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DUSP12 在睾丸间质细胞发育中的作用及机制研究

申报人：贾皓程 申报日期：2025-03-27

基本情况

2025创新项目
DUSP12 在睾丸间质细胞发育中的作用及机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
不孕不育是影响全球约15%育龄夫妇的重要公共卫生问题，其中男性方面因素约占30%-50%，而睾丸间质细胞（Leydig细胞）功能障碍是导致雄性生殖能力下降的关键因素之一。双特异性磷酸酶12（DUSP12）属于丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶（MKP）家族成员，可通过去磷酸化作用调控MAPK等信号通路的活性，参与细胞增殖、分化及应激响应。前期研究发现，DUSP12在睾丸间质细胞中高表达，但其在间质细胞发育中的功能及其与男性不育的关联尚未被系统解析。本项目拟通过Sf1-Cre（在性腺体细胞中特异性表达）小鼠和Cyp17-Cre（在成熟的睾丸间质细胞中表达）小鼠构建睾丸不同发育时期特异性Dsup12敲除模型，分别研究DUSP12在睾丸间质细胞谱系分化、功能维持中的作用。本项目旨在阐明DUSP12在雄性生殖系统中的关键作用，为理解睾丸间质细胞发育障碍的病理机制提供新视角，同时为男性不育的精准诊断和靶向治疗（如DUSP12通路干预策略）奠定理论基础。
1.2023年9月以来跟随指导教师在学校公共科研平台进行生殖生物学相关研究，熟练掌握小鼠饲养、基因型鉴定、免疫组化等实验技术。
2.以共一身份在《Biomedicines》发表SCI论文一篇。Meng K, Jia H, Hou X, Zhu Z, Lu Y, Feng Y, Feng J, Xia Y, Tan R, Cui F, Yuan J. Mitochondrial Dysfunction in Neurodegenerative Diseases: Mechanisms and Corresponding Therapeutic Strategies.doi: 10.3390/biomedicines13020327.
3.以第三作者身份撰写SCI论文一篇，已投稿《Chinese Medical Journal》，小修已修回。Xiaomei Wang, Ziming Zhu, Haocheng Jia, Xueyi Lu, Yingze Zhang, Jinzheng Wang, Qianxue Yu, Yingxin Zhu, Fei Gao, Rubin Tan, and Jinxiang Yuan. Mitochondrial dynamics participate in spatiotemporal regulation of Chronic obstructive pulmonary and pulmonary hypertension diseases. Chinese Medical Journal.(Under Review after Revision)
1.山东省自然科学基金青年项目，ZR2020QH042，Wt1基因及其可变剪切体调控多囊卵巢颗粒细胞分化的作用机制研究，2021/01-2023/12，15万，在研，主持；
2.贺林院士新医学临床转化工作站科研基金面上项目JYHL2021MS13，雌激素受体ESR1与ESR2在卵巢癌生长中的作用机制研究，2022/01-2024/12，10万，在研，主持；
3.济宁医学院教师科研扶持基金，JYFC2019KJ010，Wt1基因调控PCOS大鼠卵泡颗粒细胞分化的研究，2020/01-2022/12，3万元，已结题，主持；
4.国家自然科学基金面上项目，31873033，牛卵母细胞玻璃化冷冻导致基因组DNA甲基化降低的调控机理，2019/01-2022/12，59万元，已结题，参加；
5.山东省医药卫生科技发展计划项目，202002080986，GLDN对胃癌的调控机制研究，2021.01-2022.12，在研，参加。
1.对本项目提供设备和动物等相关资源上的支持；
2.对本项目相关知识进行提前教学并在项目进行时提供合理建议与指导；
3.对本项目成员进行相关实验技术的教学并进行组织协调，使项目能够顺利进行；
4.对本项目出现的问题与难题进行及时的处理与指导。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
