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研究 18β-甘草次酸通过调节 PPAR-γ/NF-κB 信号通路治疗溃疡性结肠炎的作用和潜在机制

申报人：祝爱景 申报日期：2025-03-27

基本情况

2025创新项目
研究 18β-甘草次酸通过调节 PPAR-γ/NF-κB 信号通路治疗溃疡性结肠炎的作用和潜在机制 学生申报
创新训练项目
医学
药学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
立项依据：溃疡性结肠炎（UC）是难治愈，易复发的慢性非特异性肠道炎症疾病，现有药物治疗费用高且有副作用，需要更有效安全的药物。甘草提取物及其主要活性三萜皂苷成分18β-甘草次酸（18β-GA）具有抗肿瘤，抗病毒，消炎等作用。本课题组拟研究18β-GA对DSS诱导的UC的治疗作用并探讨其靶点及机制，为治疗UC和18β-GA的应用提供思路。设计思路：通过动物和细胞实验进行药效研究，通过网络药理学和分子对接预测18β-GA治疗UC的靶点并进行“菌群重塑-炎症抑制-上皮再生”多层次、多水平的机制研究。实验思路与试验方法：1.药效研究。构建DSS诱导UC模型，检测18β-GA对DAI评分、组织病理损伤程度、炎症细胞浸润程度的缓解作用，通过透射电镜观察肠道屏障损伤程度。2.菌群调控。使用16S rDNA测序检测药物对肠道菌群的调控作用，关联菌群-炎症互作机制。3.建立小鼠腹腔巨噬细胞与结肠上皮细胞共培养体系，通过划痕实验监测药物对结肠上皮细胞愈合的作用。4.机制探索。结合网络药理学和分子对接预测药物靶点，并采用Western blot和凝胶迁移等对靶点蛋白进行验证，揭示“抗炎-屏障修复”协同效应。
1.第九届全国大学生生命科学竞赛（科学探究类），国家一等奖，主持
2.山东省大学生生物学大赛，省级一等奖，主持
3.第十八届“挑战杯”建设银行山东省大学生课外学术科技作品竞赛，省级二等奖，参与
4.第十二届山东省大学生生物化学技能与创新创业大赛，省级三等奖，参与
5.2023年大学生创新训练计划项目（cx2023007z），校级立项1项，参与
6.第十八届“挑战杯”济宁医学院大学生课外学术科技作品竞赛，校级一等奖和三等奖，参与
7.第十届山东省大学生科技创新大赛，校级一等奖和二等奖，参与
8.第八届大学生基础医学创新实验大赛，校级三等奖2项，参与
9.2024年中国国际大学生创新大赛，校级二等奖，参与
1.主持国家自然科学基金青年项目1项。
2.主持省自然科学基金项目1项
3.主持厅级课题1项。
3.主持校级课题5项。
4.指导国家级大学生创新训练计划项目2项。
5.指导省级大学生创新训练计划项目3项。
1.项目设计与思路指导：老师对本小组实验小组人员进行了合理的分工，对实验进度做出了合理的安排，并督促我们在规定的时间内完成相应的任务，而且老师为该实验提供了思路和技术上的指导，提出合理的方案和建议，使本项目更具有可靠性和指导性。
2.科研设备、经费和平台支持：依托指导教师负责的济宁医学院药理学重点实验室，指导教师为本项目的前期结果的实施提供了科研设备、实验经费和技术平台支撑，解决了项目所需的核心实验条件。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
祝爱景 临床医学院（附属医院） 临床医学（超声医学方向） 2022 实验实施、论文撰写
陈明卿 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 文献查询、协助论文撰写
亢振彤 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 数据整理
万雨桐 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 文献查询、协助论文撰写
刘林艳 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 实验实施、论文撰写

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
姚静 基础医学院 否

立项依据

本项目旨在系统解析甘草次酸（18β-Glycyrrhetinic Acid, 18β-GA）治疗溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）的作用及其机制，并探索其临床转化潜力。通过整合“菌群重塑-炎症调控-上皮修复”的研究框架，结合肠道菌群检测技术与功能验证实验，阐明18β-GA改善UC的作用及其机制，为天然产物的精准治疗策略提供理论依据。具体研究目标如下：
1. 明确18β-GA对DSS诱导小鼠UC模型的治疗作用
通过构建DSS诱导的UC小鼠模型，检测18β-GA对疾病活动指数（disease activity index, DAI）、结肠组织病理损伤、炎症细胞浸润程度、炎症因子分泌水平（如TNF-α、IL-6）的影响，系统揭示其缓解结肠炎症、修复黏膜屏障的疗效，为后续机制探索奠定表型基础。
2. 解析肠道菌群在18β-GA治疗中的作用
基于16S rDNA测序技术，分析不同干预组小鼠肠道菌群的α/β多样性变化，筛选与炎症缓解相关的关键菌属，并通过菌群-炎症指标关联分析，阐明其通过“菌群-宿主互作”调控炎症微环境的潜在路径，拓展菌群靶向治疗的理论依据。
3. 筛选药物-疾病共同靶点并优化用药策略
整合网络药理学与分子对接技术构建“药物-靶点-疾病”交互网络，挖掘18β-GA与UC的核心交集靶点，预测其多靶点协同的分子机制，为精准用药提供分子依据，并结合剂量效应实验指导临床用法用量优化。
4. 验证关键靶点的调控机制
采用免疫荧光、qPCR、Western blot等技术，在动物结肠组织中验证18β-GA对NF-κB信号通路活化调控作用。同时建立腹膜巨噬细胞（Peritoneal Macrophages, PMs）-结肠上皮细胞（Mouse colonic epithelial cells, MCECs）共培养炎症模型，在细胞水平上验证可能靶点蛋白的表达情况。
5. 探究18β-GA对肠上皮细胞迁移的调控作用
在动物模型结肠组织内检测药物对紧密连接蛋白（occludin）和胞质紧密粘连蛋白 1（zonula occludens-1, ZO-1）的蛋白表达情况。
建立PMs与MCECs共培养炎症模型，模拟体内炎症微环境，通过划痕实验检测18β-GA促进上皮修复的作用，并检测紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达。
6. 拓展临床应用潜力与治疗策略
基于18β-GA调控“菌群重塑-炎症调控-上皮修复”作用特征，探索其对肠道炎症等同机制疾病的干预潜力，并设计“药物-益生菌”联合治疗方案，开发联合用药方案或新型递送系统，推动老药新用与个体化治疗策略的临床转化。
1.通过体内模型研究18β-GA对UC的治疗作用
利用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型，给予18β-GA治疗观察不同组别小鼠的生存状态、体重变化、毛发状态以及粪便性状并记录；实验结束，解剖并摘取重要脏器以及结肠组织，称取脏器重量，测量结肠长度；计算各组小鼠的DAI评分；通过苏木精−伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色对结肠组织进行病理学评分；通过对小鼠的重要脏器（心、肝、肺、肾、脾）进行H&E染色，探究18β-GA的安全性；利用过碘酸雪夫（Periodic Acid-Schiff, PAS）染色观察杯状细胞中黏蛋白颗粒的表达情况；利用免疫蛋白印迹法（Western blot, WB）研究18β-GA对炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达的影响。
