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5-HT2AR/OX1R二聚体协同调控ERK-CREB-BDNF通路致抑郁机制研究

申报人：胡政 申报日期：2025-03-26

基本情况

2025创新项目
5-HT2AR/OX1R二聚体协同调控ERK-CREB-BDNF通路致抑郁机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目聚焦抑郁症治疗靶点单一的临床难题，创新性地探索 5 - 羟色胺 2A 受体与食欲素 1 型受体异源二聚体通过调控 ERK-CREB-BDNF 通路影响神经元可塑性的分子机制。研究将综合运用双分子荧光互补、邻位连接技术、免疫共沉淀及生物发光共振能量转移等方法，在 HEK293T 细胞模型和慢性不可预测温和应激（CUMS）小鼠中验证两种受体的共定位与二聚体化特征，通过 G 蛋白偏好性实验、β-arrestin 招募实验及 Western blot 分析二聚体对 ERK 磷酸化、CREB 活性及 BDNF 表达的调控差异，并结合 LPS 刺激和皮质酮处理揭示应激 / 炎症对二聚体功能的影响。在此基础上，基于分子对接技术设计靶向二聚体界面的 TAT 融合干扰肽，通过细胞钙信号检测、cAMP 水平分析及行为学实验评估其对二聚体功能的阻断效应，最终在 CUMS 小鼠模型中验证干扰肽对抑郁样行为及海马炎症的改善作用。该研究首次系统揭示 5-HT2AR-OX1R 异源二聚体在抑郁症中的调控作用，提出二聚体通过 ERK-CREB-BDNF 通路调控神经元可塑性的新机制，具有重要的临床创新价值。
        负责人自2024年9月进入济宁医学院神经生物学研究所，并随实验室老师学习和参与过《5-HT2A受体和食欲素受体1二聚化》的研究。熟练掌握原代神经元、HEK293T等细胞系的培养、转染和冻存技术，以及GPCR二聚化核心检测技术，包括PLA、Co-IP和BRET，成功构建并验证受体动态互作机制。具备GraphPad Prism数据建模分析及SCI论文撰写能力，独立完成实验数据整合、图表绘制与结果阐释，相关研究基础为揭示二聚化在抑郁症中的作用及靶向干预开发提供理论与技术支撑。
博士期间主要从事小鼠肿瘤和人肿瘤细胞转移以及信号通路的研究。参与了国家重点研发计划项目（2017YFE0129800）。
全力支持该项目
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
胡政 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 细胞实验、Co-IP、动物实验、质粒构建、BRET检测、PLA、数据分析等
张慧明 精神卫生学院 精神医学（本科） 2022 免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜、Western Blot等
任绪睿 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 Western Blot、BRET检测、qPCR、冰冻切片等