贾皓程 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 实验设计、数据统计和分析
李欣洳 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 HE染色、免疫组织化学染色
蒋文佳 临床医学院（附属医院） 临床医学（麻醉学方向） 2023 小鼠解剖
冯盈盈 临床医学院（附属医院） 临床医学（麻醉学方向） 2023 小鼠饲养与构建
冯靖雯 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 原位杂交

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
孟凯 科研处 否
王晓梅 基础医学院 否

立项依据

1.明确DUSP12基因在睾丸间质细胞谱系分化和功能维持中的作用。
2.明确DUSP12基因影响睾丸间质细胞谱系分化和功能维持的具体机制，旨在进一步加深对DUSP12在男性生育力中发挥作用的认识。
  1.构建睾丸间质细胞不同发育时期的特异性Dusp12敲除小鼠模型
  我们在前期的研究中发现，在小鼠胚胎期特异性敲除Dusp12会导致睾丸发育不良，睾丸的重量、大小都远小于同月龄的野生型小鼠。但是尚不清楚Dusp12基因究竟是如何影响睾丸间质细胞的谱系分化和功能维持的，因此需要设计在睾丸间质细胞不同发育阶段特异性敲除Dusp12的小鼠模型分别探究Dusp12对睾丸间质细胞谱系分化和功能维持的影响。具体研究如下：
  （1）构建在性腺体细胞中特异性敲除Dusp12的小鼠模型
在野生（WT）型小鼠睾丸间质细胞的Dusp12基因两端使用CRISPR/Cas9插入LoxP酶切位点，形成Dusp12flox/flox小鼠。将Dusp12flox/flox小鼠与Sf1-Cre小鼠交配，则子代小鼠携带Dusp12flox/+和Sf1-Cre+/-。Sf1-Cre小鼠的Cre重组酶表达受Sf1启动子调控，识别并剪切Dusp12基因两侧的LoxP位点。而Sf1在性腺体细胞向睾丸间质细胞分化前就已经表达，所以此时即可完成Dusp12基因的特异性敲除，该模型小鼠可以探究Dusp12对睾丸间质细胞谱系分化的影响。
  （2）构建在成熟睾丸间质细胞中特异性敲除Dusp12的小鼠模型
  使用与Sf1-Cre方案相同的步骤构建Dusp12flox/flox小鼠，将其与Cyp17-Cre小鼠交配，从而获得携带Dusp12flox/+和Cyp17-Cre+/-的小鼠。Cyp17会在分化完成的睾丸间质细胞中表达，进而激活Cre重组酶，实现睾丸间质细胞分化后的特异性Dusp12敲除。使用该模型可以探究Dusp12对睾丸间质细胞功能维持的影响。
  2.Dusp12基因在睾丸间质细胞谱系分化中的作用及机制研究
  （1）Dusp12基因在性腺体细胞分化前缺失对雄性小鼠表型和生育力影响的研究
  本项目的前期研究发现，采用CRISPR/Cas9技术在性腺体细胞特异性敲除小鼠Dusp12基因，会导致雄鼠体重减轻，睾丸缩小，证明Dusp12能够促进雄鼠睾丸的正常发育。因此我们需要做如下研究：
  ①生育力评估：将Dusp12flox/flox小鼠与Sf1-Cre小鼠交配获得的8周龄Dusp12-/-雄鼠与性成熟WT雌鼠（1:2比例）合笼4周，记录妊娠率、每窝产仔数及子代存活率。
  ②表型分析：在不同发育时间检测Dusp12敲除后小鼠体重、睾丸体积、组织学形态和睾丸索结构完整性的变化。
  ③睾丸组织学分析：取Dusp12flox/flox小鼠与Sf1-Cre小鼠交配获得的胚胎期12.5天、胚胎期16.5天、一周龄、三周龄和8周龄Dusp12-/-与WT雄鼠睾丸，固定后脱水包埋，制备5 μm厚石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色。评估生精小管结构完整性（管径、生精上皮厚度）、生精细胞层数及支持细胞排列。统计各级生精细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞）比例及异常退化小管比例。
  (2)影响性腺体细胞向睾丸间质细胞分化的机制研究
性腺体细胞会随着发育的进行，分化为睾丸间质细胞和支持细胞。当前的研究表明，DUSP12可以通过调控MAPK通路，参与细胞分化和功能维持。根据我们前期的实验，我们推测DUSP12同样通过MAPK通路作用于性腺体细胞。具体研究如下：