2. 检测肠道微生物在18β-GA治疗中的作用
采用高通量16S rDNA测序分析肠道微生物丰富度和多样性，分析不同干预组小鼠肠道菌群的α/β多样性变化，筛选与炎症缓解相关的关键菌属，研究18β-GA对肠道菌群的影响，并通过菌群-炎症指标关联分析。
3.预测18β-GA治疗UC的靶点和通路
利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）、中医药百科全书数据库（Encyclopaedia Of Traditional Chinese Medicine, ETCM）、Swiss Target Prediction 等数据库获得18β-GA相关靶点；利用人类基因数据库（Gencards）、在线人类孟德尔遗传数据库（Online MendelianInheritance In Man, OMIM）等数据库获得UC的相关靶点，通过Venny2.1 筛选出交集靶点，即18β-GA发挥治疗UC作用的可能靶点。进行GO/KEGG通路富集分析，并对核心靶点进行分子对接，预测18β-GA与核心靶点的结合模式和亲和力。
4.通过体内外实验，验证18β-GA治疗溃疡性结肠炎的靶点和通路
如前所述，利用动物模型和细胞实验模型，采用WB、免疫组化（immunohistochemistry, IHC）、免疫荧光（immunofluorescence, IF）等分子生物学技术，研究18β-GA对通路蛋白表达的影响，对网络药理学预测的可能靶点进行验证；采用凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assays, EMSA），检测药物对蛋白与DNA的结合能力的影响，探究18β-GA治疗UC的机制。
5.利用siRNA或者质粒转染技术，进一步验证药物作用的靶点蛋白和作用通路
设计靶点特异性siRNA或构建靶点蛋白过表达质粒，转染细胞后加入18β-GA处理，通过Western blot和qPCR验证靶点蛋白表达变化及对炎症和细胞迁移的影响，同时检测关键信号通路蛋白（如NF-κB、PPAR-γ）的表达和磷酸化水平，使用通路抑制剂或激动剂验证通路参与情况。
6.通过构建PMs-MCECs共培养体系，研究18β-GA对肠道上皮细胞愈合的促进作用
在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中提取PMs，构建PMs和MCECs共培养体系模拟体内炎症环境，进行细胞划痕实验，计算迁移率，检测18β-GA对MCECs迁移的影响。利用WB实验检测occludin和ZO-1的表达，明确18β-GA对肠道上皮愈合能力作用。
UC是一种迄今为止病因不明的慢性非特异性肠道炎症疾病，临床主要表现为反复发作腹痛、腹泻、黏液脓血便等，属炎症性型肠病（Inflammatory bowel disease, IBD）的一种。UC好发于乙状结肠和直肠，严重者可引起全结肠甚至回肠末端病变。UC主要表现于结肠粘膜和粘膜下层，甚至整个结肠的持续性、融合性炎症反应，且发病过程中以复发与缓解交替为病变特点[1, 2]，在全球的发病率不断上升[3]。本病病情发展较复杂，具有难治愈，易复发的特点，会严重影响患者的正常工作和生活，被WHO列为难治疾病之一，且被认为与结肠癌的发病相关。UC的发病机制是多因素的，涉及免疫系统失调、上皮屏障缺陷、肠道微生物组、遗传因素、饮食因素、和环境因素等[3]。由于病因不明、复发风险高、预后不佳，UC已逐渐成为临床治疗的一个重要问题[4]。目前，5-氨基水杨酸、皮质类固醇激素、硫嘌呤、生物制剂药物和抗细胞因子疗法是治疗 UC 的主要药物疗法[5-8]。然而，由于药物治疗费用高昂且存在负面影响，长期使用受到限制。因此，迫切需要发现更有效、更安全的治疗药物。
PPARγ是一种依赖配体的转录因子，是核受体超家族的成员。作为激素、维生素、内源性代谢物和外源化合物的传感器，核受体控制着大量基因的表达。PPARγ调节脂肪细胞分化、脂肪酸储存和葡萄糖代谢，是抗糖尿病药物的靶点[9, 10]。最近，人们认识到PPARγ通过抑制炎症细胞因子的表达和指导免疫细胞向抗炎表型分化的能力，在免疫反应中起着至关重要的作用。PPARγ的一个特点是其配体的结构多样性，包括内源性代谢物、膳食化合物和合成药物。炎症和过敏性疾病的高发病率和不断增加的发病率，加上最近临床试验的令人鼓舞的结果，表明食物中发现的天然PPARγ激动剂可能作为抗炎分子对人类健康有益。因此，PPARγ不仅是制药工业的目标，而且对食品工业也有很大的潜在兴趣，因为它是由几种天然膳食成分激活的。在过去几年中，饮食干预炎症性疾病的前景有所改善。经典的激素激活受体，如雌激素受体，位于细胞质中，与激活配体结合后易位到细胞核中，而PPARγ受体则位于细胞核中，与DNA应答元件结合[11]。PPARγ受体的核位置是典型的代谢物激活核受体。PPARγ受体有三种形式：α、β / δ和γ[12]。在炎症过程中，PPARγ通过拮抗其他转录因子如NF-κB和AP-1家族成员的活性，以配体依赖的方式直接负调控促炎基因的表达[13]。PPARγ是一种核受体，最近被认为对抑制肠道炎症反应和保护细胞免受氧化损伤很重要。
核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是与多种细胞炎症和免疫反应相关的重要转录因子，被认为是治疗各种疾病的关键靶点[14]。在炎症、先天免疫和组织完整性的调节中起着关键作用。正常情况下，NF-κB及NF-κB的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB, IκB）以惰性状态储存在细胞质中。内外源刺激下，NF-κB激活信号可诱导IκB磷酸化而泛素化。当机体或细胞受到外界刺激后，NF-κB结合的IκB被IκB激酶（Inhibitor of Kappa B Kinase, IKK）复合物磷酸化，磷酸化后发生泛素化，泛素化的IκB分子构象发生改变，迅速被蛋白酶体识别和降解，IκB的降解导致NF-κB易位至细胞核[15]并介导调节下游靶基因的转录。NF-κB进入细胞核诱导促炎细胞因子、粘附分子和趋化因子的释放，如iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β等，这些都与结肠炎的发病有关[16]。我们的研究结果表明，在DSS诱导的UC大鼠中，18β-GA处理通过抑制IκB-α磷酸化有效地抑制了NF-κB的活化。
甘草中国传统医学中最常用的草药之一，素有国老之称，有温中益气，清热解毒，调和诸药，解毒等功效。甘草性味甘、平，主要治疗咽喉肿痛，消化性溃疡以及食物中毒等。GR具有多种生物活性成分，包括皂苷、类黄酮、香豆素saponins, flavonoids, and coumarins等[17]，现代研究表明，甘草提取物具有抗肿瘤[18, 19]、抗微生物[20, 21]、抗病毒[22, 23]、抗炎[24, 25]、免疫调节[26]和神经保护作用[27]。GR含有20多种三萜和近300种黄酮类化合物。18β-GA是在甘草中发现的一种三萜皂苷，是甘草酸的水解代谢产物。18β-GA具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节特性[17]。
尽管如此，18β-GA对实验诱导的UC的作用及潜在机制尚不清楚。因此我们使用DSS诱导的UC小鼠模型和细胞共培养体系进行药效研究，通过网络药理学和分子对接实验预测其作用靶点，并通过细胞转染技术、WB等实验进行验证，为在临床上使用18β-GA治疗UC提供了实验和理论基础。
参考文献
[1] LI C, WANG J, MA R, et al. Natural-derived alkaloids exhibit great potential in the treatment of ulcerative colitis [J]. Pharmacological Research, 2022, 175.
