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逆转慢性应激改善食管癌免疫联合放疗抵抗的研究

申报人：李戈斐 申报日期：2025-03-27

基本情况

2025创新项目
逆转慢性应激改善食管癌免疫联合放疗抵抗的研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目旨在探讨慢性应激对食管癌免疫联合放疗抵抗的影响机制，并通过逆转慢性应激状态，改善治疗效果。研究将结合动物模型和临床样本，验证ADRB2可作为食管癌放疗联合免疫治疗疗效的生物标记物以及治疗增敏新靶点的科学假说，并阐明慢性应激通过ADRB2控肿瘤细胞及肿瘤微环境，抑制食管癌放疗的敏感性及远隔效应的分子机制。最后探索了临床前转化治疗，即应用ADRB2拮抗剂或β-受体阻滞剂，探索在食管癌的放疗增敏作用。本项目的实施将为临床上食管癌放疗增敏的综合治疗提供新策略。创新点在于首次系统研究慢性应激所致β受体活化，可导致放疗敏感性及免疫远隔效应下降，进而有可能影响食管癌“放疗＋免疫”治疗的疗效，并提出在不影响食管癌治疗的前提下，应用β-受体阻滞剂（propranolol）或ADRB2拮抗剂（ICI 118,551）阻断β受体，实现对慢性应激导致的免疫抑制微环境的早期干预，进而改善患者的临床治疗效果。预期成果包括推动精准医疗发展、创新治疗策略、提高放疗和免疫治疗的疗效、促进药物开发 、优化患者管理、提高公共卫生水平。
本人虽未正式参与过科研项目，但通过课程学习和实践活动积累了相关经验。曾在Coursera平台上自学“Research Methods”和“Data Science”的专项课程，掌握了研究设计、数据收集与分析的基本方法。此外，通过阅读医疗领域与肿瘤、免疫相关的文献，熟悉了基本免疫学分子在肿瘤诊断与治疗方面的分子机制。在校期间，曾获“创意组胚”学习技能拓展大赛校级三等奖，山东省大学生心理学应用技能大赛省级三等奖等。曾多次参加课外学术竞赛分享会、“挑战杯”课外学术科技作品竞赛系列培训，对医学领域相关科研有浓厚的兴趣，希望通过大创项目深入研究该方向，并为团队贡献自己的技术能力与创新思维。
主持2023年济宁市重点研发项目立项1项，为《后疫情时代肿瘤跨领域协同防控体系建设》，目前已结题目前主持在研项目为2024年济宁市重点研发项目1项 为《逆转慢性应激改善食管癌免疫联合放疗抵抗的研究》
指导教师将全程参与项目的研究设计，帮助团队明确研究方向，优化技术路线，提供临床数据，并在实验方法、数据分析等关键环节提供专业指导。指导教师指导撰写学术论文，并协助申请相关专利。同时，指导教师将推荐优秀成果参加学术会议或创新创业竞赛。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
李戈斐 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 项目规划、任务分配、进度管理
刘超 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 数据收集与处理
李响 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 成果总结与撰写
戚祖宁 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 研究设计、宣传与展示
张镡月 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 文献调研、理论研究
熊翊彤 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 实验设计与开发

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
赵静 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

