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肺炎支原体与结核分枝杆菌双价疫苗的构建及其免疫学研究

申报人：朱万里 申报日期：2025-03-27

基本情况

2025创新项目
肺炎支原体与结核分枝杆菌双价疫苗的构建及其免疫学研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生自主选题
二年期
本研究创新性开发重组卡介苗 P116-Ag85B-rBCG，旨在建立针对肺炎支原体感染和结核病的双重免疫屏障。通过基因工程技术将肺炎支原体 P116-N 抗原与结核杆菌 Ag85B 蛋白融合，构建新型抗原表达系统，利用大肠杆菌-BCG 穿梭载体 pMV261 实现高效分泌表达。经 Western Blot 验证蛋白表达后，通过动物模型系统评估疫苗免疫原性及交叉保护效果。该疫苗突破传统 BCG 单一防护局限，通过抗原融合策略同步激活双病原特异性免疫应答，为开发广谱抗感染疫苗提供全新研究方向，具有重要临床转化价值。
自 2023 年 9 月进入济宁医学院病原微生物实验室后，参与一系列实验课题，并熟练掌握了多项实验操作，积极参与了挑战杯、互联网+、实验创新大赛等竞赛。
现主持山东省自然基金重点项目、省自然科学基金上项目、省高等学校科技计划项目多项；各项科研资金总计 116 余万。
指导老师长期从事有关 rBCG 的构建与其免疫学特性的研究，可以给予项目正确有效的帮助 。 同时其申请的“预防疾病，护佑健康－重组疫苗研究与开发工作坊”已获得学校立项，本申请已获得指导教师的支持与指导。

省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
朱万里 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 载体选择和构建、动物实验、论文撰写
张晓琰 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2024 统计学分析
岳皓旭 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 构建重组质粒
马明红 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2023 Weastern blot

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
薛庆节 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

本项目基于基因重组技术，将P116与Ag85B蛋白编码基因进行功能化融合，并与pMV261载体高效连接，构建稳定表达的重组质粒，实现其在重组卡介苗（rBCG）中的精准表达。通过体外表达验证及动物模型实验，系统评估P116-Ag85B融合蛋白的表达水平、rBCG的生物安全性及其对结核病和肺炎支原体的协同免疫保护效应。研究旨在突破传统疫苗单一免疫的局限性，为开发新型BCG载体疫苗提供科学依据，推动多功能疫苗的创新发展，为全球传染病防控提供创新解决方案。
2.1 PCR 扩增目的基因 P116 和 Ag85B 并回收
2.1.1 引物设计
  上游引物（P116-F）：GCCGGATCCCTATCAGTCGCTGGT
  下游引物（Ag85B-R）：GCCGTCGAGTGAGCTGTAGAAGCTGGACTGCCCGCC
  上游引物（Ag85B-F）：CGGAATTCATGACAGACGTGAGCCGAAAGA
  下游引物（P116-R）：GCGTCGACTAAAACCTTACCGTTTAAAGTAATGTGGTC
  下游引物（P116-r）：GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCGTTTAAACCCAAAGTGTAAT
  上游引物（Ag85B-f）：GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGACAGACGTGAGC
注：以上下划线标记为酶切位点，加粗斜体为Linker，酶切位点前为保护碱基 。
2.1.2基因P116和Ag85B的pcr
