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β-羟基丁酸通过AMPK抑制衰老相关分泌表型延缓MASH向HCC进展的机制研究

申报人：孙依 申报日期：2025-03-27

基本情况

2025创新项目
β-羟基丁酸通过AMPK抑制衰老相关分泌表型延缓MASH向HCC进展的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）可直接向肝细胞癌（HCC）转化，但机制不明，亦缺乏相应干预手段。β-羟基丁酸（BHB）近来被证明与机体炎症、肿瘤发生密切相关，然而其在MASH向HCC进展中的作用尚不明确。课题组预实验结果显示，MASH小鼠肝组织中BHB合成减少，外源性补充BHB可显著抑制MASH向HCC进展，体外BHB干预显著减轻肝细胞炎症损伤，并抑制HCC细胞的恶性表型，提示BHB可能具有抑制MASH向HCC演进的能力。课题组进一步研究发现，BHB干预可显著抑制肝细胞衰老及衰老相关分泌表型（SASP）的分泌。SASP已被证实在MASH进展中起关键作用。近期研究显示，AMPK激活可有效抑制细胞衰老，并通过下调NF-κB核转位抑制SASP分泌。基于此，我们提出：“BHB可能通过激活AMPK途径抑制SASP的释放，从而延缓MASH向HCC的进展”。本课题拟进一步通过临床样本、细胞学、活体动物模型等研究，探索BHB在MASH向HCC演进过程中的调控作用及机制。研究结果不仅拓展了人们对MASH~HCC发生机制的认识，并为MASH相关HCC的防治提供一个新的方向。
目前已跟随指导老师团队开展相关实验一年余，参与“钙调磷酸酶β-羟基丁酰化修饰调控衰老分泌表型抑制MASH向HCC演进的机制研究”的课题研究。在学习与探索中，逐渐培养了良好的科研思维，并熟练掌握了包括RT-qPCR、Western blot、免疫组化、细胞培养、细胞功能学实验及慢病毒转染等多项实验技术。
（1）主持山东省自然科学基金项目“钙调磷酸酶β-羟基丁酰化修饰调控衰老分泌表型抑制MASH向HCC演进的机制研究”（ZR2024QH076）1项。
（2）主持并结题山东省医药卫生科技发展计划项目“长链非编码 RNA NR_136400 调控原发性肝癌肺转移的机制研究”（2019WS366）1项。
（3）主持济宁市重点研发计划“β-羟基丁酸预防MASH相关肝癌发生的作用及机制研究”（2024YXNS108）1项。
（4）主持并结题济宁医学院教师科研扶持基金“细胞衰老在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用及相关机制探讨”（JYFC2018FKJ147）1项。 
1.学术指导与资源保障
定期指导：课题组采取例会制（每周六下午），围绕课题设计、实验操作及数据分析等环节展开深度指导。
经费管理：将提供部分经费支持，并协助合理规划经费使用。
学术交流：依托科研课题，推荐参加学术会议，为学生搭建学术交流平台。
2.过程管理与能力培养
分阶段目标：制定研究计划表（开题、中期、结题），明确阶段性任务。
技能培训：针对实验技术、绘图、统计等开展专题培训。
3.成果转化支持
论文与专利：指导学生撰写论文并推荐投稿，协助申请专利。
竞赛与展示：指导参加创新创业赛事，支持成果转化。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
孙依 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 统筹项目规划、设计并开展实验、数据分析及撰写报告
姜小焱 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 动物学及分子生物学实验的实施。
孙慧娴 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 临床样本收集、细胞学及分子生物学实验的实施。

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张晶 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

本研究以代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis, MASH）向肝细胞癌（hepatocellular Carcinoma, HCC）的恶性转化为研究主线，重点解析β-羟基丁酸（β-hydroxybutyric acid, BHB）通过调控AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）信号通路抑制肝细胞衰老及衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）的分子机制。具体目标如下：
