薄荷细胞外囊泡对糖尿病慢性创面的治疗作用及机制研究

申报人：赵蕊申报日期：2025-03-27

基本情况

所属批次:

2025创新项目

项目名称:

薄荷细胞外囊泡对糖尿病慢性创面的治疗作用及机制研究学生申报

项目类型:

创新训练项目

所属学科门类:

医学

所属专业类:

基础医学类

项目来源名称:

学生自主选题

项目归属学院:

项目期限:

二年期

项目简介:

糖尿病慢性创面（如糖尿病足溃疡）是糖尿病患者由高血糖介导的微循环障碍、神经病变及免疫失调引发的严重并发症，存在愈合延迟、易感染和复发等风险，传统疗法（清创、抗生素等）效果局限且截肢率高。薄荷及其活性成分具有抗菌、抗炎、抗氧化及促愈镇痛等作用，但其在糖尿病创面治疗中的应用尚未充分探索。植物外囊泡（PEVs）作为纳米级生物活性载体，可递送蛋白质、脂质及RNA等生物活性分子，参与细胞间通讯和生理调控，且因低抗原性及靶向优势规避传统给药缺陷。本研究通过液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术等解析薄荷外囊泡（ MEVs）成分，筛选出52种活性分子（23种高丰度），并预测其促愈靶点与通路，揭示潜在治疗糖尿病慢性创面的分子机制。进一步构建糖尿病慢性创面小鼠模型，采用免疫组化、Western Blot等技术验证MEVs对创面修复的调控机制，包括炎症抑制、血管新生及细胞增殖等关键通路。本项目采用MEVs局部皮下注射的方法，实现高效递送，避免首过效应，为开发低免疫原性、高靶向性的新型治疗策略提供理论依据与实验基础。

负责人曾经参与科研的情况:

本项目组通过两年系统化科研训练（2023-2025），已建立完整的实验技术体系：

1. 病理学技术：熟练掌握组织石蜡/冰冻切片制备（厚度5 μm）、HE染色及显微成像分析

2. 分子机制研究：具备Western Blot（SDS-PAGE电泳、转膜及ECL显影）标准化操作能力

3. 疾病模型构建：成功建立Ⅱ型糖尿病慢性创面小鼠模型（n=32）并完成动态创面监测

4. 生物信息学分析：掌握TCGA/GEO数据库挖掘技术等。

现已完成项目核心实验：外泌体分离纯化（差速离心法）、透射电镜表征、纳米颗粒跟踪分析（NTA）等。

指导教师承担科研课题情况:

主持国家自然科学基金、山东省自然科学基金等省部级以上项目 5 项，发表包括中科院一区Top期刊Journal of Nanobiotechnology (F=10.6)，国际胞外囊泡协会ISEV会刊、胞外囊泡领域权威杂志Journal of Extracellular Vesicles (IF=15.5)等高质量论文20余篇。同时受邀担任Journal of Extracellular Vesicles、Journal of Advanced Research等国际知名期刊审稿人。

指导教师对本项目的支持情况:

教师将给本项目提供理论、技术及经费支持。

项目级别:

省级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	赵蕊	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2023	查阅资料，生物信息学分析，免疫组织化学分析，蛋白印迹检测，组织分析，小鼠糖尿病慢性创面模型造模	第一主持人
2	代欣茹	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2023	查阅资料，生物信息学分析，免疫组织化学分析，蛋白印迹检测，组织分析	成员
3	安震	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2023	查阅资料，生物信息学分析，免疫组织化学分析，蛋白印迹检测，组织分析	成员
4	张梦雅	临床医学院（附属医院）	临床医学（圣地卓越医师班）	2024	小鼠糖尿病慢性创面模型造模，蛋白印迹检测	成员
5	陈佳平	临床医学院（附属医院）	临床医学（圣地卓越医师班）	2024	小鼠糖尿病慢性创面模型造模，蛋白印迹检测	成员
6	庄瑞雪	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2023	查阅资料，小鼠糖尿病慢性创面模型造模，蛋白印迹检测	成员