以P116基因/Ag85B基因为模板进行PCR扩增，总体积为50 μl，PCR体系如下：
P116基因/Ag85B基因
0.5 μl
引物P116-F/Ag85B-F
0.2 μl
引物P116-R/Ag85B-R
0.2 μl
5×PrimeSTAR GXL Buffer
10 μl
dNTP Mixture
4 μl
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase
1 μl
ddH2O
34.1 μl
PCR反应程序如下：98℃预变性4 min；98℃变性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸60 s，共30个循环；68℃再延伸5 min。
2.1.3 纯化并回收目的基因
P116和Ag85B基因的扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，随后在紫外透视仪下切取目标基因条带，并对PCR产物进行纯化回收。
2.2 通过重叠 PCR 方法获取融合目的基因 P116-Ag85B
2.2.1 重叠 PCR 获取融合目的基因 P116-Ag85B
扩增体系如下：
P116 与 Ag85B 基因 PCR 扩增产物
各1μL
P116-F 与 Ag85B-R
各0.2μL
dNTP Mixture
4μL
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase
1μL
5×PrimeSTAR GXL Buffer
10μL
ddH2O
32.6μL
PCR反应程序如下：98℃预变性4 min；98℃变性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸110 s，共30个循环；68℃再延伸5 min。
重叠 PCR 示意图：
summernote-img

2.2.2 纯化并回收目的基因
P116-Ag85B基因的扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，在紫外灯下切取目标条带，并对PCR产物进行回收纯化，步骤如下：
（1）凝胶切割与溶解：紫外透视下切取含目的条带的琼脂糖凝胶，按每 0.1g 凝胶加 100μl PN 溶液，50℃水浴至完全溶解；
（2）吸附柱平衡：向吸附柱加 500μl 平衡液 BL，12000rpm 离心 1min 后弃废液；
（3）目的片段结合：溶解液转移至吸附柱，室温静置 2min，12000rpm 离心 1min 弃废液； 
（4）漂洗除杂：加 600μl 漂洗液 PW，12000rpm 离心 1min 弃废液，重复漂洗 1 次；
（5）干燥吸附柱：12000rpm 空离 2min 去除残留液体，吸附柱敞口放置 10min 晾干；
（6）DNA 洗脱与回收：向吸附膜加 40μl 55℃预热 ddH2O，55℃水浴 2min 后 12000rpm 离心 2min 收集溶液；重复洗脱一次，最终 DNA 溶液 - 20℃保存。
2.3 双酶切 P116-Ag85B纯化产物和 pMV261 质粒并纯化回收
P116-Ag85B 扩增产物/pMV261 质粒
20μL
EcoRⅠ与 SalⅠ
各 2μL
10K ×Buffer
4μL
ddH2O
12μL
振荡混匀后离心至无液体挂壁，37℃水浴锅过夜孵育。
2.4 构建重组质粒P116-Ag85B-PMV261与筛选鉴定
2.4.1 连接融合基因P116-Ag85B与载体PMV261
P116-Ag85B 融合基因酶切产物
20μL
pMV261 酶切产物
20μL
T4 DNA 连接酶
5μL
10×T4 Buffer
5μL
振荡混匀后离心至无液体挂壁，16℃过夜孵育。（模板体积按照融合基因酶切产物质量：pMV261酶切产物质量=5:1计算）
2.4.2 转化
取冰上融化的 E.coli DH5α 感受态细胞，与重组质粒混匀后冰浴 30min；42℃ 热激 90s，冰浴 10min；加入 800μl LB 液体培养基，37℃、160rpm 振荡培养 1h；5000rpm 离心 3min，弃 700μl 上清，剩余菌液涂布于含 Kan 的 LB 固体培养基，37℃培养 18-24h。 
2.4.3 提质粒
