济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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膳食果糖通过调控B细胞的活化和分化缓解系统性红斑狼疮发病的机制研究

申报人：赵天琪 申报日期：2025-03-27

基本情况

2025创新项目
膳食果糖通过调控B细胞的活化和分化缓解系统性红斑狼疮发病的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生自主选题
二年期
系统性红斑狼疮（SLE）是一种以B细胞异常活化和自身抗体大量产生为特征的慢性自身免疫性疾病。我国SLE患者数量超过98.6万，发病率位居世界前列。目前临床治疗仍以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，但长期使用会导致严重副作用，亟需开发更安全有效的治疗策略。 近年研究发现，B细胞异常分化为浆细胞并产生致病性自身抗体是SLE发病的核心环节。因此，深入探索调控B细胞活化的新机制具有重要临床意义。果糖作为日常饮食中的重要单糖成分，其代谢途径具有显著独特性。与葡萄糖不同，果糖通过果糖激酶（KHK）催化生成1-磷酸果糖（F1P），直接进入糖酵解下游反应，绕过关键限速酶PFK-1的调控。 本研究采用MRL/lpr自发狼疮小鼠模型，通过高果糖饲料干预，系统评估果糖对SLE病程的影响。同时结合流式细胞术、qPCR等分子生物学技术，深入解析果糖调控B细胞活化、分化及其相关信号通路的分子机制。研究结果不仅有望揭示"膳食果糖-B细胞代谢-SLE发病"这一全新调控轴，为SLE治疗提供潜在新靶点，还将为临床制定科学合理的患者饮食管理方案提供重要理论依据。
无
本项目指导老师为“泰山学者”青年专家、山东省高等学校青创计划创新团队带头人，主持国家自然科学基金面上项目和青年项目、山东省自然科学基金项目及济宁医学院高层次培育等多个项目。
本项目指导老师主要从事炎症微环境的免疫学调控机制研究，主持的国家自然科学基金等项目均涉及炎症中免疫细胞异常活化和分化的调控研究。指导老师所在的免疫学泰山学者实验室已建立了完善的实验体系，并且研究经费充足，能够很好的为本项目的顺利开展提供坚实的保障。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
赵天琪 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 总体协调，细胞培养、诱导，数据分析
上官修贤 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 动物饲养、模型构建动物模型数据记录及分析
赵紫瑜 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 B细胞分化机制研究细胞诱导等相关实验
王义鹏 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 动物模型相关病理指标检测

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
董冠军 基础医学院 否

立项依据

研究目的

1. 明确膳食果糖对狼疮模型小鼠发病的影响。
2. 探究果糖对B细胞活化和分化的调控作用及其分子机制。
3. 本研究将为人们理解和探索SLE发病机制中糖代谢研究提供思路，并为SLE的临床治疗和病人饮食康养提供科学建议。
研究内容
本项目旨在探讨膳食果糖通过调控B细胞活化和分化缓解狼疮小鼠发病的机制研究，从而为果糖在SLE的临床应用提供前期的理论依据。
实验1：明确果糖对SLE模型小鼠发病的影响

1.1MRL/lpr自发狼疮小鼠及给药方法
MRL/lpr自发狼疮小鼠随机分为2组，（5周龄，每组各6只）：Control组使用普通育成饲料，高果糖组使用60％果糖饲料，具体实验见附件流程图；


1.2 检测果糖对MRL/lpr狼疮小鼠发病的影响
实验期间保持两组小鼠饲养条件等无关变量保持一致,第八周处死小鼠取脾脏和肠系膜淋巴结进行后续实验。具体检测指标如下：
①取小鼠外周血，采用酶联免疫吸附试验检测血清中anti-dsDNA的含量；
②取得脾脏及淋巴结后称重，观察其大小变化；
③研磨脾脏及淋巴结并制备单细胞悬液，收集细胞并标记荧光抗体，利用流式细胞术检测B细胞活化水平（CD40、CD86、CD69表达）、生发中心B细胞比例（B220+GL7+）及浆细胞的比例（B220-/dimCD138+）；
④对切片进行H&E染色，观察其病理变化。