指导教师

序号	教师姓名	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	白春雨	精准医学研究院	否	第一指导教师

立项依据

研究目的:

基于PEVs在抗炎、抗氧化及组织修复中的独特优势（如高生物相容性、低免疫原性及靶向递送特性），本研究旨在系统性解析 MEVs的活性成分及其对糖尿病慢性创面的分子调控机制。通过多组学分析精确表征MEVs的蛋白质、脂质及核酸组成，结合生物信息学与分子对接技术筛选其潜在作用靶点（如TGF-β、VEGF等信号通路关键分子）。进一步利用糖尿病慢性创面小鼠模型及体外细胞实验（如成纤维细胞和血管内皮细胞的迁移），验证MEVs通过调控炎症微环境、促进血管新生及胶原重塑的分子机制。最终阐明MEVs多组分协同作用的药效基础，为开发基于植物外泌体的靶向治疗策略提供理论依据与转化潜力。

研究内容:

①　MEVs的提取和其相关活性成分和物理特性的测定

应用差速超离心的方法提取细胞外囊泡。将新鲜薄荷的茎叶磨碎挤压获得其汁液，随后将汁液依次(500-5000g离心10-30 min)去除死细胞，中速离心(10000g离心1h)去除细胞碎片，高速离心(150000g离心2.5h)收集颗粒，最后离心(10000g离心10min)得到较为纯净的薄荷外囊泡。

将提取物送检进行NTA检测及粒径分析，鉴于这两项技术需满足囊泡浓度≥90%的要求，其获得的数据结果显示MEVs浓度较高且粒径分布呈现典型的细胞外囊泡特征，表明该提取物中MEVs浓度符合实验要求。

②　利用生物信息学分析MEVs的潜在作用靶点和作用途径

薄荷活性成分和作用靶点的筛选：通过LC-MS和RNA测序得到MEVs的代谢组、蛋白质组和miRNA/mRNA数据。将有效成分导入Swiss Target Prediction平台预测化合物靶点。

潜在治疗靶点的筛选:应用OMIM、Genecards、Drugbank、TTD数据库筛选糖尿病慢性创面的疾病靶点。制作火山图和热图对差异基因进行分析，最后作韦恩图筛选出薄荷作用的潜在靶点。

蛋白质相互作用PPI网络构建：将薄荷治疗糖尿病慢性创面的目的靶点基因导入String数据库得到药物治疗疾病的蛋白互作图，利用Cytoscape软件计算网络的拓扑学性质，随后利用CytoNCA插件计算节点的六个拓扑参数，每次保留6个参数均高于PPI网络中相应参数中位值，构建新的PPI网络，最后获得核心靶点基因。

疾病潜在通路和核心靶点的验证：使用软件DAVID对核心靶点基因进行GO和KEGG富集分析，指出代谢和信号途径与研究条件的显著关联，得到疾病的潜在通路。应用PDP网站下载蛋白质，用PYMOL软件处理大分子蛋白，最后用autodock软件进行分子对接验证核心靶点。

③　MEVs对糖尿病慢性创面的影响

糖尿病慢性创面小鼠模型的构建及处理方法：将糖尿病小鼠麻醉后于背部备皮区构建全层皮肤缺损创面（直径1 cm），单笼饲养以避免交叉感染。

实验分组：创面无干预处理的阴性对照组（n=3），局部湿敷磷酸盐缓冲液（PBS）联合皮下注射等体积PBS的阳性对照组（n=3），以及根据预实验及文献依据（109 -1010particles/ml ），采用梯度浓度MEVs（1×109、5×109、1×1010particles/ml）进行创面湿敷联合皮下注射的 MEVs治疗组（n=3）。