（1）菌体处理：4000rpm 离心菌液 15min 收集菌体，转移至 1.5ml 离心管后 12000rpm 离心 1min 弃上清；加 250μl 含 RNase A 的 P1 溶液重悬，加 250μlP2 溶液温和翻转混匀 6-8 次，加 350μl P3 溶液翻转混匀，12000rpm 离心15min；
（2）质粒吸附与纯化：上清液转移至已用 500μl BL 平衡液预处理（12000rpm离心 1min 弃废液）的吸附柱，12000rpm 离心 1min 弃废液；加 600μl 含乙醇的PW 漂洗液离心洗涤（12000rpm×1min），重复 1 次；
（3）质粒洗脱：吸附柱 12000rpm 空离 2min，敞口晾干 10min 后，加 60μl55℃预热 ddH₂O，55℃水浴 2min，12000rpm 离心 2min 收集溶液；重复洗脱一次，最终产物 - 20℃保存。
2.4.4 鉴定重组质粒：
以pMV261-P116-Ag85B重组质粒为模板进行PCR扩增，且通过EcoRI/SalI双酶切验证载体构建正确性，并采用Sanger测序法检测碱基序列完整性及潜在突变位点。
2.4.5 按照以上方法构建P116-PMV261和Ag85B-PMV261重组质粒
2.5 构建重组卡介苗及其鉴定
2.5.1 制备 BCG 感受态细胞
取对数生长期 BCG（OD₆₀₀=0.6），1ml / 管分装后冰浴 1.5h；4℃、5000rpm 离心 10min 收集菌体，用 100μl 预冷 10% 甘油重悬，重复洗涤 2 次（同速离心弃上清）；最终用 100μl 预冷 10% 甘油重悬，-80℃冻存。
2.5.2 电转化构建rBCG
（1）电转杯预处理：0.2cm 电转杯经 ddH₂O 清洗、75% 酒精浸泡 10min、紫外照射 30min 后冰浴预冷；
（2）电转操作：取 10μl 重组质粒与 100μl 冰融 BCG 感受态混合，冰孵15min 后转入电转杯，设定电压参数电转；
（3）重组菌培养：电转后加 1ml Middlebrook 7H9 培养基，37℃、160rpm 摇床培养 24h；次日 5000rpm 离心，留 100μl 菌液涂布含 50μg/ml Kan 的 M7H10 固体培养基，37℃培养 3-4 周。
2.5.3 抗酸染色鉴定
使用接种环蘸取一环rBCG，均匀涂抹于洁净载玻片上，晾干后固定。随后，按照抗酸染色试剂盒的操作步骤进行染色。待载玻片干燥后，置于油镜下观察。
2.5.4 RNA 的提取
（1）菌体裂解：5ml 对数期 rBCG 12000rpm 离心 1min 弃上清，Trizol 重悬后液氮研磨至粉末，加 1ml Trizol 室温孵育 5min；
（2）核酸分离：加 200μl 氯仿振荡，4℃、12000×g 离心 15min，取水相用异丙醇沉淀、75% 乙醇洗涤；
（3）RNA 溶解：干燥后加 20μl DEPC 水，56℃金属浴 10min 溶解，紫外分光光度计测浓度后逆转录合成 cDNA。
2.5.5 实时荧光定量 PCR 检测
反应体系为10μL，包括2μL cDNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL 2×AcθQ qPCR SYBR Green和2μL ddH2O（每个样品设置3个重复孔）。反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，60℃退火116秒，72℃延伸116秒，共40个循环。溶解段为95℃ 15秒，60℃ 60秒，95℃ 15秒。
2.6 P116-Ag85B 重组蛋白的 rBCG 诱导表达及鉴定
2.6. 1 rBCG 的诱导表达及提取蛋白
（1）诱导表达：对数期 rBCG 调 OD₆₀₀=0.6，45℃、160rpm 诱导 45min，连续3 天，12000rpm 离心收集菌体；
（2）蛋白制备：PBS 洗涤 2 次，加 100μl 裂解液冰浴 30min，超声破碎（225W，10s 工作 / 15s 间歇，30min）；4℃、12000rpm 离心 30min，取上清加5×SDS-PAGE 上样缓冲液，99℃煮沸 10min，-20℃保存。
2.6.2 SDS-PAGE 电泳 
（1)制胶：用ddH2O洗净玻璃板，待其晾干后置于制胶架上，制备12%的分离胶。12%分离胶成分如下：