1.验证ADRB2联合患者临床病理特征可作为食管癌放疗联合免疫治疗疗效的动态预测模型及治疗增敏新靶点的科学假说；
2.阐明慢性应激通过ADRB2控肿瘤细胞及肿瘤微环境，抑制食管癌放疗的敏感性及远隔效应的分子机制；
3.探索ADRB2拮抗剂或β-受体阻滞剂可用于食管癌的放疗增敏，与免疫治疗联用具有协同作用，为提高食管癌的治疗效果寻找新的治疗方法和药物组合。
1.研究慢性应激在诱导食管癌放疗抵抗中的作用，并验证ADRB2联合患者临床病理特征可作为食管癌放疗联合免疫治疗疗效的动态预测模型的科学假说；
（1）临床方面：入组100例接受同步放化疗的食管癌患者，均接受抑郁量表CES-D和PSS-14 量表标准化问卷调查，同时收集患者临床病理数据、组织标本及外周血标本，使用机器学习构建。
  1)流行病学研究中心的抑郁量表CES-D评分
慢性应激组（抑郁状态）：≥20分
对照组（无抑郁状态）：＜15分
  2）流行病学研究中心的压力知觉量表PSS评分
慢性应激组（抑郁状态）：≥43分
对照组（无抑郁状态）：＜43分
  3）疗效评估
放疗敏感组： CR（完全缓解）+PR（部分缓解）
放疗抵抗组： PD（疾病进展）+NC（无变化）
  4）检测分析
  ①免疫组化法及免疫荧光法检测ADRB2、CD68的表达水平，统计分析慢性应激评分和ADRB2与食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的相关性；收集患者的外周血，流式细胞术检测对照组与慢性应激组外周血中巨噬细胞、T细胞以及NK细胞表达谱的差异；统计分析慢性应激状态与食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的相关性。
使用ELISA检测皮质醇、去甲肾上腺素（NE）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）等神经内分泌标志物，统计分析神经内分泌标记物（皮质醇、NE和CRH等）与食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的相关性。
  ②进行血清收集：收集患者治疗前（T0）、放疗第2周（T1）、第4周（T2）、治疗结束（T3）四个时间点的血清。
  ③使用上述收集临床病理结果构建食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的诊断及预后预测列线图。
（2）体内动物实验方面：构建免疫完全的食管癌小鼠模型并分组，通过绘制肿瘤生长曲线、HE 染色、TUNEL 染色等方法，检测肿瘤增殖、病理变化、凋亡情况以及肿瘤免疫微环境中免疫细胞的数量和功能。
  1）建模并分组：
构建免疫完全的食管癌小鼠模型，第一皮下肿瘤作为原发肿瘤模型，第二皮下肿瘤作为转移瘤模型。
将小鼠模型进行分组：①对照组：正常饲养；②慢性应激组：空间限制性应激模型来诱导小鼠的慢性应激状态；③对照组＋6MV-X照射：④慢性应激组＋6MV-X照射
  2）结果检测：
  ①绘制第一和第二肿瘤的生长曲线检测肿瘤的增殖情况，观察放疗的敏感性及远隔效应的发生；
  ②常规HE染色检测肿瘤组织的病理变化；
  ③凋亡相关检测：TUNEL染色检测肿瘤凋亡情况，WB检测凋亡相关基因（Bcl-2、Bax等）的表达水平；
  ④检测肿瘤免疫微环境中免疫细胞的数量和功能。
  ⑤ELISA检测小鼠血清皮质醇、去甲肾上腺素（NE）、促肾上腺皮激素释放激素（CRH）等神经内分泌标志物，分析其与肿瘤体积变化的相关性。
2.通过研究揭示慢性应激主要通过ADRB2控制肿瘤细胞及肿瘤微环境，并研究ADRB2在诱导食管癌放疗抵抗中的具体作用机制（1）调控ADRB2表达，探索其的表达水平对食管癌细胞放疗敏感性的影响
  1）细胞克隆形成实验检测放疗后食管癌细胞的增殖能力的变化；
流式细胞术检测放射治疗前后食管癌细胞的细胞周期和细胞凋亡率的变化；
  2）彗星实验在单个细胞水平上检测放射治疗前后DNA损伤的变化；
  3）应用Western blot法检测凋亡相关因子的表达水平。
（2）ADRB2的表达水平对食管癌细胞增殖能力及干性的影响
  1）应用CCK-8法及BrdU法测定各组细胞的增殖活性；
  2）测各组细胞的成球能力；
  3）流式细胞术检测各组细胞中CD44＋CDI33＋阳性细胞的比例。
（3）ADRB2的表达水平与免疫微环境中巨噬细胞的募集和M2极化的影响
  1）食管癌癌细胞与巨噬细胞共培养，检测巨噬细胞迁移和侵袭能力的变化；
  2)检测巨噬细胞的表面标志物CD68及M2型巨噬细胞的表面标志物Argl。
 