  ①基因表达分析:对分离的睾丸进行免疫组织化学染色，检测睾丸间质细胞特异基因（Lhr、Cyp19a1、Cyp11a1、Cyp17a1、3β-hsd、Star等）、支持细胞特异基因（Wt1、Amh、Sox9、Sox8、Dmrt1, Gdnf 、Dhh等）和生殖细胞特异基因（DDX4、DAZL等）的表达变化。为进一步探究对性腺体细胞命运的影响，利用Rosa26-LSL-tdTomato小鼠模型做谱系追踪实验，通过睾丸连续切片进行多重免疫荧光染色（3β-HSD、CYP17A1），检测DUSP12对间质细胞分化的影响。
  ②信号通路活性检测：使用MAPK通路抑制剂（如ERK抑制剂U0126、p38抑制剂SB203580）和激活剂（EGF、PMA）干预，明确Dusp12敲除后通路失衡的关键节点。在Dusp12-/-小鼠原代睾丸间质细胞中，分别加入ERK抑制剂（U0126）或激活剂（EGF），通过Western blot检测ERK磷酸化水平（Thr202/Tyr204）及下游靶蛋白（c-Fos、c-Jun）表达变化。观察在使用MAPK抑制剂后，性腺体细胞分化受到阻滞的情况是否有好转，能否继续分化为睾丸间质细胞。
  3.Dusp12基因在睾丸间质细胞功能维持中的作用及机制研究
  （1）Dusp12在成熟睾丸间质细胞中缺失对雄性小鼠睾丸细胞功能和精子发生的影响
  Dusp12通过MAPK通路调节细胞的分化和功能维持。我们在前期的研究中使用Sf1-Cre小鼠特异性的在性腺体细胞中敲除Dusp12，通过对睾丸的组织学分析，我们发现此时的睾丸间质细胞分化出现异常，难以研究Dusp12在睾丸间质细胞功能维持中的作用，因此我们使用Dusp12flox/flox小鼠与Cyp17-Cre小鼠交配获得的Dusp12-/-小鼠做如下研究：
  ①生育力评估：将Dusp12flox/flox小鼠与Cyp17-Cre小鼠交配获得的8周龄Dusp12-/-雄鼠与性成熟WT雌鼠（1:2比例）合笼4周，记录妊娠率、每窝产仔数及子代存活率。
  ②表型分析：在不同发育时间检测Dusp12敲除后小鼠体重、睾丸体积、组织学形态和睾丸索结构完整性的变化。
  ③睾丸组织学分析：取Dusp12flox/flox小鼠与Cyp17-Cre小鼠交配获得的8周龄Dusp12-/-与WT雄鼠睾丸，固定后脱水包埋，制备5 μm厚石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色。评估生精小管结构完整性（管径、生精上皮厚度）、生精细胞层数及支持细胞排列。统计各级生精细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞）比例及异常退化小管比例。
  ④细胞表型检测分析：静脉注射生物示踪剂并结合透射电镜技术，动态追踪示踪分子在睾丸组织中的扩散路径，定量评估血睾屏障的结构完整性。使用EDU或TUNEL染色检测睾丸内生殖细胞、支持细胞及间质细胞的增殖、凋亡情况。
  （2）Dusp12基因影响睾丸间质细胞功能维持的机制研究
  目前已知Dusp12作用于MAPK通路，可能通过去磷酸化ERK的Thr202/Tyr204位点，终止其信号传导，形成负反馈调节环路参与对小鼠睾丸间质细胞的调控。因此我们主要针对MAPK信号通路做如下研究：
  ①基因表达分析: 对分离的睾丸组织切片进行免疫组织化学染色，检测睾丸间质细胞特异基因（Cyp11a1、Cyp17a1、3β-hsd等）的表达情况。通过RT-qPCR和WB实验进一步检测睾丸间质细胞特异基因Lhr、Cyp19a1、Cyp11a1、Cyp17a1、3β-hsd、Star等的表达水平，以推测睾丸间质细胞合成睾酮等功能的维持情况。
  ②细胞功能分析：从野生型小鼠和Dusp12f/f；Cyp17-Cre小鼠的睾丸中分离并从纯化睾丸间质细胞，进行细胞培养，使用CCK-8/MTT检测间质细胞的细胞增殖情况，使用Annexin V/PI流式检测间质细胞凋亡情况。从培养的细胞中收集上清液，使用ELISA法检测并比较两种小鼠的睾酮水平。
  ③信号通路活性及作用分析：在Dusp12-/-小鼠原代睾丸间质细胞中，分别加入ERK抑制剂（U0126）或激活剂（EGF），筛选Dusp12缺失后MAPK/JNK通路关键节点（p-JNK、p-ERK）及下游转录因子（c-JUN、ATF2）的磷酸化水平变化。在使用MAPK通路抑制剂后，观察雄性小鼠睾丸发育和生育力表型的变化、间质细胞的增殖和凋亡情况以及睾酮分泌是否抑制。而后使用MAPK通路激活剂，观察以上情况是否出现逆转。
  1.睾丸间质细胞的发育与功能
  睾丸间质细胞（leydig细胞）是一种主要存在于睾丸曲细精管之间疏松结缔组织的内分泌细胞，在维持男性生殖功能、第二性征及全身代谢稳态中扮演关键角色[1, 2]。