ddH2O
4.9 ml
30%Acrylamide
6.0 ml
1.5 M Tris-HCl（pH=8.8)
3.8 ml
10%SDS
0.15 ml
10%APS
0.15 ml
TEMED
0.006 ml
将其上下颠倒混匀，加入胶板中使高度达到3/4左右，并用75%酒精去除气泡进行液封。待12%分离胶和75%酒精之间出现折线（30-40 min），表明分离胶已凝固好。倒掉75%酒精，用ddH2O冲洗后擦净残留ddH2O，制备5%浓缩胶。5%浓缩胶成分如下：
ddH2O
2.1 ml
30%Acrylamide
0.5 ml
1.0 M Tris-HCl（pH=6.8）
0.38 ml
10%SDS
0.03 ml
10%APS
0.03 ml
TEMED
0.003 ml
将其上下混匀后加入分离胶上方，注意驱赶气泡。选择合适厚度的梳子插入浓缩胶中，注意避免产生气泡，20 min左右后即可凝固；
（2)电泳：将胶置于电泳槽中，倒入1×running buffer至没过胶孔，将梳子缓慢拔出，进行加样，并用pMV261-rBCG和BCG作为对照，同时加入彩色预染蛋白质分子量标准，不足20 μl的用1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液补齐。将电压调至80 V进行电泳，当条带跑过浓缩胶后（约45 min），上调电压至120 V，直至条带接近分离胶底部后停止电泳；
（3)考马斯染色
用ddH2O清洗胶表面后将考马斯亮蓝超快染色液滴加在胶表面，使其铺满胶表面，染色30 min；
（4)脱色
去掉多余的染色液，加入ddH2O后放在脱色摇床上慢速清洗。十分钟换一次ddH2O，直至背景变为无色透明。拍照保存。
2.6.3 融合蛋白的Western Blot鉴定
（1）SDS-PAGE电泳
制胶及电泳的具体步骤见2.6.2。
（2）湿转法转膜
  1．PVDF 膜甲醇活化 2-5min，转膜液平衡；
  2．按 “海绵垫→3 层滤纸→凝胶→PVDF 膜→3 层滤纸→海绵垫” 组装转膜三明治，放入预冷转膜液；
  3．冰浴条件下 100V 恒压转膜 60min。
（3）免疫反应检测
  1．封闭：3% BSA 室温摇床封闭 2h；
  2．一抗孵育：P116 抗体（1:1000）、Ag85B 抗体（1:2000）4℃孵育过夜；
  3．洗膜：1×TBST 快速洗脱（10min / 次，6 次）；
  4．二抗孵育：山羊抗小鼠抗体（1:3000）室温摇床孵育 2h；
  5．曝光：ECL 发光液（A:B=1:1）覆盖 PVDF 膜，化学发光仪显影分析。
2.7 rBCG的动物免疫和体外杀伤实验
2.7. 1 实验动物分组
取6-8周体重相近的C57BL/6J雌性小鼠，随机分为PBS、BCG、P116-rBCG、Ag85B-rBCG和P116-Ag85B-rBCG共5组，每组5只。
2.7.2 rBCG的免疫
取少量培养至线性生长期的BCG、P116-rBCG、Ag85B-rBCG和P116-Ag85B-rBCG，12000 rpm离心1 min，去上清，加1 ml PBS洗涤，用PBS调整rBCG的吸光度为OD600=2.1（通过显微镜计数显示细菌约为107/ml）进行腹腔注射100 μl/只。每隔两周注射一次，共三次。
2.7.3 淋巴细胞的分离
（1）末次注射两周后，取小鼠眼球血至肝素抗凝管，并分离小鼠脾脏；
（2）血样静置 15 min 后，4℃ 3500 rpm 离心 15 min 取血浆；血细胞沉淀经红细胞裂解液反复处理（加裂解液混匀→静置 5 min→PBS 稀释→1500 rpm 离心 5min 去上清）至红细胞完全裂解；
（3）脾脏置 PBS 研磨后收集细胞，经相同红细胞裂解流程（裂解液处理→PBS稀释离心）至红细胞完全裂解；
（4）最终血淋巴细胞和脾淋巴细胞经滤膜过滤获得。
2.7.4流式细胞分析T细胞内细胞因子
（1）淋巴细胞经 1640 完全培养基洗涤（1500 rpm 离心 5 min 去上清，重复 1次），重悬后加 PMA、离子霉素、莫能霉素，37℃刺激培养 4-6 h；
（2）收集细胞，PBS 洗涤（1500 rpm 离心 5 min 去上清，重复 1 次），加入CD4（FITC）、CD8（APC）抗体，4℃避光孵育 30 min；