3.探索临床前转化治疗，应用β-受体阻滞剂（propranolol）或ADRB2拮抗剂（ICI 118,551）和探索其在食管癌放疗增敏中的应用价值。
（1）在放疗基础上应用propranolol／ICI 118,551±免疫治疗
（2）对样本进行检测：
  ①定期检测第一原发肿瘤和第二远隔肿瘤的大小变化，绘制生长曲线；
  ②使用TUNEL染色检测肿瘤凋亡情况；
  ③免疫组化法及免疫荧光法检测ADRB2、CD68的表达水平，统计分析慢性应激评分和ADRB2与食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的相关性；收集患者的外周血，流式细胞术检测对照组与慢性应激组外周血中巨噬细胞、T细胞以及NK细胞表达谱的差异；统计分析慢性应激状态与食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的相关性。
使用ELISA检测皮质醇、去甲肾上腺素（NE）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）等神经内分泌标志物，统计分析神经内分泌标记物（皮质醇、NE和CRH等）与食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的相关性。
  ④进行血清收集：收集患者治疗前（T0）、放疗第2周（T1）、第4周（T2）、治疗结束（T3）四个时间点的血清。
  ⑤对检测结果进行统计分析，使用上述收集临床病理结果构建食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的诊断及预后预测列线图。
  食管癌是一种比较常见的恶性肿瘤，食管癌的发病率占全世界恶性肿瘤发病率的第八位，在我国，食管癌已经造成了巨大的疾病负担。放射治疗是食管癌治疗的主要技术手段，约80％的食管癌患者要接受放射治疗，而原发或继发放疗抵抗是影响治疗效果的主要障碍[1][2]。以顺铂为基础的同步放化疗是目前中晚期食管癌的治疗标准[3]。与单纯放疗相比，同步放化疗明显增加了患者的局部控制率，并能改善食管癌患者的预后，然而继顺铂之后，国内外尚无公认有效的放疗增敏剂。
  在临床中，“放疗＋免疫”模式日益成为明星组合，可介导更有效的抗肿瘤反应。新近研究发现，当肿瘤细胞受到照射时，肿瘤相关抗原释放后被抗原呈递细胞吞噬，呈递给CD8＋T 细胞产生特异性免疫应答，CD8＋T 细胞在识别并攻击原发肿瘤的同时，也识别和攻击转移肿瘤组织[4][5]，所以利用放疗联合免疫治疗，已成为食管癌临床治疗中的重要选择，可增强放疗的敏感性和远隔效应，即放射线照射原发肿瘤的同时，照射靶区之外的远处转移瘤的体积也出现缩小。
  然而，“放疗＋免疫”模式治疗过程中仍有一部分患者表现出免疫耐药与放疗抵抗。研究表明在此过程中，慢性应激可能发挥了一定的作用，可以激活炎症反应，释放的炎症因子与肿瘤细胞会相互作用。慢性应激和应激相关激素可以在白细胞循环中上调应激相关促炎症基因的表达，由此增加促炎症细胞和细胞因子的释放，激活持续性炎症反应，导致肿瘤的生成和转移。慢性应激会妨碍免疫系统做出正确的反应，无法有效地抗肿瘤。慢性应激可以选择性地抑制Th1细细胞诱导的细胞免疫反应和IFN-γ的产生，监视功能，使肿瘤细胞逃避免疫攻击，导致免疫治疗抵抗[6]。
  食管癌是一种典型的慢性应激性、炎症相关性肿瘤，慢性炎症的持续刺激与肿瘤的发生、发展密切相关 [7]。慢性应激主要由下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴和交感神经系统介导的生物过程，肾上腺皮质轴和交感神经系统的激活导致神经递质和去甲肾上腺素、肾上腺素糖皮质激素等激素的释放，增加了免疫系统暴露于高激素水平的风险，并且导致机体炎症因子的紊乱，引起一系列循环、代谢、免疫甚至基因表达的变化[8]。在肿瘤的炎症微环境中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是其主要作用的炎症细胞之一[9]。在不同的刺激因素作用下，其可以向经典的“抗肿瘤”表型（M1 型）或“促肿瘤”表型（M2 型）极化。M1型巨噬细胞可诱导 Th1 反应，发挥抗肿瘤免疫；而 M2 型巨噬细胞参与调节性 T 细胞、Th2 细胞等的招募，抑制 Th1 反应，导致免疫抑制，促进肿瘤免疫逃逸[10]，可能与患者的预后不良相关[11]。
  基于以上研究申请人假设，应用β-受体阻滞剂（propranolol）或ADRB2拮抗剂（ICI 118,551）阻断β受体，抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的过度激活，进而抑制M2型巨噬细胞极化，从而实现靶向巨噬细胞治疗食管癌策略。