实验2：在细胞水平探究果糖对B细胞炎症水平的作用以及相应机制

2.1 小鼠脾脏B细胞的分选及培养
将小鼠断颈处死，酒精浸泡消毒后，转移至生物安全柜中，取小鼠脾脏研磨，以200目筛网过滤收集至离心管，取得细胞悬液，将过滤后的B细胞离心，4℃，1700 rpm，7min；弃上清，用1mL红细胞裂解液处理细胞静置5min；加入适量PBS再次清洗细胞，再次离心，弃上清；使用B细胞阴选试剂盒进行筛选，在用300微升PBS吹打后加入100微升抗体混匀，孵育半小时，每十分钟轻弹一次。加入少许PBS离心，使用300微升无糖1640培养基（含10％gibco胎牛血清）吹打，加入100微升磁珠混匀，孵育半小时，每十分钟轻弹一次。孵育后加入3毫升无糖培养基混匀，使用无菌流式管和磁铁进行B细胞阴选。分选完成后使用无糖1640培养基铺板至96孔板中。

2.2 果糖对TLR通路介导的B细胞活化的影响
B细胞分选铺板后经过药物预处理，使用工作浓度的TLR4配体LPS（细菌脂多糖），TLR7配体R848（Resiquimod），TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）刺激，通过流式细胞术检测CD86/CD40表达，Q-PCR检测M1型巨噬细胞极化标志分子Western blot分析p38、Erk、JNK和p65蛋白磷酸化水平，具体如下。
①标记CD86和CD40，B220荧光抗体，进行流式细胞术检测B细胞炎症标志分子CD86和CD40的表达水平。
②提取各组细胞总RNA，Q-PCR检测M1型巨噬细胞极化标志分子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-12在mRNA水平表达；
③提取B细胞总蛋白，通过Western Blot实验检测p38、Erk、JNK和p65蛋白磷酸化水平。

实验3：诱导动物模型验证果糖对B细胞分化活化及SLE发病的影响

3.1构建咪喹莫特(IMQ)诱导的SLE小鼠模型
①利用C57小鼠构建咪喹莫特诱导的狼疮模型：
C57小鼠随机分为4组，（8周龄，每组各6只），其中两组实验组均通过使用咪喹莫特促小鼠发病，实验组组一喂食60％高果糖饲料，组二喂食普通育成饲料；对照组组一使用60％高果糖饲料，组二使用普通育成饲料，对照组均不使用咪喹莫特。
②实验组每周三次耳部涂抹定量咪喹莫特，诱导持续进行八周。四组小鼠均保持无关变量统一，食物饮水充足，饲喂环境适宜。