  睾丸间质细胞的发育过程分为胚胎期、青春期前及成熟期[3]。在胚胎发育早期，中肾间充质细胞分化为原始间质细胞，并激活SF1等一系列转录因子，以促进原始间质细胞向前体睾丸间质细胞分化[4]。前体间质细胞受到生殖细胞和支持细胞的旁分泌调节以及绒毛膜促性腺激素和类固醇生成酶的刺激，启动睾酮合成，进而驱动胚胎期男性生殖器的分化[5, 6]。从出生后致青春期前，前体间质细胞将维持相对静止状态。进入青春期后，前体间质细胞会在黄体生成素（LH）的刺激下重新激活，并增殖分化为成体睾丸间质细胞[7]。成熟睾丸间质细胞分泌的睾酮、胰岛素样因子3（INSL3）等激素，对男性第二性征维持、精子发生和生殖健康有重大意义[3, 8]。
  2.DUSP12的基本介绍
  双特异性磷酸酶12（DUSP12），是一种蛋白酪氨酸磷酸酶，可以去磷酸化磷酸酪氨酸（pTyr）和磷酸丝氨酸/苏氨酸（pSer/pThr）残基，作为细胞外信号调节激酶（ERK）、p38和c-Jun N末端激酶（JNK）的负调控因子参与维持丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应的动态平衡[9]。
  DUSP12在不同组织中的特异性作用可能为相关疾病的治疗提供靶点。与野生型小鼠相比，DUSP12缺失的主动脉狭窄小鼠的JNK1/2磷酸化水平升高，心脏纤维化和心脏肥厚加重，心功能受损，而过表达DUSP12则会减轻心脏受损的程度，这表明DUSP12通过去磷酸化JNK1/2来保护病理性心脏肥大[10]。DUSP12在抗感染和炎症反应中也有重要作用。使用LPS处理DUSP12过表达的小鼠巨噬细胞，发现p38和JNK水平显著下调，促炎因子减少。而在用李斯特菌感染的DUSP12过表达的小鼠巨噬细胞中，同样表现为p38和促炎因子大幅减少[9]。除此之外，DUSP12还参与调节细胞周期和有丝分裂。Mai Abdusamad等发现敲除DUSP12的HeLa细胞在有丝分裂G2/M 期积累，出现中期染色体排列错误等，导致有丝分裂缺陷[11]。
  3.DUSP12参与调控睾丸发育
  DUSP12作为MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路的负调控因子，在小鼠睾丸间质细胞的发育中可能发挥着重要作用[12]。MAPK通路主要包括细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun NH2末端激酶(JNK)和p38，可介导与多种细胞活动相关的细胞内信号传导，如细胞增殖、分化、应激反应、炎症和细胞凋亡等[13]。Soichi Yamashita等人通过Mek1f/f;Mek2−/−;iCre+小鼠的实验发现，该小鼠的睾丸间质细胞发育不全，且其标志物如睾酮合成限速酶StAR（类固醇生成急性调节蛋白）等的表达显著降低，并由此实验证明MEK/ERK 级联反应对小鼠睾丸间质细胞的数量和功能特性极为重要[14]。然而，ERK的持续激活可能会导致代谢失衡，我们通过研究分析，DUSP12可能通过去磷酸化ERK的Thr202/Tyr204位点，终止其信号传导，形成负反馈调节环路参与对小鼠睾丸间质细胞的调控[12]。在氧化应激或炎症条件下，持续激活的JNK和p38可促进细胞坏死和凋亡[15]。赵等人通过对氧化损伤的TM3 Leydig细胞模型的研究发现TM3细胞中的p-p38和p-JNK的表达显著增强，且细胞活性明显降低[16]。而DUSP12可以抑制p38和JNK的激活来保护睾丸间质细胞的功能完整性[9]。
  睾丸间质细胞从胚胎期起始的有序的发育过程，赋予了其在男性生殖方面不可或缺的功能。我们前期研究发现DUSP12基因的功能颇为广泛与有趣，并且可能对小鼠睾丸间质细胞发育有着不可忽视的影响，接下来我们将深入探究该基因影响睾丸间质细胞发育和功能的分子机制，为男性生殖相关疾病的诊疗提供新的理论支撑。
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图 1. Dusp12-/-通过抑制睾丸间质细胞分化或功能来破坏睾丸功能
（本图由Figdraw 绘制）
参考文献
1. Wang, F.C., et al., Loss of PBX1 function in Leydig cells causes testicular dysgenesis and male sterility. Cell Mol Life Sci, 2024. 81(1): p. 212.