参考文献：
[1]Deng W, Lin SH. Advances in radiotherapy for esophageal cancer. Ann Transl Med. 2018 Feb;6(4):79.
[2]Mao C, Zeng X, Zhang C, Yang Y, Xiao X, Luan S, et al. Mechanisms of Pharmaceutical Therapy and Drug Resistance in Esophageal Cancer. Front Cell Dev Biol. 2021 Feb 11;9:612451.
[3]Nakamura K, Kato K, Igaki H, Ito Y, Mizusawa J, Ando N, et al. Three-arm phase III trial comparing cisplatin plus 5-FU (CF) versus docetaxel, cisplatin plus 5-FU (DCF) versus radiotherapy with CF (CF-RT) as preoperative therapy for locally advanced esophageal cancer (JCOG1109, NExT study). Jpn J Clin Oncol. 2013 Jul;43(7):752-5.
[4]Burnette BC, Liang H, Lee Y, Chlewicki L, Khodarev NN, Weichselbaum RR, et al. The efficacy of radiotherapy relies upon induction of type i interferon-dependent innate and adaptive immunity. Cancer Res 2011, 71(7): 2488-2496.
[5]Chen J, Cao Y, Markelc B, Kaeppler J, Vermeer JA, Muschel RJ. Type I IFN protects cancer cells from CD8+ T cell-mediated cytotoxicity after radiation. J Clin Invest 2019, 129(10): 4224-4238.
[6]Liu Y, Tian S, Ning B, Huang T, Li Y, Wei Y. Stress and cancer: The mechanisms of immune dysregulation and management. Front Immunol. 2022 Oct 5;13:1032294.
[7]Maghsudlu M, Farashahi Yazd E. Heat-induced inflammation and its role in esophageal cancer. J Dig Dis. 2017 Aug;18(8):431-444.
[8]Zhang Y,Zanos P,Jackson IL, Zhang X, Zhu X, Gould T, et al. Psychological stress enhances tumor growth and diminishes radiation response in preclinical model of lung cancer. Radiother Oncol 2020,146:126-135.
[9]Capece D, Fischietti M, Verzella D, et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: a pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Res Int, 2013;2013:187204.
[10]Cassetta Luca, Fragkogianni Stamatina, Sims Andrew H, et al. Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets. Cancer Cell, 2019,35(4): 588-602.
[11]Yeung Oscar W H, Lo Chung-Mau, Ling Chang-Chun, et al. Alternatively activated (M2) macrophages promote tumour growth and invasiveness in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology, 2015, 62(3): 607-616.
1.创新点：
全新研究视角：传统食管癌的治疗研究多聚焦于肿瘤细胞本身的生物学特性，如通过手术切除肿瘤实体、化疗药物直接杀伤癌细胞、放疗破坏肿瘤细胞DNA等，较少考虑机体整体状态和神经内分泌系统对肿瘤微环境的影响。而本研究创新性地从慢性应激这一全身性因素出发，将慢性应激与食管癌联系起来，揭示交感神经系统激活后，所释放的神经递质会通过ADRB2受体，对肿瘤微环境和肿瘤细胞产生作用。同时慢性应激所致β受体活化，可导致放疗敏感性及免疫远隔效应下降。因此，慢性应激有可能影响食管癌“放疗＋免疫”治疗的疗效。本研究在不影响食管癌治疗的前提下，应用β-受体阻滞剂（propranolol）或ADRB2拮抗剂（ICI 118,551）阻断β受体，实现对慢性应激导致的免疫抑制微环境的早期干预，进而改善患者的临床治疗效果，尚未见此报道，创新性较强。
2.项目特色：
（1） 临床与基础紧密结合：“放疗＋免疫”模式日益成为主流治疗模式，尤其是针对晚期癌症患者。本项目基于临床中的免疫联合放疗抵抗的实际问题，即慢性应激可能降低食管癌“放疗＋免疫”疗效，开展基础研究。同时，研究成果又能迅速反馈到临床实践，通过临床试验验证基础研究结论，形成从临床到基础再回到临床的良性循环，具有很强的实用性和转化价值。
（2）模拟真实临床情境：本项目充分考虑慢性应激在癌症患者日常生活中的普遍性，采用更贴近患者实际情况的动物模型和实验设计。模拟长期慢性应激状态下食管癌的发生发展以及对免疫联合放疗的反应，使研究结果更具临床指导意义。
（3）临床数据的多元整合：收集大量食管癌患者临床资料，包括统计CESD抑郁量表评分、流行病学研究中心的压力知觉量表PSS评分 ，免疫组化法及免疫荧光法ADRB2、CD68的表达水平、流式细胞术检测对照组与慢性应激组外周血中巨噬细胞、T细胞以及NK细胞表达谱的差异等统计分析慢性应激状态与食管癌放疗联合免疫治疗的敏感性及预后的相关性，通过整合分析，全面掌握慢性应激对免疫联合放疗疗效的影响，为临床决策提供丰富且真实的依据。
1.技术路线
（1）技术路线一：ADRB2调控肿瘤细胞及肿瘤微环境的体外研究
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（2）技术路线二：ADRB2参与免疫调控的体内研究
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（3）技术路线三：β-受体阻滞剂propranolol或ADRB2 拮抗剂ICI 118,551在食管癌放疗增敏中的研究summernote-img

