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小分子化合物MPSBT对膀胱癌的抗肿瘤作用及其机制研究

申报人：高婵婵 申报日期：2025-03-26

基本情况

2025创新项目
小分子化合物MPSBT对膀胱癌的抗肿瘤作用及其机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
膀胱癌是最常见的尿路恶行肿瘤之一。传统药物耐药性是其治疗的一大限制，开发新的药物显得十分必要。本研究旨在检测小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞增殖的影响，并探究其介导的分子机制。利用 CCK-8 实验检测 MPSBT 对膀胱癌细胞 T24、UM-UC-3 细胞增殖影响。利用 Wound Healing 实验检测 MPSBT 对膀胱癌细胞的迁移能力的影响。利用流式细胞术检测 MPSBT 对膀胱癌细胞凋亡、坏死的影响。通过高 RNA-seq 及生信分析探究 MPSBT 参与的具体的信号通路。通过结合蛋白靶点预测及分子对接，探究 MPSBT 结合的靶蛋白及二者结合方式。研究发现，MPSBT 可以抑制膀胱癌细胞的增殖和促进其坏死。MPSBT 处理细胞后，差异表达的基因主要富集于癌症及其调控相关信号通路。除此之外，MPSBT 还能够通过疏水及静电等相互作用与胰岛素受体蛋白相互结合。本研究暗示小分子化合物 MPSBT 可能通过促进坏死过程来抑制膀胱癌细胞的增殖，而这又可能是通过其作用于胰岛素受体蛋白介导癌症及其调控相关信号通路来完成的，这可能为后续开发新型的膀胱癌治疗药物提供潜在的理论依据。
第十九届“挑战杯”济宁医学院大学生课外学术科技作品竞赛、2024 大学生创新训练项目项目、2024 大学生创业训练项目
1. 主持山东省自然科学基金青年项目：磁金纳米材料介导的选 择性多聚腺苷酸化在肝癌治疗中的作用机制探究 （ZR2023QH560）； 2. 主持济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金： 基于多组学的磁金纳米材料在肝癌治疗中的作用机制探（JYHL2022MS14）
指导教师在项目开展期间提供指导，帮助团队成员不断完善研究方案，协助解决开展过程中出现的问题；指导教师提供本项目所 需的仪器设备及其操作培训。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
高婵婵 医药工程学院 制药工程（本科） 2023 细胞培养 完成体外细胞培养模型的克隆形成实验、实验记录
张荣平 医药工程学院 生物制药（本科） 2024 完成裸鼠皮下肿瘤体积及重量检测；完成MPSBT参与的信号通路验证
李存鑫 医药工程学院 制药工程（本科） 2023 完成CCK-8细胞活力检测、实验记录
段孜昊 医药工程学院 生物制药（本科） 2024 完成后期实验数据结果处理、实验记录
慕昕彤 医药工程学院 生物制药（本科） 2023 实验操作、论文撰写和细胞生物学操作