干预周期：分别于术后第3天（炎症期）、第6天（增殖期）、第12天（重塑期）处死小鼠，采集创面组织及全身器官（肝、肾、皮肤）。

分析方法：进行HE染色评估炎症浸润、肉芽组织形成及表皮再生，利用免疫组化检测CD31（血管新生）、α-SMA（成纤维细胞活化）、Collagen I/III（胶原沉积）。

MEVs 治疗糖尿病慢性创面的安全性分析：分别收集糖尿病慢性创面小鼠阳性对照组、阴性对照组、MEVs注射-敷药组的肝、肾器官的组织和皮肤组织进行HE染色，分析细胞结构完整性及炎症损伤。分别收集 3组小鼠的血液，通过使用炎症因子 Elisa 检测数据盒检测血液中白介素-1、白介素-6、氧自由基、溶酶体酶等炎症因子的含量，以证明使用MEVs治疗的安全性。

MEVs 治疗糖尿病慢性创面的疗效评价：实验过程中进行创面愈合动态监测，每 24h 使用格尺对各组糖尿病慢性创面模型小鼠的创口大小进行测量并记录，直观观察创口愈合效果。对处死后的糖尿病慢性创面模型小鼠全身器官组织进行检测，观察药物对于糖尿病周围神经病变和糖尿病周围血管病变的治疗效果。

MEVs 治疗糖尿病慢性创面作用机制的分子解析：用荧光标记法探明MEVs在糖尿病慢性创面模型小鼠体内的具体作用位置进行靶向定位。为了阐明增殖与修复通路，在蛋白水平上用Western Blot检测Ki-67（增殖标志）、PCNA（DNA修复）、Cyclin D1/CDK4（细胞周期调控），在基因水平上用qPCR分析TGF-β1（纤维化）、VEGF-A（血管生成）、IL-10（抗炎）的mRNA表达。通过LC-MS联合KEGG富集通路，揭示MEVs多组分协同调控网络（如PI3K/Akt、NF-κB通路）。MEVs通过时序性调控JAK/STAT、MAPK 、MMPs/TIMPs、PI3K/AKT通路（p-AKT/AKT）、NF-κB通路（p-IκBα/IκBα）五大关键信号通路，靶向干预糖尿病创面愈合障碍。在炎症期，MEVs通过抑制JAK/STAT通路的STAT3磷酸化以及NF-κB通路的IκBα磷酸化，有效阻断促炎因子的级联释放，从而逆转慢性炎症微环境。进入增殖期后，MEVs激活PI3K/AKT通路和MAPK/ERK通路，协同促进成纤维细胞增殖、血管新生及再上皮化。在最终的重塑期，MEVs通过平衡MMPs/TIMPs系统，抑制细胞外基质的病理性降解，优化组织架构重建。

MEVs凭借其天然的囊泡递送优势，能够将功能性miRNA（如miR-125b）靶向递送至创面细胞，同步逆转高糖微环境导致的PI3K/AKT失活与NF-κB持续活化。这种独特机制实现了对“炎症消退-增殖激活-ECM平衡”三个愈合阶段的级联调控，为克服糖尿病难愈创面的微环境障碍提供了一种突破性的植物源性治疗新策略。

④　MEVs对成纤维细胞和血管内皮细胞细胞的作用

划痕实验：为了评估MEVs对皮肤细胞迁移能力的调控作用，模拟创面再上皮化过程，该实验将人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblasts, HSF）和人永生化表皮细胞（human immortalized keratinocyte cell line, HaCaT）接种于6孔板，待细胞融合至90%时，用200 μL无菌枪头垂直接触培养皿，匀速划出宽度一致的直线划痕。PBS清洗去除脱落细胞，更换含1% FBS的基础培养基（减少增殖干扰），分别加入空白对照、阳性对照及薄荷提取物（0.1%、0.5%、1%）。在0 h、12 h、24 h时，于倒置显微镜下固定位置拍照，ImageJ软件计算划痕面积闭合率。