1.1探明外源性BHB抑制MASH向HCC进展的功能。
1.2阐明BHB通过调控AMPK抑制SASP延缓MASH向HCC演进的分子机制。
1.3探讨BHB及AMPK-SASP信号轴在临床靶向治疗MASH及相关HCC的潜在可能，为临床药物开发提供新的理论与实践依据。
2.1明确BHB抑制MASH向HCC演进的功能
 2.1.1临床样本证实BHB参与MASH向HCC演进的过程
 （1）MASH及MASH相关HCC临床样本收集
课题组通过济宁医学院附属医院医学科学研究伦理委员会批准，按照严格的纳入和排除标准，采用回顾性与前瞻性相结合的队列设计，分别收集2017.07-2026.12于我院行HCC切除术治疗的MASH相关HCC患者的肝癌、癌旁组织样本以及于我院行肝穿刺术的MASH患者肝组织样本。
（2）临床资料收集
收集患者以下临床病理学参数：年龄、性别、AFP 、NAS评分、肝硬化、Child-Pugh 分级、肿块大小/数目、肿瘤细胞分化、坏死、血管侵犯、TNM 分级、BCLC 分级等，并统计患者的总生存时间（overall survival, OS）和疾病进展时间（Time to Progression, TTP）。
（3）分析 BHB水平与临床病理特征的相关性
采用ELISA技术检测MASH相关HCC患者肝癌、癌旁组织及MASH患者肝组织中BHB水平，以多元线性回归法分析BHB水平与患者临床病理特征的相关性，以 Kaplan-Meier分析BHB水平与患者OS、TTP的关系。
 2.1.2 体外明确BHB对肝细胞炎症损伤的抑制作用
 （1）基于肝原代细胞评价BHB对肝细胞炎症损伤的影响
采用胶原酶IV灌注技术从雄性C57BL/6小鼠（8周龄）肝组织中提取原代肝细胞，通过FFA混合物（油酸OA：棕榈酸PA 2:1，0.5 mmol/L，24小时）干预，体外建立肝细胞脂毒性炎症损伤模型；实验分BHB（10 mmol/L，24小时）处理组及对照组，RT-qRCP、ELISA技术检测各组NF-κB、TNF-α等炎症因子的表达，评价BHB对肝细胞炎症损伤的影响。
（2）基于L02细胞系评价BHB对肝细胞炎症损伤的影响
以体外培养的人L02肝细胞系为研究对象，FFA混合物（0.5 mmol/L，24小时）干预建立肝细胞脂毒性炎症损伤模型；实验分BHB（10 mmol/L，24小时）处理组及对照组，比较各组炎症因子的表达，评价BHB对肝细胞炎症损伤的影响。
 2.1.3动物实验证实外源性BHB抑制MASH向HCC演进的作用
   实验动物及分组：C57BL/6雄性小鼠出生后2天皮下注射100ug 链脲佐菌素（STZ），4至20周喂食高脂肪饮食（HFD）构建模拟MASH向HCC演进的模型；实验设置对照组、模型组（HFD+STZ）、实验组（HFD+STZ + BHB干预），实验组从第8周始给予80mg/kg BHB隔日灌胃，余组生理盐水隔日灌胃；小鼠分别于12、16、20周末处死；并对比不同组间小鼠肝脏炎症、纤维化及MASH相关肝癌发生率、肿瘤大小、数目等情况。
2.2 阐明BHB抑制MASH向HCC演进的分子机制
 2.2.1 细胞学实验证实BHB通过AMPK通路抑制SASP分泌的机制
（1）证实BHB对AMPK活性的影响：以小鼠肝原代细胞及人L02肝细胞为研究对象，FFA混合物（0.5 mmol/L，24小时）干预建立肝细胞脂毒性炎症损伤模型；BHB（10 mmol/L，24小时）干预，实验分对照组、FFA干预组、FFA+BHB干预组、BHB干预组，通过Western blot及免疫荧光技术检测各组AMPK磷酸化（p-AMPK）及总AMPK水平的变化，观察BHB干预对AMPK活性的影响。
（2）证实AMPK对肝细胞SASP的调控：采用FFA混合物干预建立小鼠肝原代及人L02肝细胞炎症损伤模型，通过RT-qPCR和ELISA技术检测SASP因子的表达。在此基础上，采用定点诱变技术构建AMPKα亚基Thr172位点磷酸化模拟AMPK激活，及采用RAN干扰（shRNA）技术敲低AMPK，观察激活AMPK及敲低AMPK后SASP因子的变化，明确AMPK对SASP的影响。