（3）再次 PBS 洗涤后，IC Fixation Buffer 固定（4℃避光 30 min），1500rpm 离心去上清；
（4）1×Permeabilization Buffer 破膜后，加 IFN-γ（PE）、TNF-α（V450）抗体，4℃避光孵育过夜；
（5）次日 PBS 洗涤后重悬，过滤后流式细胞仪检测 T 细胞内细胞因子表达。
2.7.5 rBCG 对脾淋巴细胞的体外刺激
（1）取每组 3 只小鼠的脾淋巴细胞（1500rpm 离心5 min→1640培养基洗涤→离心），定量分 3 份至 48 孔板（每孔 1 ml 培养基）；
（2）按分组加入刺激物：
PBS组：100 μl PBS；
BCG组/各rBCG组（P116-rBCG、Ag85B-rBCG、P116-Ag85B-rBCG）：分别加100μl PBS、10³/ml菌液、10⁶/ml菌液；
（3）CO₂培养箱培养 48 h。
2.7.6 流式细胞分析rBCG刺激脾淋巴细胞后T细胞内因子检测
收集刺激后的脾淋巴细胞，经以下流程检测：
（1）1640 培养基洗涤（1500 rpm 离心 5 min）→加 PMA / 离子霉素 / 莫能霉素，37℃刺激 4-6 h；
（2）PBS 洗涤（离心去上清，重复 1 次）→加 CD4（FITC）、CD8（APC）抗体，4℃避光孵育 30 min；
（3）IC Fixation Buffer 固定（4℃避光 30 min）→PBS 洗涤离心→1×Permeabilization Buffer 破膜；
（4）加 IFN-γ（PE）、TNF-α（V450）抗体，4℃避光孵育过夜→PBS 洗涤→200 μl PBS 重悬→过滤后流式检测。
2.7.7 CNE-2Z细胞复苏及培养
（1）冻存管 37℃水浴快速融化→1000 rpm 离心 5 min→1640 培养基重悬→10ml 培养基中培养；
（2）细胞 80%-90% 融合时传代：PBS 润洗→胰酶 37℃消化 20 min→1640 培养基终止→离心去上清→1 ml 培养基重悬→均分至 3 个含 10 ml 培养基的培养皿→37℃ CO₂培养箱培养。
2.7.8 rBCG特异性淋巴细胞杀伤效率检测
（1）消化对数期 CNE-2Z 细胞（PBS 润洗→胰酶消化→1640 终止→离心→10 ml 培养基重悬）→96 孔板铺板（每孔 100 μl）；
（2）按 CNE-2Z: 脾淋巴细胞 = 1:1/1:2/1:4 共培养 24 h→吸弃上清→PBS 润洗；
（3）加发光检测试剂（100 μl 培养基 + 100 μl 试剂盒）→室温震荡 2 min→孵育 10 min→酶标仪检测发光强度；
（4）按公式 R=(X-Y)/X×100% 计算杀伤效率（X 为初始发光值，Y 为共培养后发光值）。
2.7.8 统计学分析
采用GraphPad Prism 8.0对符合正态分布实验数据（以 ±SEM表示）进行统计学分析，rBCG免疫小鼠的流式分析，rBCG特异性淋巴细胞体外杀伤实验，数据两两比较采用配对T检验，组间采用One-way ANOVA分析，若P<0.05，则该差异有统计学意义。
2.7.9 对疫苗安全性进行评估
为评估重组卡介苗（rBCG）疫苗的安全性及免疫保护效能，开展系统的毒理学及致瘤性研究。实验将BALB/c小鼠随机分组，分别接种不同剂量rBCG疫苗（10^5-10^7 CFU），同时设立空载体BCG及PBS阴性对照组。接种后，实验动物暴露于肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）混合感染环境，持续监测其生存状态、体重变化及组织病原体载量等指标，综合评价疫苗的免疫保护效果。
2.7.10 小鼠肺组织病理切片及肺标本制备
组织样本采集与处理：实验终点处死感染肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的小鼠后，分别采用两种方法进行肺组织处理：（1）石蜡切片样本：迅速分离肺组织，置于4%多聚甲醛固定液中，用于后续石蜡包埋及HE染色；（2）全肺标本：经气管灌注10%中性福尔马林溶液，灌注前轻柔挤压肺叶排除气体并清除气道分泌物。灌注时维持肺组织处于生理性深吸气状态，待各肺叶充分膨胀后结扎气管，确保肺叶保持解剖位置。将灌注固定后的肺组织置于10%福尔马林溶液中，4℃条件下固定5天。