2.拟解决的问题：拟解决的问题
（1）慢性应激对食管癌放疗抵抗及免疫远隔效应的影响机制
本项目旨在深入研究慢性应激如何通过ADRB2调控肿瘤细胞及肿瘤微环境，抑制食管癌放疗的敏感性及远隔效应。通过体内外实验，揭示慢性应激诱导食管癌放疗抵抗的具体分子机制，为后续的治疗策略提供理论基础。
ADRB2联合患者临床病理特征可作为食管癌放疗联合免疫治疗疗效的动态预测模型及治疗增敏新靶点的科学假说的验证
（2）项目将验证ADRB2联合患者临床病理特征是否可作为食管癌放疗联合免疫治疗疗效的动态预测模型及治疗增敏新靶点的科学假说。通过检测ADRB2在食管癌组织中的表达水平与患者预后的关系，以及在体内外实验中调控ADRB2表达对食管癌细胞放疗敏感性的影响，为临床应用提供科学依据。
（3）β-受体阻滞剂或ADRB2拮抗剂在食管癌放疗增敏中的应用探索
β-受体阻滞剂（propranolol）或ADRB2拮抗剂（ICI 118,551）在食管癌放疗增敏中的应用价值，验证其是否能够增加放疗敏感性，并与免疫治疗联用产生协同作用。为临床提供新的治疗手段，改善食管癌患者的预后。
3.预期成果
（1）理论成果
阐明慢性应激通过ADRB2调控食管癌放疗抵抗的分子机制：明确慢性应激如何通过ADRB2影响食管癌细胞的放疗敏感性、增殖能力和干性，以及对免疫微环境中巨噬细胞募集和M2极化的作用，为食管癌的精准治疗提供新的理论支持。
验证ADRB2联合患者临床病理特征可作为食管癌放疗联合免疫治疗疗效的动态预测模型及治疗增敏新靶点的可行性：通过临床样本检测和体内外实验验证，确定ADRB2在食管癌放疗联合免疫治疗中的价值，为临床筛选患者和制定个性化治疗方案提供依据。
（2）方法学成果
建立基于ADRB2+临床病理特征的放疗抵抗预测模型及预后模型2套（AUC≥0.70）。为提高放疗联合免疫治疗的疗效提供新的方法，促进肿瘤个体化治疗发展。
优化食管癌放疗增敏的治疗方案：通过探索β-受体阻滞剂或ADRB2拮抗剂与放疗、免疫治疗的联合应用，提出更有效的食管癌治疗策略，提高治疗效果。
（3）人才培养与团队建设
培养高素质科研人才：通过项目的实施，培养研究生2名，提高团队成员的科研能力和专业素养，为医学科研领域输送新鲜血液。
打造基础与临床相结合的创新团队：引进1名具有较高水平的研究人员，加强基础研究与临床应用的结合，形成一支具有创新能力和实践经验的专业技术团队，为后续的研究工作奠定坚实的基础。
（4）社会与经济效益
提高食管癌治疗效果，改善患者生活质量：为食管癌患者提供新的有效治疗手段，延长生存期，减轻因疾病带来的痛苦，提高生活质量。
减轻社会经济负担：通过优化治疗方案，减少不必要的治疗和医疗资源的浪费，降低医疗成本，具有重大的社会效益和可观的经济效益。 
本项目计划于2024年1月启动，至2026年1月完成，为期两年。具体研究进度安排如下： 
 1.第一阶段：项目启动与准备（2024年1月）
（1）项目团队组建：组建包括项目负责人、研发人员、临床医生、实验技术人员等在内的项目团队，明确各成员的职责和任务。
（2）实验材料准备：准备实验所需的小鼠模型、细胞系、试剂、仪器设备等，确保实验的顺利进行。
（3）临床病例收集准备：与合作单位济宁市第一人民医院协作，制定临床病例收集方案，确定纳入标准和排除标准，准备病例收集所需的工具和表格。
2.第二阶段：慢性应激对食管癌放疗抵抗及机制研究（2024年1月-2024年12月）