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
宋方宇 精神卫生学院 否
刘航 研究生处 否

立项依据

       近年来，随着社会经济的快速发展，精神心理疾病患病率呈显著上升趋势。据世界卫生组织（WHO）统计，全球约 10 亿人口正遭受至少一种精神障碍困扰，其中抑郁症作为最常见的情感障碍，其现有治疗方案存在作用机制单一、副作用明显等局限，亟需拓展新型治疗靶点的研究。食欲素1型受体（OX1R）与 5-羟色胺 2A 受体（5-HT2AR）作为 G 蛋白偶联受体（GPCRs）家族成员，在抑郁症病理进程中发挥重要调控作用。临床研究表明，抑郁症患者海马体、前额叶皮质等关键脑区存在 ERK 磷酸化水平降低、CREB 活性抑制及 BDNF 表达下调的特征性改变，导致神经元可塑性受损，引发情绪调节异常及认知功能障碍。值得关注的是，越来越多的研究表明，GPCRs 可通过形成二聚体或更高阶寡聚体的方式调控信号转导。OX1R 与 5-HT2AR 作为两种重要的 GPCR 家族成员，其异源二聚体的形成可能通过调控 ERK-CREB-BDNF 信号通路参与抑郁症的病理过程。然而，目前关于 OX1R 与 5-HT2AR 二聚体通过调控 ERK-CREB-BDNF 通路影响抑郁症的研究尚未见报道。本课题拟通过检测二聚体形成特征及信号通路变化，系统阐明其分子机制，为抑郁症治疗提供全新的理论依据和潜在干预靶点。
1. 5-HT2AR与OX1R受体二聚化的存在与验证
       表达定位与动态变化：在HEK293T细胞中，通过双分子荧光互补实验（BiFC）、邻位连接技术（PLA）、免疫共沉淀（Co-IP）、生物发光共振能量转移（BRET）技术，明确5-HT2AR与OX1R在细胞中的共定位及二聚化现象。
2. 5-HT2AR与OX1R二聚化的信号通路调控
     （1）信号通路差异研究：通过G蛋白偏好性实验和β-arrestin招募实验，比较单体受体与二聚体激活后的信号转导差异。分析二聚化对下游通路的调控，如ERK磷酸化、CREB磷酸化及BDNF蛋白水平的激活。
     （2）炎症与神经递质调控：研究二聚化对脑区释放IL-6、TNF-α、IL-18、IL-1β及脑区神经元释放5-HT、食欲素（Orexin）的影响，揭示其5-HT2AR-OX1R二聚体介导脑区的分子基础。
     （3）HEK293T细胞中敲降OX1R后，检测5-HT2AR介导的细胞内Ca2+信号变化。
    （4）利用BRET分析5-HT2AR-OX1R细胞中cAMP信号分子的变化；利用双荧光素酶法检测活化T细胞核因子（Nuclear factor activated T cells，NFAT）、cAMP应答元件（cAMP response element，CRE）等细胞核内报告基因的表达；利用BRET分析5-HT2AR-OX1R细胞与G蛋白的结合；Western Blot检测海马及前额叶皮质中BDNF和p-CREB蛋白表达。
3. 调控二聚化的内外部因素
       应激与炎症的影响：在体外细胞模型（如HEK293T过表达系统或原代神经元细胞）中，模拟慢性应激（皮质酮处理）或炎症（LPS刺激），观察二聚化动态及信号活性变化。
4. 动物模型中的功能验证
     （1）小鼠抑郁症动物模型（CUMS）构建：构建CUMS小鼠，观察其抑郁样行为（强迫游泳、悬尾实验，开放场实验，糖水偏好实验）的变化。
     （2）取CUMS小鼠海马做冰冻切片，通过邻位连接技术（PLA），验证5-HT2AR与OX1R在小鼠脑区中的共定位及二聚化现象。
5. 二聚化特异性干预：使用干扰肽（靶向二聚体界面的TAT融合肽段）阻断二聚化
    （1）5-HT2AR-OX1R二聚体穿膜肽的筛选：根据HIV TAT蛋白可以进入细胞内的情况，按基因序列合成OX1R和5-HT2AR跨膜区（TM）和HIV TAT蛋白转导肽的融合蛋白组成的穿膜肽。HIV TAT (YGRKKRRQRRR) 能够与4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（存在于膜的内表面）连接，从而促进穿膜肽在细胞膜上的整合。在合成的穿膜肽融合蛋白中，HIV TAT连接于奇数TM的C端，偶数TM的N端。穿膜肽的融合蛋白与细胞在37℃孵育60 min后，随后进行免疫共沉淀和质谱检测，分别检测出活性和非活性状态下OX1R和5-HT2AR相互结合的跨膜区，整理出5-HT2AR-OX1R活化过程中的结构变化。
     （2）干扰肽阻断二聚化的细胞水平功能验证：①钙离子（Ca2+）信号：使用Fluo-4 AM负载表达受体的细胞，加入干扰肽后检测5-HT或食欲素刺激下的Ca2+荧光强度变化。②cAMP水平检测：通过ELISA比较干扰肽处理组与对照组的cAMP浓度差异。③ERK-CREB-BDNF水平检测：Western blot检测p-ERK、p-CREB、BDNF蛋白水平，验证干扰肽对二聚体下游通路的影响。
     （3）干扰肽阻断二聚化的动物模型水平功能验证：通过立体定位仪将干扰肽注入特定脑区（中缝背核），通过强迫游泳实验（FST）、悬尾实验（TST）、糖水偏好测试（SPT）观察小鼠抑郁样行为是否改善，然后进行海马组织HE染色，观察小鼠海马区炎症是否改善，最后通过PLA检测海马区二聚体水平变化。
上述研究内容从体外研究→分子机制→动物模型，旨在揭示5-HT2AR-OX1R二聚化在抑郁症中的核心作用，同时为开发基于受体二聚化的新型诊断工具和靶向药物提供科学依据。