（3）证实BHB通过AMPK对SASP的调控：在FFA混合物诱导的小鼠肝原代细胞及人L02肝细胞炎症损伤模型的基础上，采用 BHB（10 mmol/L，24小时）干预，通过Western blot、RT-qPCR及ELISA等技术检测p-AMPK/总AMPK比值和SASP的表达，证实BHB对AMPK活性及SASP的影响；进一步采用shRNA技术敲低AMPK进行阻断实验，观察BHB对SASP的影响是否被逆转，证实BHB通过AMPK调控SASP的表达。
 2.2.2动物实验证实BHB通过AMPK抑制SASP延缓MASH向HCC演进的机制
   经医学伦理委员会批准，构建AMPK敲除小鼠，采用STZ联合HFD的方法构建MASH~HCC序贯小鼠模型（出生后2天单次皮下注射100ug STZ，第4周始喂食HFD），同时给予80mg/kg BHB隔日灌胃；检测AMPK敲除对MASH相关HCC发生率、肿瘤大小、数目的影响，并比较不同组别AMPK及细胞衰老、SASP相关指标的表达情况。
 2.2.3临床样本验证BHB抑制MASH相关HCC发生的机制
   采用免疫组化、Western blot、RT-qPCR、ELISA等技术，检测MASH相关HCC患者肝癌、癌旁组织及MASH患者肝组织中BHB、AMPK、p-AMPK、细胞衰老及SASP指标的表达，验证体外细胞学及动物实验的结果；并采用Logistic回归、多元线性回归分析其与临床病理特征的相关性，并通过Kaplan-Meier法分析与患者OS、TTP的关系。 
3.1 研究意义
   据统计，中国每年的肝癌新发病例约占世界水平的一半，已成为危害我国人民健康的重 要疾病之一[1]。随着代谢性疾病发病率的不断攀升，MASH 逐渐成为 HCC 的主要致病因素， 预计至 2030 年，中国 MASH 患者约 5000 万人，由此演进的 HCC 患病率约增加 86%，届 时，中国将成为 HCC 发病率最高的国家[2]。虽然手术切除和移植用于 HCC 早期治疗，但由 于其起病隐匿，侵袭性强，70%~80%的患者在初诊时已处于中晚期；而 HCC 手术切除后， 患者 5 年复发转移率仍高达 50%~70%[3]。因此，将重点锁定在 HCC 发病前的潜伏阶段，扣 紧 MASH 向 HCC 演变的关键节点，探寻有效的预防策略是改善患者预后、提升患者生存质量的重中之重。
3.2 β-羟基丁酸可能是抑制MASH~HCC转化的关键因素
   脂质代谢紊乱是 MASH 的重要特征，同时是驱动疾病发生发展的重要因素。在 MASH 病理条件下，肝脏脂质代谢紊乱引发肝细胞氧化损伤、坏死性炎症等，最终导致 HCC 的发 生。酮体生成障碍作为脂质代谢紊乱的重要环节，被证明与 MASH 的发生发展密切相关[4- 6]。多项研究显示，生酮饮食可通过改善脂肪代谢、减轻炎症和氧化应激等途径，有效减缓 MASH 的进展，并被证实在多种肿瘤的发生中起抑制作用[7-9]。BHB 是酮体的主要成分，除 供能外，也是机体重要的信号传导分子和表观遗传调控分子[10]。研究表明，MASH 病理条件 下，BHB 合成减少，并与疾病不良预后密切相关[4-6]；外源性补充 BHB 能减轻 MASH 小鼠肝 脏中氧化应激导致的损伤[11,12]。申请人课题组前期预实验也证明，外源性补充 BHB 可显著抑 制 MASH 小鼠 HCC 的发生，体外 BHB 干预显著减轻肝细胞炎症损伤并抑制 HCC 细胞的恶 性表型（见研究基础 1, 3, 6）。结合以上信息，申请人推测 BHB 可能是阻断 MASH 向 HCC 进展的重要因素，然而其发挥作用的分子机制尚不清楚。 
3.3 BHB可能通过抑制衰老相关分泌表型抑制MASH向HCC演进
   细胞衰老是代谢综合征发生发展的最关键的危险因素之一。衰老细胞的积累可以通过衰 老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)以旁分泌方式驱动肿瘤发生 [13,14]。SASP 已被证实直接参与了肥胖相关 HCC 炎症微环境的形成，并在 HCC 的发生中起 着至关重要的作用[15-18]。Yoshimoto S 等[15]证明衰老的肝星状细胞分泌 SASP 通过诱发慢性炎 症促进肥胖相关 HCC 的发生；Yamagishi R 等[16]发现衰老的肝星状细胞分泌 IL-33 并通过激 活肝肿瘤微环境中的 st2 阳性 Treg 细胞促进 HCC 的发展；Huang Y 等[17]证实衰老肝细胞中分 泌 SASP 通过诱导 Bcl3 依赖性巨噬细胞激活促进 HCC 的发生。课题组前期数据也显示，细 胞衰老及 SASP 在 MASH 中表达升高，并与疾病进展不良预后显著相关（见研究基础 2 和 7）。细胞衰老及 SASP 极可能是导致 MASH 向 HCC 进展的重要驱动因素。BHB 作为一种 具有生物活性的脂质代谢中间产物，在抗氧化、抗炎、抗衰老的保护作用已初步得到证实 [10]，申请人前期实验进一步证实，BHB 干预显著抑制肝细胞衰老及 SASP 的分泌（见研究基础2,4）。结合以上信息，申请人推测 BHB 可能通过抑制细胞衰老及 SASP 参与 MASH 向 HCC 演进过程的调控，具体机制仍需进一步探索。