3.2 果糖对咪喹莫特（IMQ）诱导小鼠SLE发病作用评估
①观察脾脏和淋巴结肿胀程度并称重，拍照记录。
②用流式细胞术检测小鼠脾脏及淋巴结中B细胞活化水平（CD40、CD86、CD69表达）、生发中心B细胞比例（B220+GL7+）及浆细胞的比例（B220-/dimCD138+）；
③取外周血，离心后保留血清，采用酶联免疫吸附试验检测血清中anti-dsDNA的含量
④固定组织，切片后H&E 染色观察。
⑤利用免疫荧光技术检测肾小球中IgG和IgM的沉积情况。
国、内外研究现状和发展动态
  系统性红斑狼疮（SLE）是一种多系统的慢性自身免疫性疾病，具有复发性和恢复性。在生育年龄的女性中，其患病率更高，女性占主导地位9：1 。这种疾病的确切病因不太了解。然而，已经证明，环境和遗传因素相互作用以触发免疫反应，导致B细胞和细胞因子失调导致组织和器官损伤过度产生致病性自身抗体。SLE的典型病理特征为患者体内产生针对核抗原（如dsDNA）及细胞质抗原的自身抗体，引发免疫复合物沉积及多器官损伤。[[1]]全身性红斑狼疮（SLE）会影响多个器官系统，最近有越来越多的证据表明癌症风险大幅增加,特别是与多发性骨髓瘤（MM）之间的关系[[ 2]]愈发受到重视。SLE常规治疗方案主要包括糖皮质激素和免疫抑制剂等，虽然在一定程度上能够控制患者病情，但存在感染、骨质疏松等副作用[[3]]，长期用药对患者的生存质量造成较大影响。因此，迫切需要对SLE的发病以及物质代谢机制的进一步阐明，提高患者的生存质量。
尽管多种免疫细胞，包括T细胞、树突状细胞及巨噬细胞等，均在SLE发病中发挥重要作用，但是B细胞作为抗体分泌细胞，一直以来被公认为SLE发生发展的核心所在[[4]]。SLE患者体内B细胞异常活化并分化为浆细胞，进而产生大量自身抗体[[6]]，从而加剧SLE的全身症状。据进一步研究表明，调节SLE发病的机制与致病性B细胞对TLR7通路介导的反应相关[[5]]，其中TLR7信号传导组件Stat1，Bank1，IRF5，SLC15A4和CXORF21/TASL与SLE有遗传相关，对小鼠的狼疮发展起重要作用。基于异常B细胞在系统性红斑狼疮（SLE）病理进程中的核心作用，当前临床实践中已开发出靶向B细胞的精准治疗策略。例如，通过抗CD20单克隆抗体（如利妥昔单抗）介导的CD19+B细胞耗竭疗法，以及靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法，均通过特异性清除或调控致病性B细胞亚群，展现出显著的疾病缓解潜力。[[7]]
果糖Fructose（C6H12O6），是一种单糖，是葡萄糖的同分异构体，它以游离状态大量存在于水果的浆汁和蜂蜜中，在人们日常生活饮食，烹饪中常常食用。在近年来因其在免疫、肿瘤、代谢方面的特殊作用而被重视。最新研究表明，果糖可以通过白色脂肪介导的方式以MTORC1依赖性方式启动脂肪细胞衍生瘦素，从而触发瘦素促进的抗肿瘤CD8+T细胞反应，对多种癌症的发展起到调控作用，控制肿瘤生长[[8]]；在巨噬细胞分子代谢方面，果糖可以作为信号分子，抑制M1样巨噬细胞极化，进行独立的果糖介导代谢[[9 ]]。果糖已知对肝脏有毒性作用，包括增加脂肪酸的产生，氧化应激增加和胰岛素抵抗。这些作用与非酒精性脂肪肝（NAFLD）疾病和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的进展有关[[10], [11]]。果糖代谢的衍生物最后，果糖1-磷酸盐（F1-P）是促进肠细胞存活以及增强肠道吸收能力的信号分子[[12]] 。干预和流行病学研究表明，源自日常膳食的果糖刺激了人类的从头脂肪生成和肝内脂质积累，在人体代谢方面发挥重要作用。果糖可通过重编程免疫细胞代谢途径（如增强糖酵解、抑制氧化磷酸化），改变氨基酸代谢及脂质合成，进而调控炎症反应和免疫细胞功能。在部分参考文献中提及，MTORC1活性的果糖依赖性增加促进了促炎细胞因子的翻译，增强对LPS的响应，从而使饮食果糖在LPS刺激的单核吞噬细胞中构成了促炎作用[[13]]，但果糖对于SLE发病机制及调控作用的研究尚不明确，研究资料比较单薄。本研究拟研究果糖对SLE模型小鼠病情的影响，探索果糖通过调控B细胞活化分化影响SLE模型小鼠病情的作用机制。本研究将为开发新型SLE治疗药物及SLE患者的日常饮食、食疗康养提供新思路和科学建议。