[2] ENDO K, SATOH T, YOSHINO Y, et al. A case of relapsed pan-colonic ulcerative colitis accompanied with gastroduodenal lesions immediately after COVID-19 [J]. Clinical Journal of Gastroenterology, 2025, 18(3): 399-407.
[3] PARK J, CHEON J H. Incidence and Prevalence of Inflammatory Bowel Disease across Asia [J]. Yonsei Medical Journal, 2021, 62(2).
[4] TANG B, ZHU J, FANG S, et al. Pharmacological inhibition of MELK restricts ferroptosis and the inflammatory response in colitis and colitis-propelled carcinogenesis [J]. Free Radical Biology and Medicine, 2021, 172: 312-29.
[5] LE BERRE C, RODA G, NEDELJKOVIC PROTIC M, et al. Modern use of 5-aminosalicylic acid compounds for ulcerative colitis [J]. Expert Opinion on Biological Therapy, 2019, 20(4): 363-78.
[6] KISZKA-KANOWITZ M, THEEDE K, THOMSEN S B, et al. Low-dose azathioprine and allopurinol versus azathioprine monotherapy in patients with ulcerative colitis (AAUC): An investigator-initiated, open, multicenter, parallel-arm, randomised controlled trial [J]. eClinicalMedicine, 2022, 45.
[7] POTDAR A A, DUBE S, NAITO T, et al. Altered Intestinal ACE2 Levels Are Associated With Inflammation, Severe Disease, and Response to Anti-Cytokine Therapy in Inflammatory Bowel Disease [J]. Gastroenterology, 2021, 160(3): 809-22.e7.
[8] MAGRO F, CORDEIRO G, DIAS A M, ESTEVINHO M M. Inflammatory Bowel Disease – Non-biological treatment [J]. Pharmacological Research, 2020, 160.
[9] PORCUNA J, MíNGUEZ-MARTíNEZ J, RICOTE M. The PPARα and PPARγ Epigenetic Landscape in Cancer and Immune and Metabolic Disorders [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(19).
[10] KOUNATIDIS D, VALLIANOU N G, REBELOS E, et al. The Many Facets of PPAR-γ Agonism in Obesity and Associated Comorbidities: Benefits, Risks, Challenges, and Future Directions [J]. Current Obesity Reports, 2025, 14(1).
[11] LI Y, YAN F, XIANG J, et al. Identification and experimental validation of immune-related gene PPARG is involved in ulcerative colitis [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 2024, 1870(7).
[12] LI J H, XU J, HU J X, et al. PPARγ/β/δ Agonists Can Ameliorate Dextran Sodium Sulfate–Induced Colitis and Modulate Gut Microbiota [J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2025, 40(6): 1536-47.
[13] LIU C, ZENG H, OUYANG J, et al. Eurotium-Cristatum fermented black tea alleviates ulcerative colitis through the PPARγ-NF-κB signaling axis [J]. Food Research International, 2025, 200.
[14] ZANG R, LIU Z, WU H, et al. Candida utilis Ameliorates Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis in Mice via NF-κB/MAPK Suppression and Gut Microbiota Modulation [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2025, 26(5).
[15] CHENG S, CHEN W, GUO Z, et al. Paeonol alleviates ulcerative colitis by modulating PPAR-γ and nuclear factor-κB activation [J]. Scientific Reports, 2024, 14(1).
[16] DEKA A, KUMAR N, BASU S, et al. Non-canonical NF-κB signaling limits the tolerogenic β-catenin-Raldh2 axis in gut dendritic cells to exacerbate intestinal pathologies [J]. The EMBO Journal, 2024, 43(18): 3895-915.
[17] Exploring the molecular mechanism of source aging albany ny so 2023 [J].
[18] MANSO J, CENSI S, PEDRON M C, et al. Anti-Proliferative and Anti-Migratory Activity of Licorice Extract and Glycyrrhetinic Acid on Papillary Thyroid Cancer Cell Cultures [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2024, 25(19).