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                                      图一 SASP 通过促炎、脂肪变和纤维化形成 MASH 炎症微环境[18]。

3.4 BHB可能通过靶向AMPK通路抑制肝细胞的衰老及SASP分泌
    AMPK 是细胞能量稳态的核心调控因子，主要由α（催化）、β和γ（调节）亚基组成，其 活性受 AMP/ATP 比值、氧化应激以及激素信号的调控。近年来的研究表明，AMPK 在细胞 衰老及 SASP 的调控中可能发挥重要作用。Lu S 团队[19]研究发现，AMPK 通过抑制 p53 过度 磷酸化，延缓了 DNA 损伤诱导的衰老进程。Carapeto P 等[20]进一步证实，AMPK 的激活可促 进 NRF2 的核转位，从而下调胰腺细胞中衰老标志物 SA-β-gal、p53 及 p21 等的表达。Yang L 等[21]研究揭示，CaMKKβ/AMPK/SirT3 信号轴通过增强线粒体的抗氧化能力，减轻了急性 肾损伤中的细胞衰老。此外，Van VT 等[22]人的研究表明，AMPK 通过抑制mTOR-NF-κB 信 号轴，阻断 IL-6、IL-8 等 SASP 因子的分泌；而 NF-κB 是一种在炎症、基因毒性和氧化应激 反应等多过程中被激活的转录因子，激活的 NF-κB 已被证实在衰老细胞的染色质部分被富集 直接调控 SASP 的转录[23]。综合以上信息，AMPK 的激活可能是抑制肝细胞衰老及 SASP 分 泌的重要原因。值得注意的是，生酮饮食被发现可
显著促进 AMPK 的活性[24]，而外源性 BHB 对其影响尚不明确。基于以上信息，我们推测 BHB 可能通过激活 AMPK号通路，抑 制肝细胞衰老及 SASP 的分泌，从而在 MASH 向 HCC 的恶性转化过程中发挥调控作用。
3.5提出假说
   综合上述实验结果及文献分析，我们提出“BHB通过调控AMPK活性，抑制细胞衰老及SASP分泌，最终抑制MASH向HCC演进”的科学假说。本项目以MASH相关HCC的预防出发，利用MASH~HCC序贯小鼠模型、多种肝细胞损伤模型、临床样本验证，深入研究BHB抑制MASH向HCC演进的作用及机制。研究的开展不仅拓展了人们对MASH~HCC进展机制的认识，并为MASH相关HCC的防治提供一个新的方向。 
summernote-img                                    
                                                                            机制假说图二


                                                                                参考文献
[1] Yang C, Zhang H, Zhang L, Zhu AX, Bernards R, Qin W, Wang C. Evolving therapeutic landscape of advanced hepatocellular carcinoma. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2023, 20(4):203-222.
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[7] Luukkonen PK, Dufour S, Lyu K, Zhang XM, Hakkarainen A, Lehtimäki TE, Cline GW, Petersen KF, Shulman GI, Yki-Järvinen H. Effect of a ketogenic diet on hepatic steatosis and hepatic mitochondrial metabolism in nonalcoholic fatty liver disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020, 117(13):7347-7354.