（1） 体内动物实验：构建免疫完全的食管癌小鼠模型，分为对照组、慢性应激组、对照组+6MV-X照射、慢性应激组+6MV-X照射。观察各组小鼠肿瘤的生长情况，绘制生长曲线，检测肿瘤组织的病理变化、凋亡情况及相关基因表达水平。
（2）体外细胞实验： 通过细胞克隆形成实验、CCK-8法、BrdU法等检测放疗后食管癌细胞的增殖能力、细胞周期和细胞凋亡率的变化，以及DNA损伤和凋亡相关因子的表达水平。研究ADRB2表达水平对食管癌细胞放疗敏感性、增殖能力和干性的影响。将食管癌细胞与巨噬细胞共培养，检测巨噬细胞迁移和侵袭能力的变化，以及表面标志物CD68和M2型巨噬细胞表面标志物Argl的表达情况，探讨ADRB2表达水平对免疫微环境中巨噬细胞募集和M2极化的影响。
（3）临床病例收集与分析：收集免疫联合放疗的食管癌临床病例，检测ADRB2表达、流式检测免疫细胞组成、巨噬细胞M2募集、ELISA检测血清皮质醇、去甲肾上腺素（NE）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）等神经内分泌标志物等，分析ADRB2表达及其他临床病理指标与免疫微环境及患者预后的关系，构建诊断预测模型。
3.第三阶段：β-受体阻滞剂或ADRB2拮抗剂在食管癌放疗增敏中的应用研究（2025年1月-2025年8月）
（1）小鼠成瘤实验：在放疗基础上应用β-受体阻滞剂propranolol或ADRB2拮抗剂ICI 118,551同时处理小鼠，绘制生长曲线。检测ADRB2及凋亡相关因子的表达水平，收集原发及远隔肿瘤组织，检测肿瘤组织中浸润的免疫细胞表达谱的变化。收集外周血，通过流式细胞术检测免疫细胞表达谱的变化。
（2）继续收集免疫联合放疗的食管癌临床病例，检测ADRB2表达、流式检测免疫细胞组成、巨噬细胞M2募集等，分析ADRB2表达与免疫微环境及患者预后的关系，构建预后预测模型。
4.第四阶段：项目总结与结题（2025年8月-2025年12月）
（1）数据整理与分析：对实验数据和临床病例数据进行全面的整理和深入的分析，确保数据的准确性和可靠性。建立基于ADRB2+临床病理特征的放疗抵抗预测模型及预后模型2套（AUC≥0.70）。
（2）论文撰写与发表：撰写高水平的研究论文，总结项目的研究成果和创新点，发表在相关领域的权威期刊上，计划发表SCI论文1篇。
（3）项目结题验收：按照项目申报书的要求，准备结题验收材料，包括研究报告、实验数据、论文发表情况、人才培养情况等，接受济宁市科学技术局的结题验收。
（4） 后续研究规划：在本项目研究的基础上，进一步拓展研究方向，规划后续的研究工作，申请省级及以上课题，继续深入探索食管癌的综合治疗策略，为提高食管癌患者的生存率和生活质量做出更大的贡献。
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
（1）ADRB2高表达与食管癌患者的预后密切相关
我们首先应用免疫组织化学方法，检测了肾上腺素受体ADRB2在接受同步放疗的食管癌组织中的表达水平。生存分析结果表明：ADRB2高表达与食管癌患者的预后密切相关（P＜0.05），ADRB2高表达的患者预后欠佳（工作基础，图1A）；分析了TCGA数据库中ADRB2在不同瘤种中的表达情况，发现ADRB2高表达提示多种肿瘤的不良预后（工作基础，图1B）。

