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PAX的DNA甲基化在子宫内膜癌中的作用和机制研究

申报人：徐子浛 申报日期：2025-03-27

基本情况

2025创新项目
PAX的DNA甲基化在子宫内膜癌中的作用和机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目旨在研究PAX1基因甲基化在子宫内膜癌（EC）中的诊断和治疗作用，通过组织学、细胞学和动物模型三个层次展开：首先，利用全基因组甲基化芯片和实时甲基化特异性PCR（QMSP）检测PAX1在EC组织和外周血中的甲基化水平，结合临床病理分析其诊断和预后价值；其次，通过构建PAX1干扰及过表达细胞系，研究其对EC细胞增殖、侵袭和迁移的影响，并探索相关信号通路及相互作用蛋白；最后，建立PAX1转基因小鼠EC模型，验证其在体内对肿瘤生长的调控作用。研究旨在全面揭示PAX1甲基化在EC中的生物学功能及其临床应用潜力。
2022年1月1日—2024年12月31日贺林院士新医学临床转化工作站科研基金—The function and mechanism of Pax1 DNA methylation in endometrial carcinoma
（1）2023.01-2024.12，经阴自然腔道内镜手术在盆底重建中的应用研究，课题编号：ZZTD-MS-2023-02，3万，经费来源：本院主诊医师团队专项临床研究计划，拟结题；
（2）2023.10-2025.10，PAX的DNA甲基化在子宫内膜癌中的作用和机制研究，课题编号：20230YXNS212，市重点研发计划，在研。
（3）2024.12-2025.12经耻骨路径无张力尿道中段悬吊术（TVT/TVTE）治疗中重度压力性尿失禁 本院新技术新项目 已准入，拟开展。
提供技术指导
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
徐子浛 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 分配任务，查找文献完成文章综述，汇总
何文心 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 文献查阅、处理数据、完成文章综述
骆明翰 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 文献查阅、处理数据、完成文章综述
丁照轩 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 文献查阅、处理数据、完成文章综述
李梓菡 口腔医学院 口腔医学（本科） 2024 文献查阅、处理数据、完成文章综述
阮浙宇 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 文献查阅、处理数据、完成文章综述

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
金艳艳 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