[19] WANG L, LI Q, LEUNG L K, WONG W T. Licorice Extract Isoliquiritigenin Increased Cytosol Calcium and Induced Apoptosis in Colon Cancer Cells via Transient Receptor Potential Vanilloid‐1 [J]. Cancer Medicine, 2025, 14(5).
[20] 甘草提取物的抑菌作用及其对小鼠免疫功能的影响 [J].
[21] VAN DINTEREN S, MEIJERINK J, WITKAMP R, et al. Valorisation of liquorice (Glycyrrhiza) roots: antimicrobial activity and cytotoxicity of prenylated (iso)flavonoids and chalcones from liquorice spent (G. glabra, G. inflata, and G. uralensis) [J]. Food & Function, 2022, 13(23): 12105-20.
[22] KIM J H, PARK Y-I, HUR M, et al. Inhibition by components ofGlycyrrhiza uralensisof 3CLpro and HCoV-OC43 proliferation [J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2023, 38(1).
[23] ADIANTI M, AOKI C, KOMOTO M, et al. Anti‐hepatitis C virus compounds obtained from Glycyrrhiza uralensis and other Glycyrrhiza species [J]. Microbiology and Immunology, 2014, 58(3): 180-7.
[24] LIU J, XU Y, YAN M, et al. 18β-Glycyrrhetinic acid suppresses allergic airway inflammation through NF-κB and Nrf2/HO-1 signaling pathways in asthma mice [J]. Scientific Reports, 2022, 12(1).
[25] ZHAO L, CHEN X, SHAO X, et al. Prenylated phenolic compounds from licorice (Glycyrrhiza uralensis) and their anti-inflammatory activity against osteoarthritis [J]. Food & Function, 2022, 13(2): 795-805.
[26] ZHONG R, WEN C, QIU Y, et al. Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of Glycyrrhiza uralensis fisch. On ulcerative colitis in rats: Role of nucleotide-binding oligomerization domain 2/receptor-interacting protein 2/nuclear factor-kappa B signaling pathway [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2025, 344.
[27] LUO H, ZHANG C, HE L, et al. 18β-glycyrrhetinic acid ameliorates MPTP-induced neurotoxicity in mice through activation of microglial anti-inflammatory phenotype [J]. Psychopharmacology, 2023, 240(9): 1947-61.
1.创新点
1.1多靶点协同调控理论的深度挖掘
本研究首次系统验证18β-GA通过IL-6、PPAR-γ、MAKP3等多靶点协同作用治疗溃疡性结肠炎的新机制。重点揭示其对PPAR-γ/NF-κB炎症通路的关键调控作用：一方面通过抑制p65蛋白核转移降低炎症因子表达，另一方面通过上调Occludin、ZO-1等紧密连接蛋白促进肠黏膜修复。这种"抗炎-修复"双重作用模式为开发多靶点天然药物提供了实验依据。
1.2 “菌群重塑-炎症调控-上皮修复”调控策略的探索
本研究针对UC治疗中黏膜修复困难、易复发的临床难题，首次提出18β-GA通过“菌群重塑-炎症调控-上皮修复”三位一体的整合作用模式。通过16S rDNA测序技术分析小鼠肠道菌群变化，发现18β-GA能调节有益菌/有害菌比例，筛选出与炎症缓解相关的关键菌群。结合动物与细胞模型证实，该药物通过抑制炎症因子和促进上皮再生（上调紧密连接蛋白ZO-1/Occludin），为开发“菌群-药物”联合疗法提供新思路
1.3 技术方法的交叉融合与精准验证
为实现机制研究的深度突破，本研究拟整网络药理学、分子对接及多种、多层次的实验，建立“虚拟靶点筛选-动物模型评价--肠道菌群测序-细胞实验验证”的研究框架。通过“网络药理学+分子对接”预测18β-GA作用于UC的作用靶点，在动物和细胞模型中通过多种实验方法，如免疫荧光、免疫组化、Western blot等方法进行验证，结合16S rDNA测序对关联菌群变化与炎症效应缓解的相关性进行探索，通过构建共培养体系和细胞划痕实验监测肠上皮细胞修复过程，为天然产物的精准机制解析提供方法论参考。
2.项目特色
2.1从整体到分子的多层次解析
本项目构建了从整体到分子层面的系统性研究框架，综合运用动物模型、细胞模型、菌群动态分析和分子靶点研究手段，实现对 18β-GA 作用机制的立体解析。研究流程从靶点预测出发、通过动物模型评估整体疗效、深入分析肠道菌群功能，再到细胞水平验证其功能，既保证研究的学术深度，又兼顾临床转化可行性。此外，在动物模型中除常规结肠病理评估外，创新性采用免疫荧光双标记技术，原位分析肠组织内炎症信号通路与屏障蛋白的共定位变化，直观揭示药物对“炎症抑制-屏障修复”的同步调控作用。
2.2紧扣临床需求的转化导向
聚焦UC黏膜愈合率低的核心问题，本研究着重开展18β-GA对上皮修复功能的实验验证。通过建立巨噬细胞-肠上皮细胞共培养炎症模型，利用划痕实验动态观察药物对细胞迁移能力的影响，通过Western blot检测紧密连接蛋白的表达，探究 18β-GA 对上皮修复的作用机制。同时，深入研究其与菌群调控的协同效应，为开发 18β-GA 联合益生菌等创新治疗方案提供理论支撑，切实推动基础研究向临床应用的转化。