本项目中应用的关键技术说明：
       1. 荧光共振能量转移（FRET）技术在本实验中被用于实时监测 OX1R 与 5-HT2AR 的动态相互作用。该技术基于 Förster 偶极-偶极相互作用原理，当 CFP 标记的 OX1R（供体，λex=433 nm,λem=475 nm）与 YFP 标记的 5-HT2AR（受体，λex=514 nm, λem=527 nm）在质膜上形成异源二聚体（间距<10 nm）时，供体激发能会通过非辐射能量转移导致受体荧光增强。实验采用 pCMV3-CFP-OX1R 与 pCMV3-YFP-5-HT2AR 重组质粒（1:3 比例）共转染 HEK293T 细胞，利用 Zeiss LSM 880 共聚焦显微镜检测 FRET 效率。结果显示，共表达组 CFP/YFP 荧光强度比值（ΔFRET）为 28.7±3.2%（n=15），显著高于阴性对照（空载体组：9.5±1.8%, p<0.001）。通过受体光漂白实验验证，FRET 效率在光漂白后提升至 41.2±4.5%（n=10），证实二聚体的物理结合。结合免疫共沉淀（Co-IP）实验，在抗 OX1R 抗体沉淀复合物中检测到 5-HT2AR 的特异性条带（约 90 kDa），进一步验证二聚体的存在。该技术的纳米级分辨率（2-10 nm）与活细胞动态监测能力，为解析 OX1R-5-HT2AR 异源二聚体调控 ERK-CREB-BDNF 通路的分子机制提供了关键技术支撑。
       2. 生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET）是基于供体荧光素酶（如 Renilla 荧光素酶 Rluc）与受体荧光蛋白（如 YFP）间的非辐射能量传递现象，用于检测活细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的生物物理技术。其核心机制为：当供体 Rluc 催化底物腔肠素（coelenterazine）氧化发光时，若受体 YFP 处于 Förster 半径（通常 10-15 nm）内，供体发射光谱（480 nm）与受体吸收光谱（514 nm）的重叠会导致能量转移，使受体发射增强（535 nm）。生物发光共振能量转移（BRET）技术被用于定量分析 OX1R 与 5-HT2AR 的异源二聚化特征。本实验构建 OX1R-Renilla 荧光素酶（Rluc）与 5-HT2AR-黄色荧光蛋白（YFP）融合表达载体，共转染 HEK293T 细胞后，检测 BRET 信号（YFP 发射强度 / Rluc 发射强度）。
         3. 邻近连接分析技术（PLA）基于抗体介导的 DNA 连接反应实现蛋白质相互作用原位可视化。针对 OX1R 与 5-HT2AR 的特异性抗体分别偶联寡核苷酸探针，当两受体在细胞膜上间距<40 nm 时，互补探针通过 DNA 连接酶形成环状模板，启动滚环扩增生成荧光标记的 DNA 链。每个直径约 200 nm 的荧光信号点代表 1-5个相互作用事件，检测灵敏度达 0.1 fmol/μL。该技术具备单分子分辨率（<40 nm），可保留蛋白质天然构象，并适用于石蜡包埋组织样本分析。
         4. 免疫共沉淀（Co-IP）是基于抗体-抗原特异性结合的蛋白质互作验证技术。其核心原理为：针对目标蛋白（如OX1R）的特异性抗体与细胞或组织裂解液中的抗原结合后，通过偶联抗体的Protein A/G磁珠捕获抗原-抗体复合物，从而将与目标蛋白直接相互作用的蛋白质（如5-HT2AR）共同沉淀。该技术利用抗体的高度选择性，在生理条件下富集天然状态的蛋白质复合物，通过后续Western blot或质谱分析验证互作蛋白的存在。技术关键在于抗体的亲和力（通常要求Kd<10⁻⁹ M）及实验条件的优化（如裂解液成分、孵育时间），以确保特异性捕获并减少非特异性结合。与酵母双杂交等体外方法相比，Co-IP可保留蛋白质翻译后修饰及空间构象，更真实反映体内互作状态。在本研究中，Co-IP与FRET技术协同验证：流式细胞术检测显示，抗OX1R抗体处理后细胞FRET效率显著下降，表明抗体捕获导致二聚体解离，进一步支持两者的直接相互作用。该技术的检测灵敏度可达亚纳克级（0.1-1 ng），适用于低丰度蛋白复合物的研究。 