为EC提供新型无创诊断标志物（PAX1甲基化）及潜在治疗靶点。揭示PAX1通过表观遗传调控影响EC发生发展的分子机制，可能发现新的信号通路调控节点。聚焦PAX1甲基化的诊断价值及其生物学功能机制。通过整合临床样本分析、细胞实验与动物模型，该研究旨在系统性阐明PAX1在EC中的多维作用，为治疗提供新思路，为精准诊疗提供理论和实践依据。 
（1）临床实践的具体操作方式
选取进行子宫内膜癌全面分期手术的患者为子宫内膜癌(Endometrial Cancer,EC)组,设为实验组,共36名;正常内膜组织取自同期因妇科其他疾病(如子宫肌瘤、子宫腺肌病)行手术治疗并经组织病理学证实为正常子宫内膜的患者,共36名,设为正常对照组(Normal Contrast,NC)。在手术前获取EC患者、NC患者的外周血各22例。采用实时荧光定量PCR(q PCR)检测EC组织和NC组织中PAX1基因m RNA的表达水平。利用统计学方法分析PAX1基因启动子甲基化程度与子宫内膜癌患者术后病理特征的关系。采用DNA提取、亚硫酸氢盐修饰、甲基化特异性PCR、琼脂糖凝胶电泳方法检测EC组织、NC组织、EC患者外周血和NC患者外周血中PAX1基因启动子的甲基化程度。
（2）在组织学水平验证PAX1甲基化在子宫内膜癌诊断中的作用。
通过全基因组甲基化芯片筛选出甲基化差异表达基因，设计甲基化特异性引物，利用实时甲基化特异性PCR技术（QMSP）检测正常女性外周血、EC患者外周血、正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中PAX1基因甲基化水平。应用半定量免疫组化、定量 PCR 和蛋白印迹法检测其在子宫内膜癌中表达水平，分析其基因表达水平与患者临床分期，远处转移，病理分级等临床病理的关系，采用Kaplan-Meier法分析EC患者PAX1表达水平与患者生存期的关系，绘制ROC曲线验证PAX1甲基化在EC中的诊断效能。
（3）在细胞学水平研究在子宫内膜癌中的生物学行为。
使用定量RT-PCR法和蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞系中PAX1的表达水平。构建稳定转染干扰及过表达PAX1的子宫内膜癌细胞系，利用CCK-8实验检测PAX1基因对子宫内膜癌细胞系增殖能力的影响，利用Transell实验检测PAX1对子宫内膜癌细胞系侵袭和迁移能力的影响。蛋白印迹法检测PAX1基因对上皮间充质转化（ECT）及增殖相关分子的影响。为了进一步探究PAX1在子宫内膜癌细胞中的作用机制，应用免疫共沉淀技术纯化与PAX1相互作用的蛋白，通过液相色谱－质谱结合数据库分析查询PAX1结合蛋白，蛋白印迹法检测其表达水平，功能性实验验证其对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，探索PAX1下游介导的信号通路。
（4）在动物模型中进一步验证PAX1在动物体内对肿瘤增殖的影响。
建立裸鼠PAX1过表达或沉默表达转基因小鼠子宫内膜癌模型，观察子宫内膜癌病灶大小变化；使用免疫组化法或蛋白印迹法检测相关分子的表达，在EC模型中验证PAX1甲基化水平。
围绕完成项目目标需要完成以下工作:
①DNA 提取、亚硫酸氢盐修饰和甲基化特异性 PCR，检测外周血、子宫内膜癌组织中PAX1甲基化水平。
②荧光定量 RT-PCR检测PAX1的转录水平。
③蛋白印迹法检测PAX1与相关通路蛋白的表达水平。
④细胞活力测定、迁移和侵袭性测定以及细胞周期分析，检测PAX1在EC中的生物学行为
⑤建立转染PAX1表达沉默模型。
⑥建立小鼠动物模型。
⑦统计学处理：所有数据以均数±标准差表示，应用SPSS22.0 软件分析，以 p<0.05 作为组间差异性标准。 
（1）关于PAX1的研究
①表皮生长因子（EGF）与宫颈癌细胞的上皮-间充质转化（EMT）有关，Su[1]等人为了探索 PAX1 在宫颈癌发病中的作用，研究了 PAX1 在表皮生长因子（EGF）存在时的表达情况，结果表明 PAX1 在 EGF 的刺激下可抑制宫颈癌细胞系的恶性表型，进一步的实验表明，PAX1 能够通过激活蛋白质磷酸酶从而抑制多种致癌激酶的活性，包括 MAPK 途径（ERK1/2 和 P38）和 SRC 途径（HCK，FYN 和 SRC）。IL-6 作为一种致癌细胞因子，其激活可诱导 STAT3 和 AKT 信号传导，导致肿瘤的生长和侵袭，包括宫颈癌，PAX1 同时也可以抑制 IL-6 介导的致癌激酶的活化，如 AMPK、AKT和 PRAS40。
②Xu[2]等人报道了宫颈癌组织中 PAX1 基因甲基化的异常。一项 meta 分析纳入了 7 项研究和 1055 例患者，发现 PAX1 甲基化与宫颈病变的发展过程有关，可用于宫颈癌前病变的早期诊断和预防。
③Liu[3]等人对 201 例子宫内膜标本进行免疫组织化学染色，结果表明 PAX1 基因在正常子宫内膜(93.3%)、单纯性增生子宫内膜(97.2%)和不典型增生子宫内膜(87.5%)中表达较高，而在 EC 中仅有 1/3(30.1%)表达，AH 患者组织中 PAX1 蛋白表达水平显著高于 EC 组(P<0.001)，且与总体存活率成正比。PAX1 基因mRNA 表达量在 NC 组表达高，在 EC 组表达较低。PAX1 基因作为 TSGs，在癌组织中的表达降低可能是癌症发生的重要因素，DNA 甲基化可能诱导了 TSGs 的失活，促进了肿瘤的发生发展。
（2）关于基因启动子甲基化与癌变的关联