2.3交叉技术创新提升研究深度
本项目整合多学科前沿技术，弥补传统研究方法的局限：
（1）构建动态共培养模型：模拟肠道炎症微环境，结合活细胞成像技术，实时记录上皮修复过程；
（2）空间定位提高精准性：通过免疫荧光双标记技术，在组织切片中分别标记炎症信号通路活化（红色荧光）与屏障蛋白分布（绿色荧光），借助共聚焦显微镜，直接观察两者在肠黏膜病变区域的动态变化，精准解析药物调控机制。
（3）建立虚拟-实验双向验证：先通过分子对接预测潜在靶点，再运用免疫荧光、免疫组化、Western blot和凝胶迁移等方法验证靶点，形成机制研究的双向闭环。
（4）开展多组学关联分析：基于16S测序筛选关键菌属变化，结合炎症因子水平与上皮修复指标，揭示“菌群-炎症-修复”的交互网络，为 UC 治疗研究提供新思路。
1.技术路线
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1.1 DSS诱导小鼠结肠炎的建立
18β-GA的化学式（图1a）。采用4%（w/v）DSS溶液建立实验性结肠炎小鼠模型（图1b）。雌性BALB/c小鼠，35～40日龄，体重18～22g。将所有小鼠随机分为4组（n=8/组）：未处理对照组、DSS模型、DSS+5-ASA（40mg/kg），DSS+18β-GA（40mg/kg）。除对照组外，小鼠分别给予4%（w/v）DSS溶液7天，然后在接下来的5天内给予常规水。从第1天至第12天，治疗组小鼠每天灌胃5-ASA或18β-GA，对照组和DSS模型组小鼠分别给予生理盐水（NormalSaline, NS）。并在第13天处死所有小鼠。第13天处死小鼠，收集心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官，将结肠、直肠与回肠近端小肠分离，与远端肛门分离。取下结直肠切片并拉直（不拉伸），用尺子测量其长度，纵向解剖结肠，用生理盐水洗涤，用10%中性福尔马林固定，进行纵向解剖结肠，生理盐水冲洗，10%中性福尔马林固定，进行HE染色、PAS染色、IHC和IF染色。剩余结肠组织保存在−80℃进行Westernblot分析。
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图 1.通过体内外实验研究18β-GA对 UC的治疗作用。（a）18β-GA的化学结构。（b）实验设计流程图。MECEs：小鼠结肠上皮细胞；PMs：小鼠腹膜巨噬细胞；NS：生理盐水溶液；HE：苏木精-伊红染色；PAS：过碘酸雪夫染色；IHC：免疫组化；IF：免疫荧光；WB：Westernblot；EMSA：凝胶迁移实验。
1.2 18β-GA对 UC小鼠的药效研究
（1）通过体内动物实验研究18β-GA的治疗作用
1）采用DAI评分对小鼠进行评估
从实验的第一天开始，每天观察小鼠的精神状态和毛发状况。记录其体重、粪便特征和粪便隐血，并计算DAI评分。DAI评分的具体标准见表1。
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2）PAS
PAS染色可显示糖原和多糖物质，用于杯状细胞染色。石蜡组织切片脱蜡、水化后，按说明书用PAS染色液B、A、C染色，最后脱水密封，在显微镜下采集图像分析。
3）HE染色
取小鼠结肠进行固定，将石蜡包埋的结肠组织块切成4µm厚的切片，进行HE染色。观察结肠的病理学变化和组织损伤评分，具体标准见表2。取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器进行固定，将石蜡包埋的组织块切成4µm厚的切片，进行HE染色，研究18β-GA的安全性。
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4）采用Western Blot检测结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF - α蛋白的表达水平
从每组小鼠的结肠组织中去除全蛋白后，采用BCA检测试剂测定蛋白浓度。将每组样品在10%、12%和15%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭2h，然后在4℃下于一抗中孵育过夜，然后在室温下于二抗中孵育1h。根据ECL蛋白印迹实验，进行膜成像，检测结肠组织中IL-6、TNF-α、IL-1β的蛋白表达。
5）16SrDNA测序和微生物群分析
采用以下引物对16SrDNA进行测序：正向（5’-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3’和反向（5’-TASGGHTACCTTGTTAS-3’）。第三代微生物多样性基于PacBio测序平台，标记基因通过单分子实时测序（single molecule real-time sequencing ，SMRT Cell）进行测序。通过循环一致序列的过滤、聚类或去噪，以及物种注释和丰度分析，揭示每个样本的物种组成。进行了以下分析：物种注释和分类分析、显著差异分析和多样性分析(α和β多样性）。
（2）通过体外细胞实验研究18β-GA的治疗作用
1）细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8 ，CCK-8）实验
在对数生长期，将 MCECs以30%的生长密度均匀铺布在96孔板上，孵育24h后，设空白组（未接种细胞）、对照组和不同浓度18β-GA给药组（1000、500、250、125、62.5、31.25 µM），每组6个重复孔。给药24h后，每孔加CCK-8试剂10µL，继续孵育1h。在450nm处用酶标记测定各组吸光度（A）值，并计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（A加标-空白）/（A对照-空白）*100%，重复上述实验3次。不同浓度18β-GA对MCEC细胞存活率的影响差异较大。结果发现，62.5、31.25µM的18β-GA浓度对MCECs24h的存活率无显著影响，因此选择62.5µM的18β-GA作为给药条件。
2）PMs细胞的收集
用4%DSS溶液诱导结肠炎模型小鼠5天，于第6天麻醉下予以小鼠眼球摘除放血后，颈椎脱臼处死动物，将动物放置于75%酒精中5~10秒后拿出小鼠，仰卧位放置并固定于实验操作台上，腹部予以备皮，75%酒精消毒。用镊子夹起小鼠下腹部的皮肤，在中央处剪开皮肤约0.5cm切口后撕开皮肤，将皮肤与腹膜充分分离，充分暴露腹膜。更换镊子、剪刀，无菌镊子夹住小鼠腹膜后用剪刀剪开约1.0cm切口，剪开腹膜后每只小鼠用10mL一次性注射器抽取大约5mlHanks’溶液腹腔灌洗，轻揉小鼠腹部，抽取腹腔液于无菌离心管中收集小鼠腹膜腔巨噬细胞，再重复灌洗两次并收集。提纯后的细胞于镜下观察获得的原代巨噬细胞培养前的形态及生长状态，并取形态及生长状态较好的原代细胞进行后续实验。
3）利用WB实验检测紧密连接蛋白的表达