Transwell血管生成：通过人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）的迁移与管腔形成能力，分析MEVs对血管新生的促进作用，揭示其改善创面微循环的潜力，本实验将 HUVEC重悬于无血清培养基，接种至Transwell上室。下室加入含10% FBS及不同浓度薄荷提取物的培养基（趋化诱导），培养24 h后，棉签擦除上室未迁移细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。随机选取5个视野，计算迁移至下室的细胞数。

EdU增殖检测：为阐明MEVs对皮肤细胞增殖的影响机制及其在创面修复中的作用，实验采用以下设计：将HaCaT细胞接种于24孔板（1×10⁴/孔），加入含梯度浓度MEVs的培养基培养24 h。按EdU试剂盒说明加入EdU工作液孵育2 h，固定后进行Click反应标记增殖细胞，DAPI复染细胞核。荧光显微镜下随机拍摄5个视野，计算EdU阳性细胞占比，定量评估DNA复制活性。同步设置流式细胞术检测组，经碘化丙啶（PI）染色后检测细胞周期分布（G0/G1、S、G2/M期分布比例），明确MEVs对细胞周期进程的调控作用。

⑤　信号通路调控验证

Western blot检测：为筛选MEVs调控的关键信号通路蛋白（如VEGF、TGF-β1、PI3K/Akt、NF-κB），解析其分子作用靶点，实验提取了EVs处理的HaCaT细胞总蛋白和核质分离试剂盒获取核/质组分（用于Nrf2定位验证），检测PI3K/AKT通路（p-AKT/AKT）、NF-κB通路（p-IκBα/IκBα）磷酸化水平（EVs组预期激活PI3K/AKT并抑制NF-κB）。利用ImageJ软件计算磷酸化/总蛋白比值，统计学验证MEVs对通路激活的显著性。

免疫组化检测：为在动物创面组织中定位特定蛋白（如CD31、胶原蛋白）的表达与分布，验证MEVs对血管生成及细胞外基质重塑的体内效果，本实验取糖尿病慢性创面组织（动物模型），4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后制备4 μm切片。使用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）高压修复，阻断内源性过氧化物酶，并进行染色与成像。使用p-Akt（1:200）、HO-1（1:100）、CD31（1:50）进行一抗孵育，4℃过夜。使用HRP标记二抗+DAB显色，苏木素复染细胞核。进行定量分析，即使用Image-Pro Plus软件计算阳性染色面积占比和积分光密度（Integrated Optical Density，IOD）。

国、内外研究现状和发展动态:

①　传统药物与中西医结合疗法：中医药治疗糖尿病通常采用内治法与外治法相结合的策略，并依据患者的整体状况及病情发展阶段进行综合治疗，以提升疗效。例如，复某通脉胶囊通过拮抗氧化应激、促进神经再生，显著改善肢体末梢血供[1]；脉络舒通颗粒外洗可抑制溃疡组织炎症因子、上调局部VEGF水平，加速慢性溃疡愈合[2]；四妙勇安颗粒则对湿热毒盛型糖尿病慢性创面具有缓解症状、抑制炎症及改善缺血的协同作用[3]。另外，柚皮苷是一种从各种葡萄和柑橘类水果中提取的黄酮苷，确定柚皮苷在40和80 mg/kg剂量下治疗糖尿病慢性创面的效果显著（P < 0.05）。此外，柚皮素可导致VEGF-c、TGF-b、IGF-1等生长因子mRNA表达上调，以及TNF-α、IL-1β、IL-6[4]等炎症介质mrna表达下调。糖尿病大鼠经万红软膏治疗后似乎减轻了最初遭受神经损伤的慢性创面的严重程度。治疗后，糖尿病慢性创面大鼠创口几乎完全愈合。此外，这种作用似乎是通过PDGF mRNA表达的增加介导的。此类研究体现了中西医结合在调节免疫微环境与促进组织修复中的独特价值。