基因启动子甲基化已经在子宫内膜癌中得到了证实[4,5]，HMLH1、APC 和 RASSF1A 的启动子甲基化被认为是子宫内膜癌变的早期事件[6]。Arafa 等人证明，在癌旁组织中也观察到 EASSF1A 和 RARb2 基因启动子甲基化[7]。但绝大多数基因的甲基化变化缺乏足够的特异性和灵敏性，它们可能在多个器官或肿瘤中表达，无法成为可靠的诊断标志物。Huang[8]等人的研究结果指出，BHLHE22、CDO1 和 CELF4联合甲基化检测子宫内膜癌的敏感性为 91.8%，特异性为 95.5%，这说明新的分子生物标记物发现和结合可能有助于子宫内膜癌的筛查和精准诊断
[1]J. Huang，G. Wang，J. Tang，et al. DNA Methylation Status of PAX1and ZNF582 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma[J]. Int JEnviron Res Public Health. 2017. 14(2): 216
[2]P. H. Su，H. C. Lai，R. L.Huang，et al. Paired Box-1 (PAX1) ActivatesMultiple Phosphatases and Inhibits Kinase Cascades in CervicalCancer[J]. Sci Rep. 2019. 9(1): 9195.
[3]L. C. Liu，H. C. Lai，Y. C. Chou.et al. Paired boxed gene 1 expression:A single potential biomarker for differentiating endometrial lesionsassociated with favorable outcomes in patients with endometrialcarcinoma[J]. J Obstet Gynaecol Res. 2016. 42(9): 1159-67.
[4]N.Wentzensen，J. N. Bakkum-Gamez，J. K. Killian，et al. Discoveryand validation of methylation markers for endometrial cancer[J]. Int JCancer. 2014. 135(8): 1860-8.
[5]K.M.C.Cornel，K.Wouters，K. K.Van de Vijver，et al. Gene PromoterMethylation in Endometrial Carcinogenesis[J]. Pathol Oncol Res.2019. 25(2): 659-667.
[6]A. Eddib，B. Allaf，J. Lee，et al. Risk for advanced-stage endometrialcancer in surgical specimens from patients with complex endometrialhyperplasia with atypia[J]. Gynecol Obstet Invest. 2012. 73(1): 38-42.
[7]P. Morice，A. Leary，C. Creutzberg，et al. Endometrial cancer[J]. TheLancet. 2016. 387(10023): 1094-1108.
[8]E.J.Robbe ， S.M.van Kuijk ， E.M.de Boed ， et al.Predicting thecoexistence of an endometrial adenocarcinoma in the presence of　atypical complex hyperplasia: immunohistochemical analysis ofendometrial samples[J]. Int J Gynecol Cancer. 2012. 22(7): 1264-72
（1）创新点：
①本项目以PAX1为切入点，深入研究其在EC发生发展中的作用，可为 EC 的干预提供新思路和新靶点，对于探索EC的早期诊断及治疗方案极为重要，在研究内容、研究思路与研究角度方面具有明显创新之处。参与PAX1调控信号通路极其复杂，主要有 PI3K/AKT、NOTCH 和 Wnt 信号通路。
②在寻找参与调控PAX1的信号通路时，特异性阻断剂作为干预手段，通过观察PAX1的表达变化，初步确定调控PAX1的信号通路，再使用 siRNA 沉默相关信号通路蛋白进一步确认。如调控PAX1的信号通路不是预选的信号通路，我们拟利用酵母双杂交或免疫共沉淀技术寻找分析未知信号通路。
（2）项目特色：
①利用全基因化甲基化芯片技术，筛选出与子宫内膜癌（EC）相关的甲基化差异表达基因，特别是PAX1基因的甲基化状态。这种方法能够全面、系统地分析甲基化变化，具有较高的筛选效率和准确性。
②利用实时甲基化特异性PCR（QMSP）技术检测PAX1基因在不同样本（正常女性外周血、EC患者外周血、正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织）中的甲基化水平。QMSP技术具有高灵敏度和特异性，准确量化甲基化水平。