2.7.11 小鼠肺组织病理检查
剩余实验动物在混合病原体环境中暴露8周后处死，分离肺组织。取部分肺叶经4%多聚甲醛固定后，依次进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明及石蜡包埋处理，制备4μm厚度切片。HE染色流程如下：苏木精染色10min→流水冲洗→0.7%盐酸乙醇分化→流水返蓝→梯度乙醇脱水（95%乙醇2次，各116s）→伊红染色116s→无水乙醇脱水2次（各116s）→石碳酸-二甲苯（1:4）透明116s→二甲苯透明2次（各116s）→中性树胶封片。最后于光学显微镜下观察并分析肺组织病理学改变。 
（1）肺炎支原体P116蛋白的研究进展:
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是社区获得性肺炎的重要病原体，其致病机制依赖于黏附蛋白介导的宿主细胞结合。P116蛋白作为肺炎支原体的核心黏附蛋白之一，在病原体感染中发挥关键作用。研究表明，P116的N端片段（如P116-N27）具有高度免疫原性，能够特异性结合患者血清抗体，显著提升血清学检测的敏感性和特异性 [1]。此外，P116通过与宿主细胞表面受体相互作用，促进病原体定植，其多克隆抗体可显著抑制肺炎支原体对A549细胞的黏附 [2]。近期研究进一步揭示，P116通过其特有的疏水腔结构提取宿主胆固醇和磷脂，为病原体生存提供必需脂质 [3]，这一发现为靶向P116的疫苗设计提供了新思路。
（2）结核分枝杆菌Ag85B蛋白的免疫学特性
Ag85B（Antigen 85B）是结核分枝杆菌复合群分泌的关键抗原，参与分枝菌酸合成并介导宿主免疫应答。其高免疫原性使其成为结核疫苗开发的核心靶点。Ernst等通过酶联免疫吸附试验（ELISA）证实，Ag85B在感染早期大量分泌，并动态调节宿主的T细胞免疫应答[4]。此外，Ag85B与佐剂（如c-di-AMP）联合应用可显著增强Th1/Th17型免疫反应，降低肺部病理损伤 [5]。尽管Ag85B单独免疫的保护效果有限，但其作为亚单位疫苗或重组疫苗组分时，可显著提升BCG的免疫效力 [6]。
（3）BCG的改造潜力与双价疫苗设计
卡介苗（BCG）是唯一获批的结核疫苗，但其对成人肺结核的保护效果不足 [7]。近年来，重组BCG（rBCG）通过表达多种抗原（如Ag85B、ESAT-6）或佐剂分子（如IL-12），显著提升了免疫保护范围 [8]。BCG的固有免疫调节能力（如训练免疫）进一步支持其作为疫苗载体的潜力 [9]。通过将肺炎支原体和结核分枝杆菌的抗原基因整合至BCG，可同时激活针对两种病原体的特异性免疫应答，实现“一苗多防”。
（4） P116与Ag85B的协同作用依据
①免疫原性互补：P116作为肺炎支原体的黏附抗原，能诱导黏膜免疫（如SIgA）和细胞免疫（如CD4+ T细胞）；Ag85B则通过Th1型免疫反应增强结核保护 [10]。两者的结合可覆盖呼吸道感染的多种免疫防御机制。
②功能协同：P116的脂质提取功能可能增强BCG的抗原呈递效率，而Ag85B的分泌特性可促进免疫系统对融合蛋白的识别 [11]。
③技术可行性：已有研究成功将外源基因（如HPV L1）插入BCG并稳定表达 [12]，为P116-Ag85B融合基因的导入提供了技术参考。
肺炎支原体与结核分枝杆菌的双重感染在临床中日益常见，但现有疫苗均针对单一病原体。通过重组BCG表达P116-Ag85B融合蛋白，既能利用BCG的免疫调节特性，又可同时靶向两种病原体的关键抗原。P116的黏附抑制功能与Ag85B的强免疫原性相结合，有望突破传统疫苗的局限性，为呼吸道感染提供全面防护。未来需进一步验证融合蛋白的稳定性、免疫原性及动物模型中的保护效果，以推动其临床应用。
参考文献
[1] Tabassum I, Chaudhry R, Chourasia B K, et al. Identification of an N-terminal 27 kDa fragment of Mycoplasma pneumoniae P116 protein as specific immunogen in M. pneumoniae infections[J]. BMC Infectious Diseases, 2010, 10: 1-9.