       抑郁症是一种常见的精神障碍（mental disorder），它是全世界导致残疾的主要原因，也是全球疾病负担的主要原因[1]。世界卫生组织（World Health Organization， WHO）描述的抑郁症是一种以特定症状为特征的情绪障碍，包括悲伤、兴趣丧失、快感缺乏（失去快乐）、食欲不振、内疚感、自尊心或自我价值感低、睡眠障碍、疲倦感和注意力不集中等[2]。对抑郁症的神经生物学和药理学的研究始于 1950 年代，最早提出的 MDD （重度抑郁症）生物学机制之一是单胺水平缺乏，即 5-HT、去甲肾上腺素和多巴胺[3]。单胺不仅直接影响突触神经传递，还通过其 G 蛋白偶联受体间接影响细胞内通路，自此以来，单胺能系统被认为是治疗抑郁症患者的主要靶点，国内抑郁症的患病率日渐增加，而绝大部分患者并未得到有效可行的治疗[4-6]。为了提供更协调和有针对性的抑郁症诊断和治疗策略，探究抑郁症的发病机制及研发出更有效的药物已经成为当下医学领域最为重要的任务。
        G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）,是GPCRs 是构成人类最大的一类蛋白质超家族，但该家族的所有成员都有七个跨膜螺旋（TM1-TM7）[7]。GPCR可形成异二聚体和同型二聚体，例如APJ和OX1R可以形成异二聚体，且APJ的TM 4和5主要构成与OX1R的相互作用界面[8]。二聚体或寡聚体形成之后可能会改变原有的信号通路，产生新的信号级联反应，从而产生不同于单体形式的病理生理作用[9]，当配体与 5-HT1AR/OX1R 异二聚体结合时，可促进 Gαs 和 Gα12/Gα13 蛋白的激活，进而引发细胞内 cAMP 水平升高，最终导致抑郁表型；而破坏该异源二聚体则可产生抗抑郁效应[10]。G 蛋白偶联受体（GPCRs）信号通路是许多生理过程的基础，与许多疾病与精神分裂症、帕金森病和药物成瘾等有关，是临床治疗的主要靶点[11, 12]。
         Orexin-A和Orexin-B是由神经元分泌的神经肽[13]，食欲素仅在位于下丘脑外侧区 （LHA）和穹窿周围区（PFA）内的神经元中产生。它们的受体为G蛋白偶联受体，包括Orexin受体1（OX1R）和Orexin受体2（OX2R），OXA对OX1R和OX2R的亲和力几乎相同，而OXB对OX2R的亲和力比OX1R高十倍[14]。研究表明，Orexin系统在各种生理过程中起着核心作用，例如唤醒，喂养，睡眠，能量消耗和寻求奖励[15]。随着研究的进行，发现抑郁症、双相情感障碍以及阿尔茨海默病伴睡眠不足等疾病与食欲素系统存在直接联系[16, 17]。抑郁症、双相情感障碍患者的下丘脑分泌素（Orexin）血浆水平明显升高[18]。Orexin 神经元主要集中于外侧下丘脑（LH），其轴突广泛投射至内侧前额叶皮层（mPFC）、海马（Hip）、杏仁核中央核（CeA）及伏隔核（NAc）等与睡眠、情绪及动机行为相关的脑区，如图1所示[19]。Orexin-A 和 Orexin-B通过与两种 G 蛋白偶联受体（GPCR）OX1R 和 OX2R 结合并激活，介导其不同的生理效应，可以与Gαq，Gαs和Gαi搭配，但耦合机制因细胞类型的不同而不同[10]。有研究表明，食欲素系统在压力相关的焦虑和抑郁相关症状中如创伤后应激障碍（PTSD）发挥重要作用，而Orexin受体1（OX1R）会影响抑郁症状的严重程度[20, 21]。临床前和临床研究发现，食欲素受体拮抗剂（ORA）通过作用于食欲素1型受体以及食欲素2型受体用于治疗抑郁症治疗[22]。