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4.1本项目以HCC的预防为出发点，探讨BHB对MASH向HCC演进的调控作用，目前外源性BHB对MASH向HCC进展过程的调控作用尚不清楚。
4.2 本研究将揭示外源性BHB通过AMPK信号通路抑制肝细胞衰老及SASP的机制，相关研究目前尚未见文献报道，具有创新性。
4.3 本项目研究从三个方面逐层深入，结果相互验证。拟采用的动物模型、细胞模型等技术手段也具有一定的特色。
4.4目前国内尚无任何药物被批准用于MASH治疗，本研究可能确立BHB及其调控的AMPK-SASP信号轴为新靶点，为MASH及其相关HCC的防治提供一个新的思路。
5.1技术路线
  总技术路线： 
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    技术路线一：明确BHB抑制MASH向HCC进展的功能。
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    技术路线二：阐明BHB抑制MASH向HCC进展的分子机制
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5.2拟解决的问题
 5.2.1 BHB对MASH向HCC进展过程的调控作用。
   近来研究表明，BHB与机体炎症、肿瘤发生密切相关，截至目前BHB在 MASH 及其发展为 HCC 过程中的作用尚不明确。结合我们课题组前期预实验结果，BHB可能具有负性调控MASH向HCC进展的能力。本课题拟进一步通过临床样本、细胞学、活体动物模型等研究，探索其在MASH向HCC进展过程中的调控作用。
 5.2.2 BHB是如何参与对MASH进展的调控？
   本项目拟进一步揭示BHB调控MASH发生发展的分子机制，即BHB作用于哪些靶蛋白及细胞信号传导，实现对MASH的调控。结合相关文献及课题组前期预实验结果，其调控机制可能与AMPK通路及细胞衰老途径有关。本课题拟进一步对其进行验证，并通过细胞学、动物活体模型与临床研究对相关机制进行探讨。
5.3预期成果：
 5.3.1证实外源性BHB在MASH向HCC演进中的调控作用。
 5.3.2明确BHB通过调控AMPK抑制SASP延缓MASH向HCC演进的作用机理，为开发阻断MASH向HCC进展的药物研究提供实验依据。
 5.3.3项目成果预期发表高水平论文1-2篇，采用产学研合作计划加强与中国生物制药等专注于肝炎肝癌治疗的药物企业的合作，针对β -羟基丁酸在MASH向HCC 进展不同阶段的应用方法、联合用药方案申请专利1项，提升技术壁垒，拓展临床应用场。
2025/06-2025/12
（1）完成人MASH相关肝癌组织标本中BHB含量的检测，并分析其与临床病理特征及患者预后的关系；
（2）完成FFA诱导肝细胞炎症损伤模型的构建，评价BHB干预对肝细胞炎症损伤的影响。
2026/01-2026/06
（1）完成MASH~HCC序贯模型小鼠的构建，并证实BHB在MASH向HCC演进中的抑制作用。
（2）体外基于肝细胞炎症损伤模型并结合CRISPR-Cas9及RNA干扰技术，探明BHB通过调控AMPK抑制SASP分泌的作用机理.