2. Shao, J., et al., Effects of aging and macrophages on mice stem Leydig cell proliferation and differentiation in vitro. Front Endocrinol (Lausanne), 2023. 14: p. 1139281.
3. Bhattacharya, I. and S. Dey, Emerging concepts on Leydig cell development in fetal and adult testis. Front Endocrinol (Lausanne), 2022. 13: p. 1086276.
4. Mendis-Handagama, S.M. and H.B. Ariyaratne, Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal testis. Biol Reprod, 2001. 65(3): p. 660-71.
5. Hu, Y., et al., VDR promotes testosterone synthesis in mouse Leydig cells via regulation of cholesterol side chain cleavage cytochrome P450 (Cyp11a1) expression. Genes Genomics, 2023. 45(11): p. 1377-1387.
6. Tian, H., et al., Regulation of spermatogonial stem cell differentiation by Sertoli cells-derived exosomes through paracrine and autocrine signaling. J Cell Physiol, 2024. 239(4): p. e31202.
7. Abe, S.I., Behavior and Functional Roles of CD34(+) Mesenchymal Cells in Mammalian Testes. Int J Mol Sci, 2022. 23(17).
8. Anand-Ivell, R., et al., Insulin-like peptide 3 (INSL3) as an indicator of leydig cell insufficiency (LCI) in Middle-aged and older men with hypogonadism: reference range and threshold. Aging Male, 2024. 27(1): p. 2346322.
9. Cho, S.S.L., et al., Dual-Specificity Phosphatase 12 Targets p38 MAP Kinase to Regulate Macrophage Response to Intracellular Bacterial Infection. Front Immunol, 2017. 8: p. 1259.
10. Li, W.M., et al., Dual specific phosphatase 12 ameliorates cardiac hypertrophy in response to pressure overload. Clin Sci (Lond), 2017. 131(2): p. 141-154.
11. He, J., et al., Increasing expression of dual-specificity phosphatase 12 mitigates oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-induced neuronal apoptosis and inflammation through inactivation of the ASK1-JNK/p38 MAPK pathway. Autoimmunity, 2024. 57(1): p. 2345919.
12. Patterson, K.I., et al., Dual-specificity phosphatases: critical regulators with diverse cellular targets. Biochem J, 2009. 418(3): p. 475-89.
13. Wada, T. and J.M. Penninger, Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation. Oncogene, 2004. 23(16): p. 2838-49.
14. Yamashita, S., et al., The Leydig cell MEK/ERK pathway is critical for maintaining a functional population of adult Leydig cells and for fertility. Mol Endocrinol, 2011. 25(7): p. 1211-22.
15. Hotamisligil, G.S. and R.J. Davis, Cell Signaling and Stress Responses. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2016. 8(10).
16. Zhao, G., et al., Echinacoside Protects Against Dysfunction of Spermatogenesis Through the MAPK Signaling Pathway. Reprod Sci, 2022. 29(5): p. 1586-1596.
