体电泳图
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M：DNA 标志物（Dl5000）
1：pMV261 载体
1.4 P1a-P30a 融合基因部分测序图
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1.5 P1a-P30a-pMV261 重组 BCG 的齐-尼抗酸染色
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1.6 rBCG生长曲线图
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1.7 P1a-P30a重组蛋白WB结果图
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M：marker
1：P1a-P30a 重组蛋白（约 56KDa）
2.已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法
2.1 已具备的条件
本研究依托成熟的 rBCG 构建技术、完善的实验设备及丰富的学术资源，为项目顺利开展提供坚实基础。
（1）本实验室已建立稳定的 rBCG 研究体系，具备 rBCG 构建及疫苗评价所需的核心仪器与试剂，能够满足实验需求，并可长期使用，确保实验的连续性和可重复性。
（2）项目指导教师长期从事 rBCG 及其免疫学特性的研究，在该领域积累了丰富的经验，已发表多篇相关学术论文，对研究热点及发展方向具有深入理解，能够提供专业指导并优化实验方案。
（3）依托学校良好的科研环境和丰富的数据库资源，团队能够高效检索和分析相关文献，确保研究内容的前沿性和科学性。
（4）团队成员熟练掌握 GraphPad Prism、SPSS、Stata 等数据分析软件，具备较强的数据处理和统计分析能力，能够确保实验数据的准确性和科学性。
2.2 尚缺少的条件
无
2.3 解决方法
无

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 实验用途 10500.00 9500.00
1. 业务费 5500.00 实验用途 3000.00 2500.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 蛋白检测、DNA 测序和引物合成 1500.00 500.00
（2）能源动力费 500.00 电费，水费等 250.00 250.00
（3）会议、差旅费 2000.00 国内学术交流会 3-4 次，每次约 500 元 1000.00 1000.00
（4）文献检索费 500.00 文献检索 250.00 250.00
（5）论文出版费 500.00 论文查重、论文 出版 0.00 500.00
2. 仪器设备购置费 3500.00 试剂、分子生物 学相关试剂 2500.00 1000.00
3. 实验装置试制费 10000.00 动物费（肺炎支 原体模型鼠约需 50 只） 5000.00 5000.00
4. 材料费 1000.00 细胞株 0.00 1000.00
结束

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