从每组小鼠的结肠组织中去除全蛋白后，采用BCA检测试剂测定蛋白浓度。将每组样品在10%、12%和15%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭2h，然后在4℃下于一抗中孵育过夜，然后在室温下于二抗中孵育1h。根据ECL蛋白印迹实验，进行膜成像，检测MCECs中occludin和ZO-1的蛋白表达。
4）共培养体系的建立及细胞划痕实验
用4% DSS溶液诱导结肠炎模型小鼠5天，第6天处死。收集小鼠PMs并在Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中添加10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素，置于37℃5%CO2的湿式培养箱中培养。将MCECs置于6孔培养板在37℃的5%二氧化碳培养箱中培养。将PMs加入Transwell孔插入物（孔径0.4μm）的上腔室，转移到6孔培养板上共培养。共培养体系用18β-GA（62.5µM）处理。在上述处理后，分别在0h和24h对MCECs的单层进行划痕和观察，计算迁移率。
1.3 18β-GA治疗DSS诱导的UC的机制研究
（1）通过网络药理学预测18β-GA对UC的可能作用靶点
通过Pubchem有机小分子生物活性数据库检索18β-GA的SMILES结构式及3D结构，在TCMSP、ETCM、SwissTargetPrediction、TargetNet数据库中检索相关靶点，删除重复项，将剩余部分导入通用蛋白（Uniprot）数据库，以标准化靶标名称，并最终获得与药物相关的靶标。通过Gencards、OMIM、治疗靶标数据库（therapeutictargetdatabase，TTD）、遗传药理学与药物基因组学数据库（Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base， PharmGKB）和 Open DataDrug&Drug Target Database（DrugBank）数据库，使用关键词“溃疡性结肠炎”进行重叠、消除重复，并导入Uniprot数据库，以标准化靶点名称并获得最终的UC疾病靶点。18β-GA相关靶点和UC疾病靶点被导入Venny2.1在线绘图工具平台，获得“药物疾病”共同靶点。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction ，PPI）数据来自STRINGv.11.5数据库，该物种仅限于“智人”，置信区间得分设定为>0.4。使用Cytoscape软件可视化PPI网络。随后，使用Metascape进行富集分析。
（2）通过分子对接进一步探索18β-GA可能的作用靶点
从Pubchem数据库下载18β-GA的3D结构，通过OpenBabel3.1.1软件将其转换为“mol2”格式，使用AutoDockTools添加氢，设置为配体，确定扭矩中心，选择扭转键，导出为PDBQT格式。然后将目标蛋白名称输入蛋白质数据库，从中选择具有一个或多个共结晶配体和低“分辨率”值晶体结构的人蛋白，保存为PDB格式，使用AutoDockTools脱氢，设置为受体并导出为PDBQT格式。
通过AutoDock4.2.6软件对GridBox参数进行调整，直到盒子包裹了所有受体分子，采用盲对接方法寻找活性位点，导出网格点参数文件，运行Autogrid4，设置对接参数和对接算法，运行Autodock4，检查结果。利用PyMOL2.4.0软件对对接结果进行可视化处理。最后，为了获得对接分数，将蛋白质和化合物上传到DockThor，进行在线分子对接。
（3）通过体外细胞实验验证18β-GA的作用靶点
1）共培养实验
建立PMs与MCECs共培养炎症模型，模拟体内炎症微环境，用凝胶电泳法分离蛋白质，检测蛋白与DNA的结合能力。电泳迁移率转移试验采用非反射性（生物素标签）凝胶转移法，根据制造商的方案进行。NFκB（ 5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 ’ 和 3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5 ’）和PPARγ（5’-GAGGCCAGCATGGTGTAGAT-3’和3’-CTCCGGTCGTACCACATCTA-5’）一致寡核苷酸探针末端用生物素和脱氧核苷酸转移酶进行标记。为了进行结合反应，将8mg的核提取物蛋白与含有1ml生物素末端标记的寡核苷酸（0.2μm）的结合缓冲液（总容积为20μl）孵育，在室温下孵育20分钟。在添加标记探针之前，将100倍的各种未标记的双链DNA添加到反应混合物进行竞争实验。加入5μl样品缓冲液后，DNA蛋白复合物在6%聚丙烯酰胺凝胶中分离，在0.5tris-硼酸edta缓冲液中380mA恒流电转1h，转移到尼龙膜上。最后，使用Chemiluminescent EMSAKit（碧云天，中国）对生物素标记的DNA进行化学发光检测，并暴露在X射线胶片上。
2）siRNA沉默验证
根据前期靶点预测和分子对接结果，选择关键靶点蛋白进行siRNA沉默验证。针对每个靶点蛋白，设计并合成特异性的siRNA序列，同时设置对照组。选择与UC发病机制相关的细胞模型（如结肠上皮细胞、巨噬细胞等），采用脂质体转染等方法将siRNA导入细胞中。在转染后24 - 48小时，加入18β-GA处理细胞，设置不同浓度梯度和处理时间，观察细胞的表型变化。通过Western blot、qPCR等技术检测靶点蛋白的表达水平，验证siRNA对靶点蛋白的沉默效果。同时，检测炎症因子（如TNF-α、IL-6等）、细胞迁移相关蛋白（如occludin、ZO-1等）的表达变化，评估靶点蛋白在18β-GA治疗UC中的作用。
（4）通过体内动物实验验证18β-GA的作用靶点
1）采用WesternBlot检测结肠组织中PPARγ、p-NFκB蛋白的表达水平
从每组小鼠的结肠组织中去除全蛋白后，采用BCA检测试剂测定蛋白浓度。将每组样品在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜2h，然后在4℃下于一抗中孵育过夜，然后在室温下于二抗中孵育1h。根据ECL蛋白印迹实验，进行膜成像，检测结肠组织中PPARγ、p-NFκB的蛋白表达。
2）采用免疫组化检测结肠组织中PPARγ、p-NFκB蛋白的表达水平
取结肠段，用4%多聚甲醛固定。然后制备4µm厚的石蜡包埋结肠切片，在0.3%过氧化氢甲醇中室温孵育20min，以抑制内源性过氧化物酶活性。抗原提取切片用柠檬酸缓冲液(pH6.0)处理，在微波炉中加热3次，每次5分钟。然后用5%牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭切片30分钟，然后与PPARγ、p-NFκB一抗在4℃下孵育过夜。次日，切片分别与二抗在室温下孵育，剩余操作按UniversalSPkit完成，最后在显微镜下观察拍照。
3）采用免疫荧光检测结肠组织中PPARγ、p-NFκB蛋白的表达水平