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图1 食欲素受体在脑区的分布及相关神经投射示意图
Cingulate cortex（扣带回皮层）、mPFC（内侧前额叶皮层）、Hip（海马）、BNST（终纹床核）、NAc（伏隔核）、CeA（杏仁核中央核）、PVN（下丘脑室旁核）、LH（外侧下丘脑）、VTA（腹侧被盖区）、TMN（结节乳头体核）、LC（蓝斑核）、DR（中缝背核）、NTS（孤束核）、LDT/PPT（背外侧被盖核 / 脚桥被盖核）。

        血清素（5-Hydroxytryptamine，5-HT）是一种神经递质，结构和作用方式如图2所示[23]，它主要存在于中枢神经系统 （CNS）、肠道和血小板中，在 CNS 中，血清素 （5-HT） 调节广泛的功能，包括情绪、认知、焦虑、学习、记忆、奖励处理和睡眠[24]。G 蛋白偶联受体（GPCR）超家族的重要成员——5-HT2A 受体 （5-HT2AR） 广泛分布在中枢神经系统如大脑皮层、嗅觉系统、隔膜、海马形成、基底神经节、杏仁核、间脑、小脑、脑干和脊髓中，尤其是在学习和认知所必需的大脑区域，并与许多精神疾病和病症有关，包括抑郁症、精神分裂症和药物成瘾[25]。研究发现，5-HT2A与 Gq/11 蛋白偶联，刺激磷脂酶 C（PLC），从而导致肌醇三磷酸和钙离子（Ca2+） 水平升高[26]。5 - 羟色胺 2A 受体（5-HT2AR）阻断作用作为多种抗精神病药物的核心药理机制，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于精神分裂症、双相情感障碍的治疗及重度抑郁症的辅助治疗[27]。

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图2 血清素能传播方案

       越来越多的证据表明 ERK-CREB-BDNF 信号通路在抑郁样行为中的作用。ERK （细胞外信号调节激酶） 是 MAPK 级联反应中的中间组分，包括ERK1和ERK2，在人类基因组中，ERK1 和 ERK2 分别由 MAPK3 和 MAPK1 基因编码。ERK1和 ERK2蛋白具有 83% 的同源性，通常被认为在大多数细胞功能中是可互换的，在MKKK-MKK-MAPK 信号通路中，RAF-MEK-ERK 通路特征最明显，RAF-MEK-ERK 轴参与重要生理过程的调节，例如增殖、分化、细胞周期、细胞凋亡和发育[28]。MAPK通路通过细胞表面受体（如RTKs或GPCRs）接收信号，其中经典的ERK通路信号依次为上游Ras小GTPase激活RAF激酶，中游RAF激活MEK1/2，下游MEK最终激活ERK1/2，最终由ERK磷酸化核内靶蛋白以调控基因表达。MAPK/ERK 信号通路中还存在一种正反馈环路——即 BDNF 通过 TrkB 激活 ERK，ERK 激酶通过磷酸化激活转录因子 CREB（cAMP 反应元件结合蛋白），进而启动其下游靶基因 BDNF（脑源性神经营养因子）的转录表达[29]，如图3所示。最新研究发现，ERK 功能障碍与神经退行性疾病和神经系统疾病（如抑郁症和阿尔茨海默病）的发病机制有关，抑郁症模型中，ERK 信号在与抑郁症有关的核心区域（前额叶皮层和海马体）中显著下调，各种抗抑郁药部分通过上调的 ERK 活性来产生抗抑郁效应[30]。抑郁症中 ERK 的失活涉及双向调节：一方面上游激活因子（如 BDNF、MEK1/2）表达减少，另一方面磷酸酶（如 MKP-1）活性增强，这种失衡导致 ERK 无法有效激活下游转录因子CREB，从而影响神经元可塑性相关基因的表达[31]。脑源性神经营养因子（BDNF）作为神经营养因子家族的重要成员，是由大脑合成的分泌型蛋白质，是维持海马依赖性长期记忆的关键调控因子[32]，具有调控神经元存活、生长及功能维持的核心作用，该家族成员通过介导活性依赖的神经元可塑性机制，在学习记忆等高级认知功能中占据关键地位[33]。治疗抵抗性抑郁（TRD）患者与MDD 患者治疗前 BDNF 水平普遍低于健康人群，BDNF可作为重度抑郁症（MDD）等精神疾病治疗反应生物标志物的潜力[34]。常规抗抑郁药和氯胺酮通过增加前脑区域（尤其是海马体）的 BDNF 来介导其抗抑郁药样作用，使 BDNF 成为抗抑郁疗效的重要决定因素[35]。CREB是一种细胞转录因子，作为 ERK 的下游转录因子，控制各种基因的转录，支撑神经元的可塑性和长期记忆，其激活过程可通过 G 蛋白偶联受体（GPCRs）等多种信号通路介导，涉及 cAMP/PKA、MAPK/ERK 等经典级联反应（图 4）[36]。有研究报道，躁狂模型大鼠的海马 CA1 区中敲低 CREB会引发类似躁狂的行为（如过度活跃、冲动），而过表达 CREB则导致抑郁样行为[37]。
        CREB和脑源性神经营养因子（BDNF）在调节抑郁和焦虑症状方面发挥重要作用[38]，其机制与 5-羟色胺系统及食欲素系统的交互密切相关：已有研究证实，在血管信号转导中，5-羟色胺（5-HT）可通过 5-HT2A 受体激活酪氨酸激酶和 MEK，进而磷酸化 Erk MAPK，这独立于传统的信号通路[39]。维他命B12可通过调节 BDNF/TrkB/p-CREB 信号通路，从而上调单胺类神经递质（5-HT、NE 和 DA）的水平，缓解CUMS大鼠模型抑郁症状[40]。OXA可以通过其主要受体酪氨酸受体激酶B（TRKB）促进BDNF信号传导来介导神经保护机制，L.A. Stanquini等人还发现OXA在 vmPFC （腹内侧前额叶皮层）中与 OX1R结合后，通过 Gs 蛋白激活腺苷酸环化酶，促进cAMP 生成并激活 PKA， PKA 磷酸化CREB，上调BDNF表达，BDNF与TrkB 受体结合，激活MAPK/ERK和PI3K/Akt 通路，诱导树突棘重塑和突触蛋白合成，增强神经元可塑性并介导抗抑郁效应[41]。