参考文献
1.Ameer M, Chaudhry H, Mushtaq J, et al. (October 15, 2022) An Overview of Systemic Lupusrythematosus (SLE) Pathogenesis, Classification, and Management. Cureus 14(10): e30330. doi:10.7759/cureus.30330
2.Desai R, Devaragudi S, Kaur L, Singh K, Bawa J, Theik NWY, Palisetti S, Jain A. SLE and multiple myeloma: an underlooked link? A review of case reports from the last decade. J Med Life. 2024 Feb;17(2):141-146. doi: 10.25122/jml-2023-0314. PMID: 38813361; PMCID: PMC11131644.
3.Golder V, Tsang-A-Sjoe MWP. Treatment targets in SLE: remission and low disease activity state. Rheumatology (Oxford). 2020;59(Suppl5):v19-v28.
4.Arbitman L, Furie R, Vashistha H. B cell-targeted therapies in systemic lupus erythematosus. J Autoimmun. 2022;132:102873. 
5.Fillatreau S, Manfroi B, Dörner T. Toll-like receptor signalling in B cells during systemic lupus erythematosus. Nat Rev Rheumatol. 2021;17(2):98-108.
6.Satterthwaite AB. TLR7 Signaling in Lupus B Cells: New Insights into Synergizing Factors and Downstream Signals. Curr Rheumatol Rep. 2021 Nov 24;23(11):80. doi: 10.1007/s11926-021-01047-1. PMID: 34817709; PMCID: PMC8693951.
7.Zhang Y, Yu X, Bao R, Huang H, Gu C, Lv Q, Han Q, Du X, Zhao XY, Ye Y, Zhao R, Sun J, Zou Q. Dietary fructose-mediated adipocyte metabolism drives antitumor CD8+ T cell responses. Cell Metab. 2023 Dec 5;35(12):2107-2118.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2023.09.011. Epub 2023 Oct 19. PMID: 37863051.
8.Dewdney B, Roberts A, Qiao L, George J, Hebbard L. A Sweet Connection? Fructose's Role in Hepatocellular Carcinoma. Biomolecules. 2020 Mar 25;10(4):496. doi: 10.3390/biom10040496. PMID: 32218179; PMCID: PMC7226025.
9.Yan H, Wang Z, Teng D, Chen X, Zhu Z, Chen H, Wang W, Wei Z, Wu Z, Chai Q, Zhang F, Wang Y, Shu K, Li S, Shi G, Zhu M, Piao HL, Shen X, Bu P. Hexokinase 2 senses fructose in tumor-associated macrophages to promote colorectal cancer growth. Cell Metab. 2024 Nov 5;36(11):2449-2467.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2024.10.002. Epub 2024 Oct 28. PMID: 39471815.
10.Lubawy M, Formanowicz D. High-Fructose Diet-Induced Hyperuricemia Accompanying Metabolic Syndrome-Mechanisms and Dietary Therapy Proposals. Int J Environ Res Public Health. 2023 Feb 17;20(4):3596. doi: 10.3390/ijerph20043596. PMID: 36834291; PMCID: PMC9960726.
11.Koene E, Schrauwen-Hinderling VB, Schrauwen P, Brouwers MCGJ. Novel insights in intestinal and hepatic fructose metabolism: from mice to men. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2022 Sep 1;25(5):354-359. doi: 10.1097/MCO.0000000000000853. Epub 2022 Jul 16. PMID: 35838297.
12.Jones N, Blagih J, Zani F, Rees A, Hill DG, Jenkins BJ, Bull CJ, Moreira D, Bantan AIM, Cronin JG, Avancini D, Jones GW, Finlay DK, Vousden KH, Vincent EE, Thornton CA. Fructose reprogrammes glutamine-dependent oxidative metabolism to support LPS-induced inflammation. Nat Commun. 2021 Feb 22;12(1):1209. doi: 10.1038/s41467-021-21461-4. PMID: 33619282; PMCID: PMC7900179.
13.Kansal R, Richardson N, Neeli I, Khawaja S, Chamberlain D, Ghani M, Ghani QU, Balazs L, Beranova-Giorgianni S, Giorgianni F, Kochenderfer JN, Marion T, Albritton LM, Radic M. Sustained B cell depletion by CD19-targeted CAR T cells is a highly effective treatment for murine lupus. Sci Transl Med. 2019 Mar 6;11(482):eaav1648. doi: 10.1126/scitranslmed.aav1648. PMID: 30842314; PMCID: PMC8201923.
创新点与项目特色

1．果糖虽在肿瘤、非酒精性肝炎等方面研究成果较多，但在SLE领域的研究尚未见报道，本研究首次揭示膳食果糖通过调控B细胞活化和分化影响SLE病理进程的分子机制，为SLE的代谢-免疫交互研究提供新视角。
2．SLE治疗具有长期性和反复性，病人的饮食习惯对病程的影响不容小觑，而果糖作为膳食糖类广泛的存在于各类食品中，本课题不仅能为新药物的开发提供思路，也能为SLE患者的饮食康养提出科学建议。

技术路线

实验1： MRL/lpr自发狼疮小鼠及给药方法
技术路线1
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实验2：在细胞水平探究果糖对B细胞炎症水平的作用以及相应机制
技术路线2
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实验3：诱导动物模型验证果糖对B细胞分化活化及SLE发病的影响
技术路线3
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2、拟解决的问题
（1）证明果糖可显著缓解SLE小鼠病情。
（2）果糖有望成为SLE治疗药物研发的新策略。
（3）明确SLE患者饮食营养方面对果糖的摄取建议。

3、预期成果
（1）果糖可显著缓解SLE造模小鼠病情。
（2）果糖可通过调控B细胞活化分化缓解MRL/lpr小鼠自发SLE或咪喹莫特诱导的小鼠SLE。
（3）发表SCI论文1篇。