石蜡切片去蜡，再水化，并根据标准方案处理。用PPARγ、p-NFκB一抗孵育过夜后，用PBS洗涤3次，并与相应的生物素化二抗孵育40分钟。然后，再次清洗切片，用荧光素(1:100)孵育1小时。最后，所有切片用DAPI的 extend™Diamond AntifadeMountant反染色，并用盖密封。使用倒置荧光显微镜(Leica,Wetzlar,Germany)捕获荧光图像。
4）采用免疫荧光双标记技术揭示药物对“炎症抑制-屏障修复”的同步调控
石蜡切片去蜡，再水化，并根据标准方案处理。切片固定后，进行免疫荧光双标染色，同时加入兔抗NF-κB p65、鼠抗ZO-1一抗，4℃孵育过夜后，用PBS洗涤3次，Alexa Fluor 594标记羊抗兔IgG（红色，显示p65），Alexa Fluor 488标记羊抗鼠IgG（绿色，显示ZO-1），避光室温孵育二抗1小时。再次清洗切片，用荧光素(1:100)孵育1小时。最后，所有切片用DAPI的 extend™Diamond AntifadeMountant反染色，并用盖密封。使用倒置荧光显微镜(Leica,Wetzlar,Germany)捕获荧光图像。使用ImageJ插件“Coloc 2”计算p65核内荧光强度与ZO-1膜定位的Pearson相关系数。对比不同组间共定位系数的显著性差异（如t检验），评估18β-GA对“炎症-屏障”动态平衡的调控作用。

2.拟解决的关键问题
（1）18β-GA作为天然产物，其干预溃疡性结肠炎（UC）的多靶点作用网络尚未形成系统性解析，尤其是“肠道菌群重塑-炎症信号抑制-肠上皮修复”三者的动态关联机制亟待阐明。例如：炎症信号通路（如NF-κB）的活性抑制与上皮屏障蛋白（如ZO-1）的表达上调是否存在时空相关性？
（2）目前尚不明确肠道菌群变化是18β-GA治疗UC的直接作用结果，还是伴随炎症缓解的间接现象。需通过菌群移植实验或代谢物干预实验反向验证其必要性。
（3）如何将16S rDNA测序数据、Western Blot检测结果与免疫荧光共定位参数进行多组学关联分析，进而构建“菌群-炎症-修复”的交互作用网络？
（4）如何设计“肠道菌群-药物”联合治疗方案，并验证其协同增效作用？

3.预期研究成果
（1）阐明18β-GA通过“肠道菌群代谢调控→炎症信号通路抑制→肠上皮再生促进”的三维作用路径，绘制其多靶点调控网络。
（2）明确关键菌属及其代谢产物在介导药物疗效中的核心作用，揭示菌群-宿主互作的具体分子机制。
（3）优化“菌群测序-炎症因子检测-上皮修复指标”多组学关联分析流程，形成天然产物作用机制研究的标准化技术框架。
（4）产出整合各项实验数据，总结研究成果并发表高水平学术论文。
（5）提出“18β-GA+益生菌”联合用药方案，通过动物模型验证其抗复发效果（如降低疾病活动指数DAI评分等），同时探索18β-GA对克罗恩病、放射性肠炎等同机制疾病的干预潜力，完成预实验数据积累。

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1.1与本项目有关的研究积累
炎症性肠病（IBD）是一种累及末端小肠至直肠的慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病（Crohn’s disease，CD）。其中溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性复发性疾病，主要临床表现为粘液性便血、腹痛和腹泻。病变局限于大肠黏膜及黏膜下层，多位于乙状结肠和直肠，可延伸至降结肠，甚至整个结肠，病程很长，很难治愈。UC在发达国家的发病率很高，而在发展中国家的发病率大幅上升，已演变成一种全球负担。UC的确切发病机制尚不清楚，但普遍认为其与免疫反应失调、肠道微生物群改变、遗传易感性和环免疫抑制剂等境因素有关。目前，治疗溃疡性结肠炎的药物主要是美沙拉嗪、5-氨基水杨酸酯、柳氮磺吡啶、，但大多数药物都局限于安全性和副作用等方面，某些药物长期使用会增加药物依赖、免疫功能下降和患癌症的风险，因此，迫切需要安全性好、副作用小的治疗溃疡性结肠炎的新药。
中医药是一种以独特的中国文化理论和实践为基础的医学体系，有着悠久的有效治疗历史，其作用方式多靶向，副作用少，在治疗慢性病方面具有独特的优势，包括疗效确切、维持有效、降低复发率，并且只有轻微的毒副作用。甘草是中草药中最常见的草药之一，有着悠久的使用历史，18β-GA是甘草根提取物的主要活性成分，其及其衍生物已被证实具有显著的广谱生物和药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗微生物、抗溃疡、抗糖尿病、护肝、心脏保护和神经保护作用。然而，其对溃疡性结肠炎的保护机制尚不明确，仍需要进一步研究。

1.2已取得的成绩
（1）18β-GA可改善DSS诱导的小鼠UC
所有的动物实验程序和分析方法如图1b所示。18β-GA处理降低了dss诱导的体重减轻（图2a）。18β-GA处理降低了DSS诱导小鼠的总DAI，通过体重减轻和稀、血便来评估（图2b）。DSS组小鼠的结肠长度明显短于对照组，而18β-GA治疗组小鼠的结肠长度明显长于模型小鼠（图2c-d）。通过H&E染色，对结肠损伤和炎症细胞浸润进行了检查，结果显示DSS引起了严重的结肠坏死，其特征是黏膜完整性和腺结构消失，并伴有结缔组织明显增生，此外，小鼠DSS组显示大量的结肠炎症细胞浸润结肠组织，表明一个严重的炎症反应，随后18β-GA治疗导致显著改善上述病理特征，表明18β-GA强有力的治疗效果减轻DSS诱导的结肠损伤和炎症后遗症（图2e-f）。
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图2.18β-GA改善了DSS诱导的小鼠UC。(a)各组小鼠的体重。(b) DAI分数。（c-d）每一组小鼠的结肠外观和长度。(e)结肠切片的HE染色。黑色箭头表示炎症细胞浸润，红色箭头表示肠腺坏死消失，绿色箭头表示中性粒细胞有限存在。(f)组织学评分。* p < 0.05，** p < 0.01与对照组比较，# p < 0.05，## p < 0.01与DSS组比较。
（2）18β-GA对小鼠的主要器官具有一定的安全性
H&E染色显示，给药组小鼠的心脏、肝、脾脏、肺、肾等部位均无明显病变（图3a-e）。
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图3.主要器官的H&E染色。a.肝。b.心。c.肾。d肺。e.脾脏。
（3） 18β-GA的网络药理分析
首先以“18β-GA”为关键词，在 TCMSP、ETCM、Swiss Target Prediction、TargetNet 四个数据库中分别检索得到 6个、48个、92 个、27个18β-GA的潜在靶点。以“ulcerative colitis”作为关键词，在 GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank三个数据库中分别检索得到 3770个、7 个、38 个、15个、180个 UC 的潜在靶点。去除重复靶点后，将剩余的潜在靶标标准化为UniProt中的基因名称分别获得 143 个 GA潜在靶点和3821个UC潜在靶点，为了直观地说明这两组目标之间的重叠，使用Venny 2.1将18β-GA靶点与UC靶点绘制在Venny图上，最终得到“药物－疾病”共同靶点80个，确定了它们在18β-GA对UC的治疗前景中的潜在意义（图4a）。