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
史兴龙 医药工程学院 否

立项依据

  根据GLOBOCAN 2022数据显示，膀胱癌（Bladder Cancer, BCa）位于所有癌症全球新增病例和死亡人数排行中的第九位，是最常见的尿路恶性肿瘤。膀胱癌作为一种高复发率的恶性肿瘤，现如今的临床治疗过程中面临手术切除不彻底、放疗以及化疗毒副作用显著及易继发转移挑战仍然存在。因此，开发一种新的治疗膀胱癌的方法来提高膀胱癌治疗效果，显得十分必要。
  近年来，利用小分子化合物开发新型肿瘤治疗策略日益受到研究者关注，其中发掘具有抑制肿瘤细胞增殖和迁移潜力的小分子是重要研究方向。噻唑类化合物作为一类具有开发前景的小分子，因其在抗菌、抗病毒等方面表现出的生物活性，已被应用于多种疾病的药物研发。在本研究中， 我们合成了一种新型噻唑类小分子化合物 MPSBT。初步实验结果显示， MPSBT 在体外模型中对多种膀胱癌细胞系可观察到增殖与迁移抑制效应，显示出潜在的抗肿瘤活性。
  此次研究旨在检测小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞增殖的影响，并探究其介导的分子机制。首先，通过CCK-8细胞活力检测探究小分子化合物MPSBT 对多种癌细胞的活性影响，发现其对膀胱癌细胞有显著的抑制作用。随后，通过体外实验（克隆形成实验、Wound Healing实验和流式细胞术）分别评估MPSBT对膀胱癌细胞（如T24、UM-UC-3）的增殖和迁移影响；接着，通过构建裸鼠皮下荷瘤模型，验证MPSBT 在体内的抗肿瘤效果。进一步结合分子对接预测潜在靶点，通过Western blot，解析MPSBT 调控的关键信号通路及候选因子。此外，还将采用高 RNA-seq 及生信分析，探究 MPSBT 参与的具体的信号通路。通过结合蛋白靶点预测及分子对接，探究 MPSBT 结合的靶蛋白及二者结合方式。本研究旨在阐明小分子化合物 MPSBT 抑制膀胱癌增殖的分子作用机制，为噻唑类小分子抗肿瘤药物的后续研发及临床应用提供理论依据与创新思路。
为了探究噻唑类小分子化合物 MPSBT的抗肿瘤机制，本团队制定了以下研究内容：
1.噻唑类小分子化合物 MPSBT 对多种细胞活性影响的检测（已完成）
  噻唑类化合物因其在抗菌、抗病毒等方面表现出的生物活性，已被应用于多种疾病的药物研发。因此本团队将聚焦在噻唑类化合物是否对其他癌细胞系有相应杀伤力的问题上，进行活力检测。依据前期实验，我们选择出噻唑类小分子化合物MPSBT作为我们主要的研究对象。我们使用CCK-8细胞计数实验（Cell Counting Kit-8，CCK-8）检测了MPSBT对多种细胞系（膀胱细胞癌细胞（UM-UC-3、T24、SW780）、人永生化表皮细胞（HaCat）、结直肠癌细胞（HT-29、SW480、RKO）以及人正常肠上皮细胞 NCM-460 细胞）活力的影响。设置对照组和MPSBT（工作浓度位 0、5、10、20、30、40 μM）与多种细胞系共同培育，统计分析采用 GraphPad Prism 8 软件。通过IC50发现，该化合物对膀胱癌的杀伤作用更为显著，且不同种类的膀胱癌细胞对MPSBT的敏感程度也不同。基于上述实验结果，我们决定将膀胱癌细胞作为主要研究对象，选取对应浓度为IC50 的小分子化合物 MPSBT对其进行探究 。

2.体外实验探究小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞增殖和迁移能力的影响（部分完成）
  （1）利用Wound Healing实验，系统探究小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞增值活力的作用。Wound Healing实验具体步骤如下：待细胞培养至适宜密度后，将细胞提前接种到ibidi四孔插件中，培养12h待细胞完全贴壁后，使用IC50 对应浓度的 MPSBT及DMSO 为对照分别处理膀胱癌细胞，并分别在0h、24h、48h时拍照，对实验结果进行数据分析。
  （2）采用克隆形成实验检测小分子化合物MPSBT 对膀胱癌细胞迁移能力的影响。待细胞培养至适宜密度后， 将结直肠癌细胞按照1000个/孔的密度接种到6孔板中，将IC50 对应浓度的 MPSBT及DMSO 分别对膀胱癌细胞进行48h的处理，然后再培养14d左右。弃去培养液，PBS润洗3次，使用4% PFA固定细胞30min，随后将细胞置于室温，用结紫染液染色细胞30 min对实验结果进行分析处理。