③通过构建稳定转染的PAX1干扰和过表达子宫内膜癌细胞系，研究PAX1对癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。这种基因功能研究能够直接揭示PAX1在癌细胞中的生物学作用。
④利用CCK-8实验检测PAX1对细胞增殖的影响，Transwell实验检测其对细胞侵袭和迁移的影响，从功能上验证PAX1在癌细胞中的作用。
⑤通过蛋白印迹法检测PAX1对上皮间充质转化（EMT）及增殖相关分子的影响，进一步揭示PAX1在癌细胞中的分子机制。
⑥利用免疫共沉淀技术结合液相色谱-质谱分析，筛选与PAX1相互作用的蛋白，并通过功能性实验验证这些蛋白对癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响，探索PAX1下游的信号通路。
（1）技术路线：全基因组甲基化芯片筛选出甲基化差异表达基因并设计甲基化特异性引物——实时甲基化特异性PCR技术（QMSP）检测正常女性外周血、EC患者外周血、正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中PAX1基因甲基化水平——半定量免疫组化、定量 PCR 和蛋白印迹法检测其在子宫内膜癌中表达水平——用Kaplan-Meier法分析EC患者PAX1表达水平与患者生存期的关系，绘制ROC曲线验证PAX1甲基化在EC中的诊断效能。
PAX1在多种癌症中因甲基化而沉默，是一种肿瘤抑制基因，它还是一种潜在的筛查标记物。因而此次研究的关键性技术是慢病毒转染建立基因沉默技术，该技术所使用的慢病毒能够高效感染细胞，能使目的基因稳定并长期表达，此外还具有低免疫原性，不易引起免疫排斥反应导致受体损伤或死亡。这次研究还应用了蛋白印迹技术、荧光定量RT-PCR技术、甲基化特异性PCR技术、Kaplan-Meier曲线分析技术等。
（2）拟解决的问题：
①慢病毒的保存：如何保证病毒的纯度和完整性，如何保证病毒的高活性？
②基因沉默效率的检测：如何选择合适的方法（荧光定量 RT-PCR）以准确评估基因在mRNA水平和蛋白质水平的沉默效果?如何检测能保证观察到的沉默效果事特异性针对目标基因的？
③如何准确建立转染PAX1表达沉默模型？
④如何保证外周血等实验标本的数量充足？
⑤能否寻找出更为准确的具有标志意义性的生物标志物。
⑥如何能够稳定控制细胞异质性？
⑦如何收集更多的数据来确定基于血液的 DNA 甲基化在生物学上是否合理，以及在外周血中测量的 DNA 甲基化是否是一种更有效且信息量更丰富的生物标志物？
⑧安全性问题：如何保证实验操作安全？进行此次实验的具体步骤和防范措施都要慎重考虑。
（3）预期研究结果：
①阐明在子宫内膜癌中 PAX1基因甲基化水平及分子信号途径。
②发表ESI源期刊收录论文2篇。
③协助培养2-3名研究生。
计划进度    开始时间     截止时间       完成的主要指标(要可考核)
                  2023.10       2024.06      收集标本，进行组织学研究，研究PAX1基因在子宫内膜癌中的表达。
                  2024.07       2024.12      进行细胞实验，深入研究研究PAX1，寻找两者之间信号通路。
                  2025.01       2025.06      进行动物实验，进一步验证假说。
                  2025.06       2025.10      整理数据，撰写并发表论文。
①研究积累：查阅相当数量的文献资料中表明 PAX1 基因的表达水平变化以及表观遗传学改变可能在子宫内膜癌的发生以及疾病的进展中起重要作用
②已取得的成绩：前期项目指导老师已指导研究生发表学位论文《PAX1基因启动子甲基化在子宫内膜癌中的表达及意义》，深入探讨了PAX1基因启动子与EC发生之间的相关性，为本项目的研究方向提供了重要的理论支持。

1.已具备的条件
（一）本课题小组成员均来自于临床医学专业与口腔医学专业，成员学习成绩较好，能够快速掌握项目所需的专业知识和实验技能，同时团队成员具有文献检索能力与综述撰写能力。此外，成员具备良好的团队协作能力、组织分工能力与科研素养，能够高效完成任务。
（二）项目指导老师有丰富经验，已在课题上有突破，慢病毒转染建立基因沉默技术为本研究的一个关键技术问题，科研项目组成员已熟练掌握慢病毒表达载体构建、转染细胞等工作，技术上已有保障。 
2.尚缺少的条件
①实验经费
②实验原材料
③团队科研经验
3.解决方法
①导师安排研究生或实验室成员进行技术培训
②定期组织团队学习实验方法以及查找文献
③通过申报立项解决实验经费

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 10000.00 10000.00
1. 业务费 5000.00 无 2500.00 2500.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 5000.00 版面费 2500.00 2500.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 15000.00 试剂 7500.00 7500.00
4. 材料费 0.00 无 0.00 0.00
结束

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