然后，将药物-疾病靶点上传到STRING数据库，得到80个节点和433个边缘，通过Cytoscape软件构建PPI网络（图4b），发现网络的平均程度约为10.825，平均介数约为97.575，平均接近度约为0.0058306，并且发现有16个靶点是18β-GA在UC中的重要靶点。将药物疾病交集靶点也被引入metscape平台，用于基因本体（GO）生物学功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径富集分析。以p < 0.05为主要筛选标准，共检索到GO生物功能条目922条，其中生物过程（biological processes, bp） 808条，细胞成分（cellular components, CCs） 36条，分子功能（molecular functions, MFs） 78条（图4c）。通过KEGG通路富集分析，共获得108条信号通路（图4d）。结果显示，18β-GA具有抗菌作用，这与16S rDNA测序的结果一致。
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图4.网络药理学分析。（a）18β-GA和UC之间的维恩图。（b）18β-GA与UC相关蛋白的PPI网络图。（c）GO分析。（d）KEGG通路富集分析。红色越深，p值越小，代表富集越显著；气泡越大，代表该通路所含基因数目越多。
（4）粪便微生物群分析
网络药理学分析显示18β-GA具有抗菌作用，为了确定18β-GA对肠道微生物组成的影响，我们进行了16S rDNA测序。采用Chao1和ACE丰度指数和Shannon和Simpson多样性指数评价α多样性。Chao1指数和ACE指数代表细菌丰富度和物种丰富度，而Shannon指数和Simpson指数代表微生物多样性。本研究中使用的所有样本库覆盖率均在99%以上，表明样本库的规模足以包含绝大多数微生物。各类群的操作分类单位（operational taxonomic units,OTU）数量均达到饱和，适当地代表了大多数物种，并采用稀疏曲线和Shannon-Wiener曲线等曲线分析来反映样本量的合理性（图5a-b）。结果显示，18β-GA组的Chao1和ACE指数较模型组降低，说明给药后物种丰富度降低。GA降低了Shannon和Simpson指数，说明给药后物种多样性降低（图5c）。利用未加权unifrac计算反映生境间多样性的beta多样性。主坐标分析（Principal coordinates Analysis, PCoA）结果显示，各组肠道菌群分布区域相对不同，说明各组肠道菌群结构存在差异，同时组内差异较大。结果表明，造模后小鼠肠道菌群紊乱，18β-GA处理可改善肠道菌群紊乱（图5d）。非参数相似性分析（ANOSIM）分析发现，三个群体在群落组成和丰度方面的组间差异比组内差异更为明显（图5e）。为了确定组间有显著差异的细菌群，采用线性判别分析结合效应量测量（LEFSe）。我们发现，与其他组相比，对照组包括s_Ruminococcus_flavefaciens、g_ Ruminiclostridium_6和f_Clostridiaceae_1在内的细菌丰度更高（图5f）。DSS处理组细菌数量显著增加，包括f_Bacteroidaceae、g_Escherichia、o_Enterobacterales和s_eacherichia_coli，18β-GA处理组细菌数量显著增加，包括s_Parabacreroides_merdae 、s_Bacteroides_thetaiotamicron、s_Fusobacterium_mortiferum（图5f）。
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图5.不同群体中微生物群的变化。（a）Rarefaction分析。（b） Shannon指数曲线。（c） DSS或18β-GA处理小鼠的微生物群落α多样性指数。与对照组比较， * p<0.05， ** p<0.01，与DSS组比较， # p<0.05， ## p<0.01。（d）未加权单位距离PCoA图。（e）小鼠肠道细菌群落的方差分析。（f） LEfSe分析。
2.1 已具备的条件
（1）实验条件达标
申请人所在地为济宁医学院，配备有相应科研设施，科研条件良好，有条件达标的动物饲养环境，可进行合格实验。并且实验室配备了体内外药效学研究所需的仪器和设备，包括 Western Blot 相关仪器、real-time PCR 仪、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等，能够有效地保证实验的顺利进行。
（2）实验方法可靠可行
本项目所用的实验方法包括构建动物模型、HE 染色、免疫荧光、免疫组化、Western Blot、ELISA、细胞划痕等所用的技术和方法都已十分成熟和稳定，并且项目组成员能够熟练掌握这些常用技术，独立完成各项实验。
（3）科学假说的提出具有充分的前期工作基础
本课题组已完成了该课题研究的部分前期实验，并获得了部分预期结果。

2.2 尚缺少的条件及解决方法
（1）分子对接技术待完善
缺少条件：目前尚未开展分子对接分析工作，团队成员对 AutoDock Vina、PyMOL 等专业软件操作缺乏实践经验，难以独立完成 18β-GA 潜在靶点的结合模式预测。
解决方法：依托校内生物信息学课程资源，系统学习分子对接理论与实操技术；选用开源软件 PyRx 作为基础工具，开展初步的靶点结合能计算，并通过研读领域内高水平文献，优化参数设置与分析流程，确保预测结果的科学性。
（2）多组学数据整合经验有限
缺少条件：团队在整合 16SrDNA 测序数据与转录组、蛋白组数据方面经验不足，尚未掌握跨组学关联分析的有效方法，难以构建完整的 “菌群 - 炎症 - 修复” 调控网络。
解决方法：组织团队成员参与校内外生物信息学专题培训，夯实数据分析基础；同时邀请校内生物信息中心专家参与项目指导，联合开发适用于本研究的多组学数据整合模型，实现菌群结构变化、炎症因子表达与上皮修复指标间的关联性解析。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 7500.00 12500.00
1. 业务费 8000.00 无 1500.00 6500.00
（1）计算、分析、测试费 3000.00 检测 1500.00 1500.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 5000.00 论文出版 0.00 5000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 12000.00 无 6000.00 6000.00
结束

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