2026/07-2026/12
（1）完成AMPK敲除小鼠的构建，观察AMPK对SASP的影响及其对MASH~HCC进展的调控作用；
（2）完成临床样本中BHB、AMPK、p-AMPK、细胞衰老及SASP因子水平等的检测，临床样本验证BHB参与MASH~HCC进展的机制。
2027/01-2027/06
（1）参加国内外研究领域的学术交流会议，实验补遗，分析整理数据；
（2）撰写论文、专利，临床应用推广，并完成课题鉴定。
研究基础1：检测MASH小鼠肝组织中的BHB水平
   课题组前期采用高脂高胆固醇饮食成功构建 MASH 小鼠模型，并采用 ELISA 技术检测 MASH 小鼠及正常对照小鼠肝组织中 BHB 的水平。结果显示，与对照组相比，BHB 含量在 MASH 小鼠肝组织中显著降低（图 1）

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                                                       图 1. 检测 MASH 小鼠肝组织中 BHB 水平
A. MASH 小鼠及正常对照小鼠肝组织 HE 染色代表图；B. ELISA 技术检测 MASH 小鼠及正常对照小鼠肝 组织中 BHB 水平; *p<0.05。
研究基础 2：检测 MASH 小鼠肝组织中的细胞衰老及 SASP 指标的表达
   我们采用 RT-qPCR 及 ELISA 技术分别检测了 MASH 小鼠及正常小鼠肝组织中细胞衰老 指标及 SASP 因子的表达。结果显示，衰老指标（P53、P21、P16 等）及 SASP 因子（TNF- α、IL-6、IL-10、IL-1β等）在 MASH 小鼠肝组织中表达也明显升高，且 SASP 的重要调控基 因 NF-κB 的表达也明显升高（图 2）。

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                                          图 2. MASH 小鼠及正常小鼠肝组织中衰老指标及 SASP 的表达
A. RT-qPCR 检测 MASH 小鼠及正常小鼠肝组织细胞衰老及 SASP 的表达水平；B. ELISA 技术检测 MASH 小鼠及正常小鼠肝组织 SASP 的表达水平; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。
研究基础3：BHB 抑制小鼠 MASH 向 HCC 的进展
   课题组进一步采用 STZ 和高脂高胆固醇饮食成功构建可以模拟 MASH 向 HCC 演进的 STAM 小鼠模型，在此基础上采用 NaBHB 干预，探索其在 MASH 向 HCC 转化过程中的潜在 影响。结果如图显示，与对照徐相比，NaBHB 干预显著抑制了 MASH 向 HCC 演进的病理进 程，MASH 相关 HCC 的发生率显著降低（图 3）。summernote-img

                                             图 3. 体内研究 BHB 在 MASH 向 HCC 演进进程中的作用
A. 模拟 MASH 向 HCC 演进的 STAM 示意图;
B. STAM 模型不同组小鼠肝脏大体和 HE 染色代表图; C. STAM 模型不同组小鼠肝脏肿瘤数量统计图; *p <0.05, ****p<0.0001。

研究基础 4：BHB 抑制小鼠 MASH~HCC 进程中细胞衰老及 SASP 分泌 为探究 BHB 对细胞衰老、SASP 的影响
   我们采用 Western blot 和 RT-qPCR 技术评估了 STAM 模型中小鼠肝组织细胞衰老标志物及 SASP 因子水平。结果显示，与正常对照组相 比，MASH 和 HCC 模型组小鼠肝组织中衰老相关指标（P53、P21、P16）及 SASP 因子 （NF-κB、IL-6）水平均显著升高，NaBHB 治疗后小鼠肝组织中细胞衰老指标及 SASP 因子 水平均显著降低（图 4A-D）。
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                                                          图 4.体内研究 BHB 对细胞衰老及 SASP 的调控
A 和 B. Western blot 检测 MASH 阶段（A）及 HCC 阶段（B）不同组间小鼠肝组织细胞衰老指标蛋白水 平；C 和 D. RT-qPCR 检测 MASH 阶段（C）及 HCC 阶段（D）不同组间小鼠肝组织细胞衰老指标及 SASP 转录水平。*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001。
研究基础5：体外证实 BHB 抑制肝细胞的衰老及 SASP 分泌 为进一步证实 BHB 对肝细胞衰老及 SASP 的影响
   我们体外构建了两种细胞衰老模型： 棕榈酸（PA）诱导的脂毒性代谢衰老模型及过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激驱动性衰老模 型，并采用 BHB 干预，结果显示，NaBHB 干预可显著抑制两种衰老模型中肝细胞的衰老及 SASP 因子的分泌（图 5A-E）。
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                                                      图 5. 体外证实 BHB 对肝细胞衰老及 SASP 的影响
A. 检测肝细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性. B 和 C. Western blot 检测 L02 代谢性衰老模型及HepG2/Huh7 氧化应激衰老模型中不同组间细胞衰老指标及 SASP 蛋白水平；D 和 E. RT-qPCR 检测上述两 种衰老模型中不同组间细胞衰老指标及 SASP mRNA 水平。*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001。