②　生物活性敷料的创新开发：生物活性敷料的研发聚焦于构建多功能平台，以物理屏障保护、渗出液管理及抗菌促愈合为核心目标。Wang等开发的季铵化壳聚糖/镁复合敷料兼具抗菌与促血管生成功能[5]，可有效清除MRSA等耐药菌，并通过促进真皮纤维细胞和内皮细胞迁移加速创面修复。另外，智能创面敷料控制抗菌纳米颗粒释放无线基质金属蛋白酶-9传感用于慢性创面管理，基于生物活性肽序列的生物反应性水凝胶[6]，实现了高灵敏度的射频MMP-9传感器。利用柔性电感-电容（LC）电路和生物反应水凝胶，无线可穿戴智能伤口敷料为现场伤口分析提供了一种有效的策略。此外，纳米胶体银和壳聚糖生物活性伤口敷料在治疗糖尿病慢性创面也有显著优势。几丁质近些年成为一种具有商业吸引力的生物材料，在碱性溶液存在下通过热化学脱乙酰转化为壳聚糖[7]，壳聚糖带正电，因此更容易与带负电的分子（如蛋白质、阴离子多糖和核酸）相互作用，这些分子通常存在于皮肤中。壳聚糖基材料除了具有正电荷（在典型的伤口pH值下）、成膜能力、温和的凝胶特性和极强的伤口组织粘附性能外，还被发现可以增强血液凝固并加速伤口愈合。然而，现有敷料依旧难以满足糖尿病慢性创面不同愈合阶段的动态需求，如何实现精准调控与个性化适配仍是研究难点。

③　PEVs疗法的前沿突破： EVs因其低免疫原性和高生物相容性成为糖尿病慢性创面治疗的新兴方向[8]。研究表明，脂肪源性干细胞外泌体通过激活Nrf2通路显著促进糖尿病小鼠模型血管生成与上皮再生[9]；骨髓间充质干细胞外泌体[10]则借助miR-126-3p靶向调控SPRED1，增强创面愈合效率。来自microRNA -125b修饰的脂肪来源干细胞的外泌体促进糖尿病足溃疡的伤口愈合也有一定效果。程外泌体是指通过静电相互作用、受体-配体结合、疏水插入和基于适配体的表面修饰进行非共价偶联等方法靶向部分连接到外泌体的膜上已产生附着在位点特异性靶向肽上的外泌体，有效地将靶向配体结合到EV表面，达到治疗相关水平。此外，近年来，PEVs[11]（如MEVs）因其跨物种调控潜力受到关注，其携带的多酚类物质及特异性miRNA可靶向氧化应激与纤维化通路，为糖尿病慢性创面治疗提供全新策略。

④　薄荷活性成分的作用机制研究：薄荷在糖尿病慢性创面治疗中的应用价值正逐步得到科学验证[12]。研究表明，薄荷中的活性成分主要通过三重机制发挥作用。首先，以薄荷醇、薄荷酮为代表的成分对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等糖尿病慢性创面常见病原体表现出广谱抑制作用[13]；其次，迷迭香酸能够通过激活Nrf2通路有效减轻氧化损伤[14]，同时miR159a可靶向调控TGF-β/Smad3信号通路，从而抑制病理性纤维化过程；此外，薄荷成分薄荷成分还表现出改善微循环的潜力，其局部血管舒张效应可能有助于缓解缺血微环境，但针对糖尿病血管病变的直接修复作用仍需进一步验证[15]。需要指出的是，当前相关研究主要局限于体外实验和动物模型阶段，要实现临床转化仍需解决制剂稳定性和递送效率等关键技术难题。

参考文献

[1]王猛, 王丛香, 闫会霞, 等. (2024). 复荣通脉胶囊联合中药足浴治疗糖尿病高危足疗效及对血清NGF、IL-1β水平的影响. 辽宁中医药大学学报, 26(05), 179–183.

[2] 张敏芝. (2019). 脉络舒通颗粒外洗对促进糖尿病足慢性溃疡愈合的临床疗效研究. 双足与保健, 28(07), 48–49.