3.体内实验探究小分子化合物 MPSBT的药代动力学及对膀胱癌细胞增殖的影响（未完成）
  （1）为探究MPSBT在体内环境中的药代动力学，本实验计划将购买的C57BL6小鼠分为对照组、MPSBT处理组，每组3只，将等体积 PBS和MPSBT分别对小鼠口服。按照上述分组，在给药0分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时尾静脉采血，采用高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）等方法测定样品中的药物浓度，计算血药浓度-时间曲线下面积（AUC）、达峰时间（Tmax）、半衰期（T1/2）等，探究小分子化合物MPSBT在C57BL6小鼠体内的药代动力学变化。此项研究通过济宁医学院动物实验伦理审查。
  （2）为探究MPSBT体内环境中对膀胱癌细胞增殖的影响，本实验计划将购买的膀胱癌荷瘤小鼠分为对照组、MPSBT处理组，将等体积PBS和MPSBT分别对裸鼠口服。按照上述分组，每隔3天观察肿瘤形成情况，并检测瘤块的体积变化。待到21天时过量二氧化碳吸入+颈椎脱臼安乐死裸鼠。对裸鼠体重及肿瘤块称重，并计算瘤块的体积。取肿瘤组织和器官制片，然后进行Edu、Ki67、TUNEL和HE染色。上述所有实验重复三次，绘制肿瘤生长曲线，探究小分子化合物MPSBT在裸鼠体内对膀胱癌细胞成瘤能力的影响。此项研究通过济宁医学院动物实验伦理审查。

4.小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞转录调控及其机制研究（部分完成）
  带细胞培养到适应密度后，加入等体积 DMSO、MPSBT（工作浓度为IC50）分别处理 48 h，随后利用TransZol Up试剂盒裂解细胞以提取Total RNA。将裂解液邮寄至生工生物有限公司进行 RNA 提取、建库、RNA-seq 测序以及生信分析等。我们利用KEGG分析的方法，对从膀胱癌细胞中提取的RNA表达量进行分析，以此判断化合物MPSBT在膀胱癌细胞中所参与的生物学过程以及信号通路情况。
  此外，为近一步探究MPSBT直接作用的靶蛋白，我们使用 Similarity ensemble approach (SEA)和 SwissTargetPrediction 在线数据库对 MPSBT 的结合靶蛋白进行预测。然后，将二者数据库中重复出现的蛋白，认定为候选靶蛋白，用于进一步分析。最后，我们将MPSBT进行生物素化修饰，处理 膀胱癌细胞，进行Pull-down实验，进而确认靶蛋白。最后，利用 Autodock、FTmap 和 FIPSDock 软件，进行 MPSBT 与靶蛋白的分子对接，分析MPSBT与靶蛋白的结合位点和结合方式。
1.膀胱癌的现状和概述
  膀胱癌 （BLCA） 是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其特点是发病率和死亡率高[1]。GLOBOCAN 2022数据显示，在全球范围内，膀胱癌是全球第九大最常诊断的癌症，约占所有癌症病例的3.0%，其死亡率位列所有癌症相关疾病中的第十三位[2]（图1）。大约 3.0% 的新癌症诊断和 2.1% 的癌症死亡是由膀胱癌引起的[3]。根据不同的发病机制类型，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌（Non-Muscle Invasive Bladder Cancer）、肌层浸润性膀胱癌（Muscle Invasive Bladder Cancer）和转移性膀胱癌，其中非肌层浸润性膀胱癌占据新病例中的75%[2]。在大多数情况下，手术被认为是治疗膀胱癌的首选，其次是辅助化疗。然而在非浸润性或原位肿瘤患者中，5 年复发率仍高达 65%，在初始诊断时病情稍晚期的患者高达 73%[4] 。膀胱癌的发生易受多种因素影响，吸烟通常被认为是膀胱癌发展的最强危险因素。据估计，它导致了所有 BCa 病例的一半，危害程度与吸烟强度和持续时间相对应[5]。例如，根据最近的分析，烟草使用与 BCa 发病率和死亡率之间存在很强的相关性，尽管在这两种指标中，男性的相关性都大于女性[6]，此外，职业暴露于芳香胺和一些工业化学品以及慢性炎症也与膀胱癌风险有关[7]。
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                                         图1 2022 年按性别划分的膀胱癌地区特定年龄标准化发病率的条形图（图片来自GLOBOCAN 2022）