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图1. ADRB2表达与患者预后不良有关。（A）ADRB2高表达与食管癌患者的预后密切相关；（B）TCGA数据库中ADRB2在不同瘤种中的表达与不良预后的关系。
（2）慢性应激组患者的肿瘤组织中ADRB2表达明显增高
  考虑到慢性应激的诊断需要同时满足持续压力和情绪障碍两个维度，我们对食管癌患者进行了CESD抑郁量表评分和压力知觉量表评分（PSS-14）。抑郁量表评分大于20且压力知觉量表大于43分的划分到慢性应激患者组。以下为CESD抑郁量表评分和PSS-14的评分标准。

1）CESD抑郁量表评分评分标准：
1．共20题，反应过去一周来计算；
2．每项不足1天的为0分；有1-2天的为1分；有3-4天的为2分；有5-7天为3分。
3．将20题得分相加，总分范围0~60分，＜15分无抑郁症状；10-15分可能有抑郁症状；20分以上有抑郁症状。

表1 CESD抑郁量表评分评分
总分范围 抑郁水平 说明
0-15分 无显著抑郁症状 情绪状态正常，无需干预
16-21分 轻度抑郁倾向 轻微抑郁体验，建议关注情绪变化
22-29分 中度抑郁症状 需寻求心理咨询或专业评估
≥30分 重度抑郁症状 强烈建议立即就医，可能需药物/心理干预