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图3 BDNF 相关信号通路在神经调控中的机制示意图


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图4 CREB 通路（箭头表示激活，虚线箭头表示抑制）

       5-HT2AR和 OX1R作为 G 蛋白偶联受体（GPCRs）超家族成员，其异源二聚化现象在近年研究中受到关注。以下是相关研究的核心发现：就OX1R方面，发现OX1R和5-HT1AR可形成异源二聚体，诱导新的G蛋白依赖信号传导，并且这种异源二聚体不影响β-阻滞蛋白向复合物的募集；还发现活性5-HT1AR/OX1R二聚体的结构界面由基态TM4/TM5转变为活性构象的TM6；给慢性不可预测轻度应激（CUMS）大鼠注射TM4/TM5肽，改善其抑郁样情绪状态，减少大鼠脑内源性5-HT1AR/OX1R异源二聚体的数量，通过上调BDNF水平和增强海马及内侧前额叶皮层CREB的磷酸化和激活发挥抗抑郁作用[10]。而关于5-HT2AR二聚体的报道同样不断涌现。有研究通过荧光共振能量转移（FRET）技术发现 5-HT2A和D2受体（多巴胺D2受体）在特定基序（D₂受体的 ic3区精氨酸富集序列和 5-HT2A受体C端谷氨酸残基）介导下形成异源二聚体，并且免疫荧光实验证实这两种受体在大鼠内侧前额叶皮层和黑质网状部的神经元中共定位，支持其在神经精神疾病中的潜在作用[42]。代谢型谷氨酸 2（mGlu2）受体也可5-HT2AR形成二聚体，mGlu2受体TM4的三个关键残基（Ala-677、Ala-681、Ala-685）不仅参与异源二聚体形成，还决定了其与 Gi/o蛋白的结合模式，从而调控交叉信号通路的激活效率，mGlu2受体通过 Gi/o蛋白激活，而 5-HT2A受体通过 Gq/11蛋白传递信号。当二者形成异源二聚体时，mGlu2的激活可通过其 Gi/o偶联亚基触发 5-HT2A受体的 Gq/11 信号通路，形成跨受体信号转导[43, 44]。
     多种中药成分通过不同机制靶向调控 BDNF/ERK/CREB信号通路，展现出显著的抗抑郁作用。黄芩苷通过调控 BDNF/ERK/CREB信号通路改善慢性不可预测轻度应激（CUMS）模型小鼠抑郁样行为的机制研究表明，该化合物可显著逆转 CUMS诱导的海马区 ERK、p-ERK、CREB、p-CREB 蛋白及 mRNA表达下调，通过维持 ERK/CREB磷酸化水平及促进 BDNF介导的神经可塑性，促进海马区树突棘密度增加及突触相关蛋白 PSD-95表达提升，有效缓解CUMS模型的认知功能障碍与抑郁样行为[45]。木香（Aucklandia lappa）中的活性成分COS通过激活海马中的 ERK/CREB/BDNF 信号通路，上调 GluN2A和BDNF 表达，同时抑制5-HT代谢（降低5-HIAA/5-HT 比值），改善小鼠肠道功能障碍及抑郁行为[46]。逍遥散（XYS）给药后小鼠脑内的主要代谢产物 18β-甘草次酸（18β-GA），发现它与 ERK 相互作用，导致 ERK 的激活，并通过激活核因子-红细胞因子2相关因子2（Nrf2）、CREB 和c-Jun 诱导 BDNF 转录，改善抑郁样行为[47]。这些研究共同揭示了天然活性成分通过多靶点调控神经可塑性和神经递质代谢的抗抑郁新机制，为开发基于ERK-CREB-BDNF信号通路调节的新型抗抑郁药物提供了重要理论依据。
       近十年来，生物化学、结构及功能研究已充分证实 GPCRs（G 蛋白偶联受体）能够以二聚体复合物形式存在，其在受体运输、激活及G 蛋白偶联过程中的关键作用被逐步揭示。最新研究显示，GPCR二聚体作为抑郁症治疗新靶点的临床证据日益充分，而 BDNF/ERK/CREB信号通路在抑郁症发病机制中占据核心地位，且与 GPCR二聚体调控网络存在紧密关联，因此针对该领域的深入研究具有重要科学意义和临床价值。基于前期已验证的OX1R/5-HT2AR二聚体存在性，本项目拟采用质谱检测与 BRET 技术解析其二聚体结合位点，并结合 BRET、FRET等技术手段，系统解析该二聚体调控 ERK-CREB-BDNF信号通路的分子机制及其对抑郁症病理进程的影响。这一研究将为开发基于 GPCR 二聚体的新型抗抑郁药物提供理论依据和实验支撑。