1.创新点
  本项目通过Dusp12flox/flox小鼠与Sf1-Cre与Cyp17-Cre小鼠交配，在雄性小鼠睾丸发育的不同阶段特异性敲除Dusp12基因，系统解析Dusp12在睾丸间质细胞谱系建立、分化与维持中的功能。突破了传统实验中单一敲除模型的局限性，揭示Dusp12在睾丸间质细胞的不同发育阶段对MAPK信号通路的差异性调控，为理解磷酸酶动态调控生殖细胞发育提供了全新视角。
2.项目特色
   男性不育问题已成为严重的社会问题， 目前被广泛研究。本项目采用了双模型的研究方法，通过Sf1-Cre（靶向间质细胞前体/胚胎期）与Cyp17-Cre（靶向成熟间质细胞/青春期）模型，首次区分Dusp12在间细胞发育早期（增殖分化）与晚期（功能维持）的独立作用，突破传统研究对发育阶段异质性的忽视。此外，本项目聚焦Dusp12下游可干预靶点（如JN抑制剂、抗氧化剂），探索基于阶段特异性的男性不育治疗策略，为开发“时间窗治疗”等精准医学方案提供理论依据。研究Dusp12敲除影响睾丸间质细胞发育的相关内容尚未研究与报道，所以本项目有望揭示Dusp12在生殖系统中的潜在作用。
1.技术路线
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2.拟解决的问题
    目前已知,Dusp12敲除会影响睾丸间质细胞发育，然而，其在睾丸间质细胞分化及功能维持中的影响及具体机制目前尚不明确。因此，本项目拟解决问题是揭示Dusp12是如何影响雄性小鼠生育的。
3.预期成果
  （1）明确Dusp12敲除对小鼠睾丸功能的影响。
  （2）明确Dusp12敲除影响小鼠生育力的具体机制。
  （3）发表学术论文1-2篇。 
2025.06-2025.12
  （1）获得阶段特异性敲除模型（Sf1-Cre：胚胎期敲除；Cyp17-Cre：青春期敲除）。
  （2）基础表型评估：包括称量雄鼠体重、睾丸重量。HE染色分析睾丸组织形态（生精小管结构、间质细胞分布）。附睾精子计数及活力检测（CASA系统）。
2026.01-2027.01
  分子机制解析与功能验证：验证Dusp12敲除后异常的靶基因，研究其如何破坏睾丸组织导致雄鼠生育力下降的具体机制。
2027.02-2027.06
  （1）整理实验数据，完成统计分析及可视化（图表绘制）。
  （2）撰写研究论文1-2篇。
(1)与本项目有关的研究积累
  ①检测雄性小鼠睾丸中DUSP12基因的表达定位情况
  为了明确Dusp12在雄性小鼠中的表达情况，我们对不同年龄的野生型小鼠进行原位杂交染色。实验结果显示，胚胎期12.5天时Dusp12在雄性小鼠原始性腺体细胞中表达（图2A），随着个体发育进程，在胚胎期16.5天、出生后1周、3周、8周时Dusp12逐渐局限在睾丸间质细胞中表达（图2B-E）。
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图2. Dusp12在不同时期雄性小鼠性腺中的表达。A：Dusp12在胚胎期12.5天雄性小鼠性腺中的表达；B：Dusp12在胚胎期16.5天雄性小鼠性腺中的表达；C：Dusp12在1周龄雄性小鼠性腺中的表达；D：Dusp12在3周龄雄性小鼠性腺中的表达；E：Dusp12在8周龄雄性小鼠性腺中的表达。
（40×）

  ②构建性腺体细胞特异性敲除Dusp12小鼠
  Dusp12基因有7个转录本。根据Dusp12基因的结构，将Dusp12-201（ENSMUST00000027970.13）转录本的第2外显子-第5外显子作为敲除区域。该区域包含517bp的编码序列。敲除该区域将导致蛋白质功能的破坏。我们采用CRISPR/Cas9技术来修饰Dusp12基因（图3A）。将CRISPR/Cas9系统和受体显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，获得F0阳性小鼠。经PCR和测序证实的F0代阳性小鼠与C57BL/6J小鼠交配，获得稳定遗传的F1代小鼠模型。F1代小鼠与Sf1-Cre模型小鼠交配后Dusp12将被特异性敲除，其在性腺体细胞中的功能丧失（图3B）。
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图3.Dusp12f/f；Sf1-Cre小鼠的构建 A：CRISPR-Cas9技术对Dusp12基因进行基因编辑原理示意图；B：Dusp12f/f；Sf1-Cre小鼠电泳分析示意图。

  ③Dusp12敲除对雄性小鼠睾丸发育的影响
  前期构建了Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠，为了探究Dusp12对睾丸发育的影响，我们摘取了8周龄时野生型及Dusp12f/f；Sf1-Cre小鼠的睾丸和附睾（图4A），我们发现Dusp12敲除小鼠的睾丸体积明显减小，睾丸重量和睾丸指数均存在显著差异（图4B、C）。说明Dusp12的敲除，影响雄性小鼠睾丸发育并且可能影响精子发生。
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图4.A：8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre小鼠与野生型小鼠睾丸及附睾图；B：8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠与野生型小鼠的睾丸重量差异；C：8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠与野生型小鼠睾丸指数差异。以平均值±SD表示。***P＜0.001，****P＜0.0001。