2.膀胱癌的治疗方法以及概述
  膀胱癌的治疗领域不断取得新的进展，目前，膀胱癌的治疗方案主要包括外科手术、膀胱内灌注治疗、系统化疗、放射治疗及免疫治疗等。针对不同阶段的膀胱癌可以采取不同的治疗方案。例如，经尿道膀胱肿瘤切除术 （TURBT） 是非肌层浸润性膀胱癌初始治疗的主要方法，TURBT 后膀胱内滴注化疗或免疫治疗旨在预防疾病复发和进展[8];对于肌层浸润性膀胱癌和膀胱肿瘤的晚期，临床上常用全身和腹膜内化疗、辅助放疗、光动力治疗以及靶向药物治疗以延长生存时间[9]；同时，卡介苗 （BCG） 也是膀胱癌最常见的非特异性免疫疗法[4]，通过灌注治疗对非肌层浸润性膀胱癌的完全缓解率达70%-80%。但是，最新研究表明，化疗治疗晚期膀胱癌的效果仍远未令人满意。约 44% 的患者在 TURBT 后尽管接受了化疗药物滴注，但仍出现复发或进展[10]，即使接受了整个标准疗程并忍受了所有不良反应，膀胱患者的复发率仍然不令人满意。
  对于其他治疗手段，虽然已被证明能够有效抑制肿瘤，但部分治疗手段伴随着严重的副作用。近年来，靶向程序性细胞死亡蛋白-1 （PD-1） 及其配体 （PD-L1） 的免疫检查点抑制剂 （ICI） 显著改善了转移性尿路上皮癌 （mUC） 患者的生存结局[11]，但尽管取得了这些进展，但仍有一部分患者对 ICI 无反应[12]；此外，最近的一种无放疗策略，即在新辅助化学免疫治疗后达到 cCR，然后经尿道膀胱肿瘤切除术 （TURBT） 和辅助免疫治疗，已显示出有希望的肿瘤学结果[13]。但是依旧有大约 30%-50% 的患者对新辅助治疗没有反应，而那些没有反应的个体有可能错过根治性膀胱切除术的最佳窗口[14]；免疫检查点抑制剂（如PD-L1抑制剂）的应用为晚期膀胱癌带来新希望，但可能引发免疫相关不良反应[15]。因此，找到一种新的治疗方案迫在眉睫[16]。
  随着现代精准医学的发展，小分子特异性靶点的治疗方案受到越来越多的人关注。在已经发现的热门靶点中，例如 TP53 、FGFR3 和 ARID1A ，以确定了可作的治疗靶点[17]。而针对这些分子特征开发的靶向药物展现出良好的治疗潜力：FGFR 酪氨酸激酶抑制剂厄达替尼已被批准作为 FGFR3 改变 （一种 FGFR3） 膀胱癌患者的靶向治疗[18]；Enfortumab vedotin作为Nectin-4抗体药物偶联物，可将晚期患者的生存期延长至12个月；而Sacituzumab govitecan通过靶向Trop-2抗原，在三线治疗中显示出33%的客观缓解率[19]。这些靶向药物通过阻断特定信号通路（如FGFR3/PI3K）、抑制肿瘤血管生成（VEGFR抑制剂）或诱导细胞周期阻滞等机制发挥作用。相较于传统化疗，靶向治疗展现出更高的选择性、低毒副作用，这将为改善患者生活质量提供了新选择[20]。
3.新型噻唑化合物有良好治疗效果的概述
 近几十年来，噻唑部分受到广泛关注，多篇综述文章强调了噻唑核在设计和优化新型生物活性候选药物中的重要性[21]。新型噻唑化合物因其独特的化学结构和多样的药理活性，展现出良好的治疗效果（图2），含有噻唑部分的小分子已被证明对多种疾病具有类似药物的特性[22]，尤其是在抗肿瘤、抗菌、抗炎和抗糖尿病等领域表现突出。多项研究证明，达拉非尼、达沙替尼、伊沙匹隆是临床上使用的含有噻唑核的抗癌药物的例子。含噻唑的化合物最近已被确定为多种生物靶标的潜在抑制剂，例如细胞周期（即微管抑制剂）、细胞膜酶联受体（聚合酶抑制剂）等[21] ，这些分子已显示出强大的抗癌活性和低毒性。噻唑类化合物在抗菌领域也表现出良好的潜力。研究表明，新型噻唑类药物对临床酵母菌的抗菌作用与制霉菌素（用作对照药物）相似，有时甚至更高[23]。因此，在抗真菌药领域，新研究的噻唑衍生物似乎是一组非常有前途的化合物，将来可能用于抗菌[23]。此外，Bansal等合成了几种含有吡唑部分的双噻唑衍生物，并研究了它们对恶性疟原虫的抗疟活性[24] 。
  越来越多的证据证明，新型噻唑化合物因其多样的药理活性和良好的治疗效果，成为药物研发的热点。通过结构修饰和机制研究，这些化合物在抗肿瘤、抗菌和抗炎等领域展现出广阔的应用前景。
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                                                                                图2 一些带有噻唑环的活性药物成分