项目研究进度安排

（1）2024年8月-2024年12月
研究果糖对SLE模型小鼠病情的影响；明确果糖通过B细胞调控MRL/lpr自发狼疮模型小鼠病情。
（2）2025年1月-2025年12月
在细胞水平研究果糖对B细胞活化分化的调控作用，并探索其具体的分子机制。
（3）2026年1月-2027年8月
认真总结分析实验结果，撰写并发表论文。
已有基础


1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

1.1 本项目相关的研究工作积累

1.1.1磁珠分选野生型小鼠脾脏B细胞，使用果糖与葡萄糖进行预处理，完成TLR刺激后收集细胞标记抗体，利用流式细胞术检测CD40、CD86和CD69的表达。
                                                                          summernote-img
                                                                                         
                                                                                            图一：果糖降低TLR介导的B细胞炎症水平

使用葡萄糖（20mM）或果糖（20mM）对B细胞进行药物预处理，使用工作浓度的TLR4配体LPS(A)，TLR7配体R848(B)，TLR9配体CpG-1826(C)刺激，通过流式细胞术检测CD40/CD86/CD69表达。* p<0.05,** p<0.0l，**** p<0.0001，由双尾t检验确定。

1.1.2 获取两组（果糖组、普通饲料组）12周龄MRL/lpr小鼠（各6只），造模结束取脾脏，肠系膜淋巴结，制备细胞悬液后利用流式细胞术检测B细胞活化和分化水平。
                                                                          summernote-img
                                                                                          图二 果糖对MRL/lpr小鼠自发狼疮的抑制作用

选12周龄MRL/lpr自发狼疮小鼠(n=6)，使用果糖饲料或普通饲料喂养造模8周后进行检测：(A)脾脏肿胀程度;（B）脾脏重量；（C）淋巴结生发中心B细胞比例；（D）淋巴结浆细胞比例；（E）淋巴结B细胞活化；*p<0.05, ****p<0.0001，由双尾t检验确定。
基于上述研究基础，本团队方法熟练、技术完善、仪器齐全，有充足的技术实力和研究条件保证课题的顺利实施。

1.2 已取得的成绩（以下为指导老师第一或通讯作者论文）
Zhou G, Zhu F, Zhang H, Wang Y, Yang Y, Jin G, Wang Y, Dong G, Xiong H. PTK2B regulates immune responses of neutrophils and protects mucosal inflammation in ulcerative colitis. FASEB J. 2023;37(7):e22967.
Dong G, Yang Y, Zhang H, Yu W, He H, Dai F, Ma C, Wang Y, Zhu F, Xiong H, Zhou G. Protein Kinase CK2 Maintains Reciprocal Balance Between Th17 and Treg Cells in the Pathogenesis of UC. Inflamm Bowel Dis. 2022;28(6):830-842.
Yang Y, Zhang X, Jing L, Xiao Y, Gao Y, Hu Y, Jia S, Zhou G, Xiong H, Dong G. MDSC-derived S100A8/9 contributes to lupus pathogenesis by promoting TLR7-mediated activation of macrophages and dendritic cells. Cell Mol Life Sci. 2024;81(1):110.
Dong G, Yang Y, Li X, Yao X, Zhu Y, Zhang H, Wang H, Ma Q, Zhang J, Shi H, Ning Z, Yan F, Zhai W, Dai J, Li Z, Li C, Ming J, Xue Q, Meng X, Si C, Xiong H. Granulocytic myeloid-derived suppressor cells contribute to IFN-I signaling activation of B cells and disease progression through the lncRNA NEAT1-BAFF axis in systemic lupus erythematosus. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020;1866(1):165554.

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法

本项目依托济宁医学院基础医学研究中心和免疫学与分子医学研究所开展，具有很好的实验平台，目前已建立狼疮小鼠模型构建、各种免疫细胞分离和培养、流式分析和分选技术及相关免疫学检测方法等实验技术，主要的仪器设备包括：激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、活细胞自动化显微成像监控平台、蛋白质和核酸电泳系统以及 SPF 级动物实验室。可以开展各种免疫学检测及小鼠狼疮模型实验，能够保证本研究顺利进行。目前尚无缺少的条件。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 10000.00 无 5000.00 5000.00
1. 业务费 4000.00 无 1000.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 狼疮小鼠肾脏和脾脏组织切片 1000.00 1000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 2000.00 发表SCI论文或中文核心期刊 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 6000.00 无 4000.00 2000.00
结束

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