  ④Dusp12敲除对睾丸发育和精子发生的影响
  为了进一步探究Dusp12对睾丸发育和精子发生的影响，我们对8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠和野生型雄性小鼠的睾丸及附睾进行HE染色。结果发现相对于野生型小鼠与Dusp12敲除小鼠的睾丸发育有显著差异，主要表现为Dusp12f/f；Sf1-Cre的雄性小鼠睾丸中曲细精管机构明显改变，曲细精管内的细胞数明显减少且排列松散，其附睾中几乎观察不到成熟精子（图5A、B）。
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图5.睾丸、附睾的HE染色。A：8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠与野生型小鼠的睾丸HE染色；B：8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠与野生型小鼠的附睾HE染色。（400×）

  ⑤Dusp12敲除对睾丸支持细胞极性的影响
  初步探究DUSP12对睾丸支持细胞极性的影响，我们对8周龄的野生型及Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠的生殖细胞（MVH）、支持细胞（SOX9）和间质细胞（CYP17A1）进行免疫组织化学染色。结果显示生殖细胞数量显著减少且排列松散（图6A），间质细胞分布广泛（图6B），本应排列在曲细精管管周的支持细胞开始向管内迁移，表现为支持细胞紊乱（图6C）。
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图6.睾丸组织的免疫组织化学染色。A：8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠与野生型小鼠的生殖细胞（MVH）免疫组化染色；B：8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠与野生型小鼠的间质细胞（CYP17A1）免疫组化染色；C：8周龄Dusp12f/f；Sf1-Cre雄性小鼠与野生型小鼠的支持细胞（SOX9）免疫组化染色。（400×）

（2） 已取得的成绩
  ①项目负责人参加山东省大学生医养健康创新创业大赛，获得二等奖、三等奖各一项。
  ②项目负责人作为核心成员（第三参与人）参与2024年校级大学生创新训练项目“Mc4r敲除调控雄性小鼠生育力下降的机制研究”
  ③项目负责人贾皓程前期以共同第一作者身份、项目成员冯盈盈以第四作者身份、冯靖雯以第五作者身份在《Biomedicines》发表SCI论文一篇。
·Meng K, Jia H, Hou X, Zhu Z, Lu Y, Feng Y, Feng J, Xia Y, Tan R, Cui F, Yuan J. Mitochondrial Dysfunction in Neurodegenerative Diseases: Mechanisms and Corresponding Therapeutic Strategies.doi: 10.3390/biomedicines13020327.（2025，中科院3区，IF=3.9）
  通过查阅文献，了解相关知识和其他综述的撰写，现在已经对DUSP12相关功能、睾丸间质细胞分化与功能维持、MAPK通路、精子发生，男性不育等本项目相关内容和其他基本的生理病理知识有一定的熟悉度。此外，负责人在老师的带领下已经学习本项目相关实验技术（如基因测序、免疫组化和原位杂交等），积累了丰富经验，为本项目的顺利进行提供了理论和实验基础。因此，基于团队成员平时的练习与相关理论知识的积累、成员们互相协调的合作与帮助以及指导老师在本方面具有的丰富经验和基础并对本实验的大力支持，本项目具有良好的基础，为项目的实施增加了可行性。
本项目主要在济宁医学院公共科研平台和实验动物中心进行实验，完全具备开展本项目的所有仪器设备；前期已购买Sf1-Cre和Cyp17-Cre小鼠，并成功建立了扩繁体系，动物数量较为足够；细胞培养、基因测序等实验均能够顺利进行，该项目组成员已基本掌握开展本项目的实验技术如基因测序、原位杂交、免疫荧光和 WB 技术等。实现本项目的实验条件已具备，成员足够。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 购买试剂及论文出版 16000.00 4000.00
1. 业务费 4000.00 无 0.00 4000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 4000.00 论文出版费用 0.00 4000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 16000.00 试剂、耗材、小鼠饲料 16000.00 0.00
结束

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