参考文献：
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      1. GPCR的二聚体以及二聚体对GPCR生理功能的调控，是分子生物学和分子药理学研究中的一个新兴领域。我们通过BRET和FRET技术监测活细胞中 5-HT2AR-OX1R 异源二聚体形成，以及对ERK-CREB-BDNF信号通路的影响。利用 HIV TAT 蛋白转导肽和受体跨膜肽合成的穿膜肽，MALDI-TOF 等方法对 5-HT2AR/OX1R二聚体交界面进行测定，探索异源二聚体的交界面和构象。
      2. 阐明5-HT2AR/OX1R 异源二聚体对抑郁症神经生物学作用的分子机制，应用阻碍异源二聚体形成的穿膜肽，检测 5-HT2AR/OX1R 异源二聚体对动物抑郁样行为的影响，为研发以二聚体为靶点的高选择性药物提供研究基础。 

技术路线：


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图5 动物慢性不可预知应激模型（CUMS）制作示意图




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图6 细胞实验技术路线示意图   



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图7 动物实验技术路线示意图


拟解决的问题：
        1. 探究5-HT2AR与OX1R的二聚化结合位点。
        2. 探究5-HT2AR/OX1R二聚体对下游ERK-CREB-BDNF信号通路的作用进而分析对于抑郁症的影响。
        3. 探究注射干扰肽后，对于ERK-CREB-BDNF信号通路的影响进而分析抗抑郁作用。
预期成果：
        1. 理论成果：在前期论证5-HT2AR/OX1R异源二聚体确实存在的基础上，通过质谱检测与BRET检测的方法确定该二聚体的结合位点，利用分子水平和行为学方面分析并通过体内体外实验探究基于ERK-CREB-BDNF信号通路5-HT2AR/OX1R二聚体对抑郁症的影响，为抑郁症的发病机制的研究提供理论基础.
         2. 国内外期刊发表论文（或综述）1～2篇。
       2025.06-2025.12：验证5-HT2AR与OX1R在小鼠脑区中的共定位及二聚化。通过 G 蛋白偏好性实验和β-arrestin 招募实验，明确二聚体对 Gαq/11 的选择性激活比较单体与二聚体的信号转导差异。利用FRET技术，对比单体/二聚体对β-arrestin-1/-2 的招募差异。
       2026.01-2026.06：利用LPS 刺激模型检测 IL-6、TNF-α等炎症因子释放，结合 HPLC 分析 5-HT与Orexin 的动态变化。进行OX1R 敲降实验，验证其对5-HT2AR 介导的 Ca²⁺信号的依赖性。HE染色观察小鼠海马区炎症改善情况。
        2026.07-2026.12：检测下游 ERK、CREB 磷酸化及BDNF 表达水平，揭示二聚化对神经可塑性的调控。钙成像+ ELISA+Western Blot，验证干扰肽对 Ca²⁺/cAMP/ERK 通路的阻断效果。
        2027.01-2027.06：整合体外、体内数据，撰写论文，发表文章。 
     （1）本研究前期分别构建了5-HT2AR-EGFP和OX1R-Rluc质粒，通过BRET检测出5-HT2AR与OX1R发生异源二聚化（图8a）。接着又构建了3Fg-5-HT2AR和Myc-OX1R质粒，在HEK293T细胞中过表达两种质粒，通过Co-IP发现5-HT2AR和OX1R蛋白发生结合（图8b）。通过合成Vennus1-155aa-5-HT2AR和Vennus156-239aa-OX1R两个质粒，经双分子荧光互补实验，发现5-HT2AR与OX1R在细胞中结合（图8c）。本项目又在293T细胞，小鼠海马和mPFC区域中发现5-HT2AR与OX1R在细胞膜中共定位（图8d）。综上所述，5-HT2AR与OX1R在体外可形成异源二聚体。
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图8 5-HT2AR与OX1R在体内与体外均形成异源二聚体