[2] 林康,文志,周畅,等. 肺炎支原体P116基因FP2片段的免疫优势和细胞黏附活性[J]. 安徽医科大学学报, 2021, 56 (08): 1268-1272.
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（1）研究目标的前沿性与创新性
本研究基于基因工程技术，创新性地将肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）P116黏附蛋白基因与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）Ag85B结构蛋白基因进行功能化融合，构建新型BCG载体重组疫苗。研究聚焦于融合蛋白的生物学活性验证及双价免疫效应的评估，旨在通过系统性动物实验阐明其免疫保护机制。该疫苗的开发不仅为儿童群体提供了针对支原体肺炎和结核病的双重免疫屏障，同时也为多功能疫苗的研发提供了新的技术路径，对完善疫苗研发体系和提升疾病防控水平具有重要的科学价值与实践意义。
（2）研究方法的创新性与先进性
本研究采用剪接重叠延伸（SOE）技术，通过设计(Gly4Ser)3柔性linker实现P116与Ag85B基因的无缝拼接，确保融合蛋白的结构完整性。该多肽接头由柔性氨基酸序列构成，可有效维持两个功能域的生物活性。为验证融合蛋白的准确性，研究运用高分辨率质谱技术对其一级结构和二级构象进行系统表征。同时，整合单细胞转录组测序技术，在全基因组尺度解析目的基因的表达谱，为功能验证提供多维度数据支持。这种多技术联用的研究策略不仅提高了实验数据的可靠性，也为蛋白工程研究提供了新的方法学参考。
（3）BCG 作为活疫苗载体的特色
BCG作为活疫苗载体具有独特优势：1.持续抗原表达：疫苗在宿主体内可自主复制，实现外源抗原的长期表达，促进免疫系统持续活化；2.高效免疫记忆：通过持续性抗原刺激，诱导产生长效免疫记忆，为二次免疫应答提供快速保护；3.天然抗原呈递：表达的保护性抗原维持其天然构象，无需蛋白纯化等复杂工艺，即可有效激活免疫系统。这些特性使BCG成为理想的疫苗表达平台。4.安全性高，BCG已经在全球广泛应用了数十年，安全性得到充分验证，尤其是对免疫较弱的人群也较为安全。5.多价疫苗潜力：BCG可以同时表达多个抗原，适合开发针对多种病原体的多价疫苗。6.免疫原性强：BCG可有效激活细胞免疫与体液免疫，适合作为载体增强目标抗原的免疫反应。 
5.1 技术路线                                   
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5.2 拟解决问题
（1）获得可稳定表达 P116-Ag85B 的 rBCG，确保安全性 ；
（2）建立相关小鼠模型，观察 rBCG 相关的免疫作用。
5.3 预期成果
（1）含有融合基因 P116-Ag85B 的rBCG可以高效表达目的蛋白；
（2）荧光定量 PCR 结果成功；
（3）P116-Ag85B-rBCG刺激小鼠后可诱导其产生细胞免疫反应 ,产生特异性抗体。
（4）流式细胞结果分析中 rBCG 组的IFN-γ、TNF-α细胞因子含量高于对照组。
（5）融合蛋白疫苗的潜在临床应用展望：
1．全年龄段免疫适应性：
通过动物及临床前试验，明确不同人群免疫应答差异：
儿童：评估 5-10μg 皮内接种安全性，平衡 Th1 型与体液免疫，预防儿童肺炎支原体及结核潜伏感染；
成人：20-30μg 肌肉注射，分析黏膜免疫与细胞毒性 T 细胞应答，探索职业暴露人群预防价值；
老年：40-50μg 皮下接种优化佐剂，改善免疫衰退应答，针对结核复发及肺炎支原体重症风险人群。
2．多元化接种方案开发：
传统途径：验证皮内/肌肉/皮下接种的药代动力学，确定最佳抗原沉积部位及抗体峰值；
黏膜途径：探索滴鼻/口服剂型，利用 Ag85B 黏膜靶向性诱导局部免疫屏障；
剂量优化：建立"剂量-应答-安全性"模型，确定性别、BMI 等个性化方案（如肥胖人群增 20%-30% 剂量）。
3．临床转化技术储备：
冷链适应性：开发常温保存配方，提升偏远地区疫苗可及性；
联合接种：评估与 BCG、肺炎疫苗、流感疫苗的协同效应及安全阈值；
个体化监测：建立细胞因子谱和抗体亲和力评价体系，提供疫苗效果预测生物标志物。
研究预期形成可复制的疫苗设计范式，为呼吸道感染防治提供安全、有效、经济的创新方案，推动实验室成果向临床产品转化。
2025 年 1 月至 2025 年 6 月：
（1）用前期工作获得的肺炎支原体 P116 和 Ag85B 目的基因；