[3] 郝文立, 甘永康, 曹颖, 等. (2024). 四妙勇安颗粒联合常规疗法治疗糖尿病足湿热毒盛证疗效及对踝肱指数的影响. 天津药学, 36(01), 18–21.

[4]刘思佳, 吴堃, 任凯强, 等. (2023). 柚皮素通过抑制NF-κB-iNOS/COX-2通路减轻小鼠糖尿病肝损伤. 中国病理生理杂志, 39(03), 445–450.

[5]赵予榕, 朱丹, 许怡菲, 等. (2024). 季铵化壳聚糖-琼脂水凝胶粒的制备及其缓释性能研究. 应用化工, 53(10), 2293–2296.

[6]H, N. R. K. (2018). Nano-colloidal silver and chitosan bioactive wound dressings in managing diabetic foot ulcers: Case series. Journal of Wound Care, 27(Sup9A), S32–S36.

[7]Younes, I., & Rinaudo, M. (2015). Chitin and chitosan preparation from marine sources: Structure, properties and applications. Marine Drugs, 13(3), 1133–1174.

[8] Guo, L., Xiao, D., Xing, H., et al. (2024). Engineered exosomes as a prospective therapy for diabetic foot ulcers. Burns & Trauma, 12, tkae023.

[9]Guo, E., Wang, L., Wu, J., et al. (2024). Exosomes from MicroRNA-125b-modified adipose-derived stem cells promote wound healing of diabetic foot ulcers. Current Stem Cell Research & Therapy. Advance online publication.

[10] 冯淑琪, 金国荣, 薛群航, 等. (2025). 间充质干细胞影响NADHP氧化酶4抑制氧化应激通路治疗2型糖尿病肾病. 中国生物化学与分子生物学报. 提前在线出版.

[11] 王豪波, 王艳, 兰周哲, 等. (2025). 栀子类外泌体样纳米颗粒对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的保护作用. 食品工业科技. 提前在线出版.

[12] 孙文豪, 杨扬, 陈恒, 等. (2023). 薄荷有效成分药理作用研究进展. 江苏中医药, 55(05), 78–82.

[13] 杨睿, 陈炫好, 李晋, 等. (2022). 薄荷化学成分及药理活性研究进展. 天津中医药大学学报, 41(01), 4–13.

[14] 张彦昕, 柴贝贝, 石玉节, 等. (2025). 迷迭香三种成分提取及其体外抗氧化和抑菌活性研究. 云南化工, 52(01), 63–68.

[15]赵佩伊, 费思佳, 乔修琪, 等. (2025). 微循环检测在糖尿病微血管并发症评估中的新进展. 中国医学前沿杂志(电子版), 17(01), 21–27

创新点与项目特色:

①　精准靶向给药技术革新

局部递送效率优化：突破传统口服给药局限，本项目采用局部皮下注射无需经肝脏代谢，直接作用于糖尿病创面区域，避免药物经肝脏代谢损耗，生物利用度更高且一定程度上降低肝肾损伤风险。此外，糖尿病患者常伴有血管病变，口服药物因血流不畅难以有效到达创面，而局部注射可以直接作用于创面。

多机制协同修复：相较于薄荷水煎剂，本项目采用MEVs保留了薄荷的更多有效成分，靶向作用于血管内皮细胞、巨噬细胞等修复关键细胞。且因囊泡特性，采取MEVs可多机制协同促进愈合，例调节炎症与免疫反应、促进血管生成、抗氧化与抗凋亡等协同进行。

②　全流程伦理合规性保障

本项目严格遵循国际生物医学研究伦理规范。采取的MEVs直接从植物中提取，无需依赖动物或人类干细胞，避免了传统细胞疗法中涉及的胚胎干细胞或动物源性外泌体的伦理争议。MEVs的免疫抗原性显著低于动物或人类来源的EVs，降低了过敏或免疫排斥反应的风险，且无致瘤风险。