      （2）基于结构预测二聚化界面，合成 TAT-靶向肽段OX1R-TM1、OX1R-TM4、OX1R-TM5、OX1R-TM6和5-HT2AR-TM2、5-HT2AR-TM3、5-HT2AR-TM7，跨膜结构域衍生的合成肽的氨基酸序列如图所示（图9a）。通过BRET检测出OX1R-TM4和OX1R-TM5肽能够阻断5-HT2A与OX1R二聚化形成（图9b）。初步证明了 在OX1R-TM4和OX1R-TM5肽存在下，5-HT2A与OX1R很难形成异源二聚体。
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 图9 OX1R-TM4与OX1R-TM5抑制5-HT2AR与OX1R二聚化形成

     （3）本项目构建了小鼠CUMS抑郁症模型（图10a），通过小鼠行为学实验验证CUMS模型是否构建成功，根据开放旷场实验，悬尾实验，强迫游泳实验，糖水偏好实验以及体重测试证明其模型构建成功（图10b-f）。为了进一步验证TAT-靶向肽段的干扰作用，将OX1R-TM4和OX1R-TM5通过立体定位注射至小鼠侧脑室，提取小鼠海马蛋白，通过Western Blot结果显示，OX1R-TM4和OX1R-TM5肽能挽救由抑郁症引起的BDNF和p-CREB表达量下降这一表型（图10g）。综上所述，OX1R-TM4和OX1R-TM5肽对小鼠的抑郁样行为有改善作用。 
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图10 OX1R-TM4与OX1R-TM5肽可改善小鼠抑郁样行为
（1）实验条件
       本课题将在济宁医学院“泰山学者”实验室完成，此实验室 2012 年被山东省教育厅评为“十二五” 神经生物学重点实验室，2017年被山东省教育厅评为“十三五” 神经生物学重点实验室。实验室聚焦G蛋白偶联受体研究、神经生物学与老年疾病、行为医学三大方向，配备FRET/BRET等国际先进设备，在泰山学者陈京带领下获批省重点实验室及市创新团队。与英国华威大学共建联合实验室，承担多项国家级、省级课题，成果达国内领先或国际先进水平，发表SCI论文30余篇，科研实力突出。本实验室通过方向聚焦、技术领先、团队协同、资源整合四大优势，为项目提供从基础研究到成果落地的全周期保障，保证项目的成功率与影响力。
（2）研究人员
        本课题指导教师在过去八年（硕士和博士期间）一直从事生物研究工作，在细胞生物学专业领域中取得一定的成绩，对生化分子实验、细胞信号通路、动物模型构建以及动物实验操作有着深厚的研究基础。2023年在iScience期刊发表论文一篇，并参与国家重点研发计划项目工作，因此该指导老师能够胜任对本课题的指导工作。
本课题组负责人于2024年9月进入济宁医学院神经生物学研究所，均已熟练掌握细胞培养、Western Blot、BRET等实验技术，并跟随实验室老师学习，目前对食欲素受体、5-HT2A受体以及二聚化机理有一定了解，为本课题的实验材料准备、实验开展与数据分析等打下坚实基础。本团队由临床医学、精神医学等专业的本科生组成，依托跨学科整合优势形成互补型研究梯队。成员不仅具备扎实的医学理论基础，更通过本实验室系统化实验训练掌握了分子生物学、生物化学等核心技术，为项目的顺利实施提供了有力支撑。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 OX1R的TM跨膜肽的合成，实验所需试剂的购置 14500.00 5500.00
1. 业务费 8000.00 质粒设计测序及论文出版 5500.00 2500.00
（1）计算、分析、测试费 4500.00 引物设计合成及质粒测序 4500.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3500.00 专家外审费、 版面费 1000.00 2500.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 12000.00 实验试剂、质粒构建所需的限制性内切酶、试剂盒、实验耗材等 9000.00 3000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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