（2）根据基因序列来设计引物， 并测试引物的合理性；
（3）扩增 P116 和 Ag85B 目的基因并对其产物纯化回收；
（4）通过重叠 PCR 进而获得 P116-Ag85B 融合基因；
（5）对 P116-Ag85B 融合基因与质粒 pMV261 进行双酶切；
（6）酶切后进行连接， 构建重组质粒， 后转化到大肠杆菌 。
2025 年 7 月至 2025 年 11 月：
（1）观察大肠杆菌生长状态，后提取质粒并鉴定；
（2）制备感受态BCG，通过电穿孔技术将重组质粒转入BCG，并进行诱导表达；
（3）抗酸染色以鉴定其是否被污染；
（4）提取 RNA 并进行荧光定量 PCR 检测；
（5）提取 P116 、Ag85B 、P116-Ag85B 蛋白；
（6）进行十二硫酸钠—聚丙烯酰胺电泳和 Western Blot 法分析 。
2025 年 12 月至 2026 年 8 月：
（1）进行小鼠实验：来评估疫苗的免疫效果；
（2）进行流式细胞分析，检测细胞因子含量是否有变化；
（3）进行 rBCG 的体外杀伤实验；
（4）对小鼠肺组织进行HE染色以观察其病理学改变。
2026 年 9 月至 2027 年 3 月：
（1）对疫苗安全性进行评估；
（2）小鼠肺组织病理切片及肺标本制备，进行小鼠肺组织病理检查；
（3）融合蛋白疫苗的潜在临床应用评估。 
2027 年 3 月至 2027 年 6 月：
（1）对各组数据进行统计学分析， 对重组质粒线性化处理；
（2）撰写论文，核对内容，结题 。 
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
1.1 PCR 扩增P116、Ag85B目的基因
P116 基因大小为609bp。Ag85B目的基因大小978bp，如电泳结果显示，PCR扩增产物P116大小约为609bp，Ag85B大小约为978bp，与预期结果相符。
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M： DNA 标志物（DL2000）
1： P116基因扩增产物
2： Ag85B基因扩增产物
1.2重叠 PCR 来获得融合目的基因P116-Ag85B
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M： DNA 标志物（DL2000）
1： P116-Ag58B 融合基因
1.3 P116-Ag85B-pMV261 rBCG的抗酸染色图
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1.4 P116-Ag85B-pMV261的部分测序图 
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2. 1 已具备的条件
（1）制备rBCG 所需技术已较为成熟，该实验所需的仪器、试剂本实验室已基本具备，并可持续使用一段时间。
（2）关于 rBCG 构建及其免疫学特性的研究，指导老师已深入研究多年并发表了多篇学术论文，对该领域研究热点与发展方向有着深刻的理解，可在实验过程中给予指导和帮助。
2.2 尚缺少的条件
无
2.3 解决方法 
无

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 实验用途 5250.00 14750.00
1. 业务费 5500.00 实验用途 3000.00 2500.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 蛋白检测 、DNA 测序和引物 合成 1500.00 500.00
（2）能源动力费 500.00 电费， 水费等 250.00 250.00
（3）会议、差旅费 2000.00 国内学术交流会 3-4 次， 每次约 500 元 1000.00 1000.00
（4）文献检索费 500.00 文献检索 250.00 250.00
（5）论文出版费 500.00 论文查重 、论文出版 0.00 500.00
2. 仪器设备购置费 3500.00 试剂 、分子生物学相关试剂 2250.00 1250.00
3. 实验装置试制费 10000.00 动物费（肺炎支原体模型鼠约需 50 只） 0.00 10000.00
4. 材料费 1000.00 细胞株 0.00 1000.00
结束

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