③　绿色可持续性设计

相较于动物源性外泌体和胚胎干细胞，薄荷作为广泛种植的作物，其EVs的生产过程更加环保且具有绿色可持续性，有助于降低医疗成本，符合医疗资源公平分配的伦理原则。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

①　技术路线

②　拟解决的问题

当前发现 MEVs 对于治疗糖尿病慢性创面有一定作用，但在糖尿病创面微环境中，高糖诱导的线粒体氧化应激（ROS累积）与慢性炎症（NF-κB通路活化）如何协同抑制成纤维细胞迁移与血管内皮再生，目前缺乏多维度调控靶点证据；以及MEVs在创面复杂微环境（高蛋白酶活性、酸性pH）中能否维持囊泡完整性并靶向递送至真皮层修复细胞，缺乏定量评价体系。本项目旨在阐明 MEVs 治疗糖尿病慢性创面的有效成分和分子作用机制，以期为糖尿病慢性创面的临床治疗提供一种全新的方法和理论依据。

③　预期成果

通过本项目的研究，揭示 MEVs 治疗糖尿病慢性创面的有效成分和分子作用机制，明确MEVs通过miR-21/PTEN轴激活PI3K/Akt通路促进细胞迁移，同时通过Nrf2/HO-1通路清除ROS的双重机制，为利用MEVs对糖尿病慢性创面的临床诊疗提供实验理论依据，以期寻找一种全新的中药注射剂制备工艺和一种有效干预糖尿病慢性创面的临床方法。以及技术优化并且建立MEVs活性保留工艺，期望能够创造性构建仿生创面评估系统。

通过开展本项目，不断激发项目组成员的学习能力、实验技术、求知欲及创新精神等等，提高项目组成员的科学素养和科研兴趣。

研究成果以论文形式发表，发表论文 1-2 篇。

项目研究进度安排:

2025.3-2024.4 查阅文献，撰写综述，做前期准备工作

2025.4-2025.12 糖尿病慢性创面小鼠模型造模，进行 MEVs 局部注射和外敷处理

2026.12-2026.6 进行免疫荧光和冰冻切片实验以及 Western Blot、qPCR 等组织学和免

疫组织化学实验

2026.6-2026.12 整理结果，撰写论文并投稿

2026.12-2027.3 准备结题答辩资料，提交结题报告

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

研究前期项目组成员查阅大量糖尿病慢性创面、细胞外囊泡、生物信息学、中药注射剂等相关资料，具有一定的知识储备。项目前期通过 M-UC 法提取MEVs，并通过电镜观察 MEVs 形态，利用 LC-MS 法分析 MEVs 的主要成分，通过生物信息学预测作用靶点和作用途径。研究院在胞外囊泡相关领域发表文章数篇，具有良好的前期基础，实验室小鼠种类与数量充足且丰富，能做到随取随用随时开展实验。

图1 提取获得的MEVs NTA技术分析不同粒径的样品粒径浓度分布

图2 MEVs在透射电镜下呈现双层囊状盘样结构

图3 糖尿病慢性创面模型小鼠创面愈合过程中创面面积变化的定量分析结果（实验组采用MEVs皮下注射联合创面局部敷药治疗方案，（样本量为200μL/day）；对照组实施等剂量PBS皮下注射联合创面PBS湿敷干预）