2）PSS评分标准：
  PSS由心理学家Cohen、Kamarck和Mermelstein于1983年编制，用于评估个体主观感知的心理压力水平，PSS是评估主观压力的“黄金标准”工具，其简明性、跨文化适用性支持了全球广泛应用。量表由14个项目组成，统计量表的总得分，得分越高说明被试的心理压力越明显。计算分值的方法为:“从不”记1分、“偶尔”记2分、“有时”记3分、“时常”记4分、“总是”记5分，最后的总分范围是在14分-70分之间。

表2 PSS-14 量表总分与压力水平关系
总分范围 压力水平 说明
14-28分 低压力 生活掌控感强，偶发事件不易引发焦虑
29-42分 中等压力 压力与兴奋平衡，需关注放松训练
43-56分 高压力 可能影响身心健康，建议主动干预
57-70分 极高压力 伴随显著身心症状，需专业心理支持

3）为了深入研究慢性应激对食管癌肿瘤微环境的影响，选取4例食管癌患者的肿瘤新鲜组织标本进行单细胞测序（选取2例患者，满足CESD≥20分且PSS-14≥43，为慢性应激组；2例满足CESD＜20分且PSS-14＜43，为非慢性应激组），结果提示：慢性应激组患者的肿瘤组织中ADRB2表达明显增高，肿瘤细胞呈现更加明显的干性特征；在免疫微环境方面，慢性应激组，M2型巨噬细胞明显增多，导致巨噬细胞的募集和M2极化，而T细胞的功能受到了抑制（工作基础，图2）。上述研究结果初步证实：慢性应激状态可通过ADRB2增强肿瘤细胞的干性并诱导免疫抑制微环境。

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图2. 慢性应激状态上调ADRB2表达，增强肿瘤细胞的干性，诱导免疫抑制微环境改变。
（3）ADRB2促进食管癌干性
设计针对ADRB2的小干扰RNA，转染食管癌细胞Eca-109，记为siADRB2-1和siADRB2-2，qPCR检测干性相关指标，发现下调ADRB2后，Oct4、SOX2和OV6表达显著下降，抑制了细胞的干性

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图3. qPCR检测不同ADRB2水平Eca-109细胞中Oct4、SOX2和OV6的mRNA水平 
  项目申请人及团队主要成员已了解项目研究的核心内容，指导老师具备丰富的相关医学知识，在恶性肿瘤的临床与基础研究方面积累了丰富经验，能够熟练掌握和运用本项目所需的关键技术和方法。
  已开展了 ADRB2 表达水平检测、患者抑郁量表评分及单细胞测序等前期实验，为后续研究提供了数据支持和研究方向。
项目承担单位济宁医学院附属医院是山东省区域医疗中心，综合实力强，在医疗、科研等方面资源丰富；合作单位济宁市第一    人民医院是百年名院，医疗资源和临床病例资源充足，能为项目提供临床病例资料等支持。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 实验相关费用 9050.00 10950.00
1. 业务费 6000.00 用于本实验业务费用 2050.00 3950.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 软件使用费、数据分析服务费等 1000.00 1000.00
（2）能源动力费 500.00 实验室的电力、水、气等能源消耗费用 300.00 200.00
（3）会议、差旅费 500.00 进行实地调研的交通、住宿和会议注册费用 250.00 250.00
（4）文献检索费 1000.00 获取相关研究文献、数据库订阅费用等 500.00 500.00
（5）论文出版费 2000.00 期刊版面费、开放获取费用等 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 6000.00 实验室设备、检测仪器等 3000.00 3000.00
3. 实验装置试制费 6000.00 设计和制作实验所需的特殊装置或原型设备 3000.00 3000.00
4. 材料费 2000.00 购买实验所需的材料 1000.00 1000.00
结束

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