研究基础 6：体内外实验证实 BHB 对 HCC 恶性表型的抑制作用
   课题组前期通过建立荷瘤裸鼠移植瘤模型、人肝癌类器官模型，并结合多种肝癌细胞 系，采用 CCK8、细胞划痕等体外功能实验，进一步探究了 BHB 对 HCC 恶性表型的影响。 结果显示，外源性 BHB 干预可显著抑制荷瘤裸鼠肿瘤及人肝癌类器官的生长，并显著抑制HCC 细胞的增殖、迁移等恶性生物学特征（图 6）。
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                                                           图 6. BHB 对 HCC 恶性生物学特征的影响
A. BHB 干预对 HCC 荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响；B.CCK8 实验检测 BHB 对 HCC 细胞增殖的影响；C. BHB 对人肝癌类器官生长能力的影响；D. 划痕实验检测 BHB 对肿瘤细胞迁移能力的影响。
研究基础7：细胞衰老及SASP相关指标在MASH小鼠肝组织中的表达
   课题组前期采用 Western blot 及 RT-qPCR 技术检测了人肝癌及癌旁组织中细胞衰老指标 及 SASP 因子的表达。结果显示，衰老相关标志物（P53、P21、P16）及 SASP 因子（IL- 1β、IL-6、IL-10、TNF-α）在肝癌组织中显著上调，同时，SASP 调控基因 NF-κB 的表达亦 显著升高。提示细胞衰老及 SASP 可能在 HCC 的发生发展中起重要作用（图 7）。 summernote-img
                                           图7. 细胞衰老及 SASP 相关指标在 HCC 患者肿瘤组织中的表达
A. Western blot 检测 HCC 患者肿瘤及对应癌旁组织中衰老指标及 SASP 因子的表达；B. RT-qPCR 检测 HCC 患者肿瘤及癌旁组织中衰老指标及 SASP 因子的表达。*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001。
7.2.1理论依据充分
   近来文献报道，BHB作为酮体代谢的最重要产物之一，可能在调控MASH进展中发挥关键作用。本项目从探索BHB功能出发，预实验结果初步证实BHB抑制MASH~HCC进程的功能存在。结合相关文献及课题组进一步研究发现，其调控机制可能与AMPK通路及细胞衰老途径有关。因此，我们提出“BHB通过调控AMPK活性，抑制细胞衰老及SASP分泌，最终抑制MASH向HCC演进”的科学假说。项目所涉及的科学问题均基于已发表文献和前期的预实验基础，因此本课题在“理论上”是可行的。
7.2.2技术方法成熟
   本项目研究团队长期致力于MASH和HCC发病机制的研究，积累了丰富的技术经验和样本资源。课题组前期已建立了成熟的可以模拟MASH向HCC演进小鼠模型、肝细胞炎症损伤模型及细胞衰老模型，相关文章均已发表。此外，本项目大创团队成员均已熟练掌握如RT-qPCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光、细胞培养、细胞功能学实验等相关技术，保证了课题的顺利进行。
7.2.3团队实力雄厚
   本项目指导老师一直围绕MASH及相关HCC的衰老微环境及代谢调控机制开展研究工作，目前以第一作者共发表SCI论文7篇，其中中科院2区及以上SCI论文3篇，主持或参与省部级项目4项、厅局级项目3相，且项目指导老师为济宁医学院硕士研究生导师，目前指导硕士研究生6名，确保了充足的人力支持。此外，本项目研究团队是由泰山学者专家、专职科研人员、临床医师、在站博士后、研究生及实验助理人员组成的稳健研发团队，专业涵盖干细胞生物学、临床医学、生物信息学、分子生物学等多个学科，团队结构合理，技术力量雄厚，为本项目的顺利实施提供了有力的技术支持。
7.2.4 平台支撑完备
   济宁医学院附属医院是一所集医疗、科研和教学为一体的省属综合性三级甲等医院、省区域医疗中心，其主要业务指标持续保持国内同级医院优秀水平。单位拥有省重点实验室，总面积达 2500m2，具备本项目实施所需要的全部仪器设备。另外，本项目依托济宁医学院公共科研平台、贺林院士工作站等科研平台拥有一系列高、精、尖的仪器设备及常规设备。济宁医学院实验动物中心拥有 SPF 级动物房（SYXK（鲁）20180002），为科研所需实验动物的饲养、繁殖提供了保障。此外，本项目工作量大及经费需求高，学校将给予一定比例的经费匹配，为本项目的实施提供了有力的保障。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 - 10000.00 10000.00
1. 业务费 4000.00 - 0.00 4000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 1000.00 参加学术交流、交通、住宿等 0.00 1000.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 发表论文、申请专利 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 16000.00 细胞实验所需试剂、分子生物学实验所 需试剂、相关抗体、动物购置及其他相 关实验试剂、耗材。 10000.00 6000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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