图4 糖尿病慢性创面模型小鼠术后第1-5天创面愈合定量对比分析结果

（实验组：1至3组MEVs皮下注射（200 μL/day）联合创面局部敷药治疗（50 μL/day）；对照组：4和5组等量PBS皮下注射及创面PBS湿敷干预）

图5 通过LC-MS得到MEVs的色谱图结果

图6 MEVs成分靶点和糖尿病慢性创面靶点共有262个交集基因

图7 MEVs干预糖尿病慢性创面后差异基因的GO功能富集分析

图8 MEVs干预糖尿病慢性创面的KEGG通路富集分析

图9 MEVs干预糖尿病慢性创面的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络

图10 疾病﹣通路﹣靶点﹣成分﹣药物网络构建

（BH1:红车轴草素;BH2:野黄芩黄素 4 ' -甲醚;BH3:异山柰素;BH4:苯丙氨酸;BH5:7，3 '，4 ' -三羟基黄酮;BH6:硫黄菊素;BH7:高丽槐素;BH8:亮氨酸;BH9:橙皮素;BH10:高圣草酚;BH11:( 2R、3R、4R) - 2，3，4，5 -四羟基戊醛;BH11:木糖;BH12:山奈酚;BH13:1-Deoxypebrolide;BH14:3-羟基吡啶甲酸;BH15:6 -羟基烟酸;BH17:坡模酸;BH18:甲基-p-苯醌;BH19:苯甲酸;BH20:环庚三烯酚酮;BH21:精氨酸;BH22:黄芩苷;BH23:黄姜味草醇;BH24:DL-o-酪氨酸;BH25:野黄芩黄素;BH26:熊果酸;BH27:3-表齐墩果酸;BH28:伞桂酮;BH29:乙醇酸;BH30:尿苷;BH31:决明子苷C;BH32:吲哚-3-羧酸;BH33:2,5-二羟基肉桂酸;BH33:表没食子儿茶素没食子酸酯;BH34:吲哚-3-甲醛;BH35:甘草素;BH36:对香斗酸。）

图11 SDS-PAGE分析MEVs总蛋白(泳道从左到右依次为：分子量标准Maker；MEVs；PBS对照组 )

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

已具备的条件

科研平台与团队：实验依托山东省高等学校“十三五”重点实验室——精准医学院（2015年成立），具备省级科研资质。研究团队由1名山东省“泰山学者”特聘教授领衔，核心成员包括高级职称5人、博士10人，博士占比超50%，形成跨学科技术攻关梯队。

硬件设施与保障：关键仪器：CO₂细胞培养箱、二级生物安全超净工作台、常规/荧光定量PCR仪（ABI 7500）、高速冷冻离心机（Eppendorf）、化学发光凝胶成像系统（Bio-Rad）等，覆盖分子生物学及细胞实验需求。

后勤支持：寒暑假期间提供标准化科研公寓，保障实验连续性。

尚缺少的条件及解决方法

受当前技术可重复性验证框架的阶段性限制，部分结果呈现非预期离散趋势；部分团队成员当前处于实验技术迭代的成长阶段，需进一步深化领域知识体系的系统性建设。为此，我们积极利用课堂时间训练实验动手能力，利用课余时间进行文献查阅并扩展视野，完善知识储备、提高认知素养，结合每周组会案例复盘，提升技术一致性，已备更好地完成此次实验。本实验指导老师在此研究方面经验丰富，知识面广阔，严谨且负责对本实验过程进行专业指导，且联合合作单位共享技术平台，弥补设备缺口。此外，部分试剂和耗材需要购买，经费方面比较紧张，为保证项目顺利进行，我们将积极申报与本选题相关的科研项目，保证研究经费的投入。

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	20000.00	无	10000.00	10000.00
1. 业务费	4000.00	无	2000.00	2000.00
（1）计算、分析、测试费	4000.00	用于囊泡有效成分分析，蛋白组织分析等	2000.00	2000.00
（2）能源动力费	0.00	无	0.00	0.00
（3）会议、差旅费	0.00	无	0.00	0.00
（4）文献检索费	0.00	无	0.00	0.00
（5）论文出版费	0.00	无	0.00	0.00
2. 仪器设备购置费	0.00	无	0.00	0.00
3. 实验装置试制费	0.00	无	0.00	0.00
4. 材料费	16000.00	购买实验动物、饲料、糖尿病造模及Western Blot，抗体等试剂	8000.00	8000.00

结束

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