参考文献

1. Wu J, Zhang F, Zheng X, Chen D, Li Z, Bi Q, Qiu X, Sun Z, Wang W: Identification of bladder cancer subtypes and predictive signature for prognosis, immune features, and immunotherapy based on immune checkpoint genes. Scientific reports 2024, 14(1):14431.
2. Siegel RL, Miller KD, Wagle NS, Jemal A: Cancer statistics, 2023. CA: a cancer journal for clinicians 2023, 73(1):17-48.
3. Richters A, Aben KKH, Kiemeney L: The global burden of urinary bladder cancer: an update. World journal of urology 2020, 38(8):1895-1904.
4. Liu J, Gao Y, Song C, Liao W, Meng L, Yang S, Xiong Y: Immunotherapeutic prospects and progress in bladder cancer. Journal of cellular and molecular medicine 2024, 28(5):e18101.
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10. Kong C, Zhang S, Lei Q, Wu S: State-of-the-Art Advances of Nanomedicine for Diagnosis and Treatment of Bladder Cancer. Biosensors 2022, 12(10).
11. Taguchi S, Kawai T, Nakagawa T, Miyakawa J, Kishitani K, Sugimoto K, Nakamura Y, Kamei J, Obinata D, Yamaguchi K et al: Improved survival in real-world patients with advanced urothelial carcinoma: A multicenter propensity score-matched cohort study comparing a period before the introduction of pembrolizumab (2003-2011) and a more recent period (2016-2020). International journal of urology : official journal of the Japanese Urological Association 2022, 29(12):1462-1469.
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16. Powles T, Bellmunt J, Comperat E, De Santis M, Huddart R, Loriot Y, Necchi A, Valderrama BP, Ravaud A, Shariat SF et al: Bladder cancer: ESMO Clinical Practice Guideline for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology 2022, 33(3):244-258.
17. Zheng L, Wang J, Han S, Zhong L, Liu Z, Li B, Zhang R, Zhou L, Zheng X, Liu Z et al: The KLF16/MYC feedback loop is a therapeutic target in bladder cancer. Journal of experimental & clinical cancer research : CR 2024, 43(1):303.
18. Ouyang Y, Ou Z, Zhong W, Yang J, Fu S, Ouyang N, Chen J, Xu L, Wu D, Qian J et al: FGFR3 Alterations in Bladder Cancer Stimulate Serine Synthesis to Induce Immune-Inert Macrophages That Suppress T-cell Recruitment and Activation. Cancer research 2023, 83(24):4030-4046.
19. Powles T, Rosenberg JE, Sonpavde GP, Loriot Y, Durán I, Lee JL, Matsubara N, Vulsteke C, Castellano D, Wu C et al: Enfortumab Vedotin in Previously Treated Advanced Urothelial Carcinoma. The New England journal of medicine 2021, 384(12):1125-1135.
20. Flaig TW, Spiess PE, Agarwal N, Bangs R, Boorjian SA, Buyyounouski MK, Downs TM, Efstathiou JA, Friedlander T, Greenberg RE et al: NCCN Guidelines Insights: Bladder Cancer, Version 5.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network : JNCCN 2018, 16(9):1041-1053.
21. Arshad MF, Alam A, Alshammari AA, Alhazza MB, Alzimam IM, Alam MA, Mustafa G, Ansari MS, Alotaibi AM, Alotaibi AA et al: Thiazole: A Versatile Standalone Moiety Contributing to the Development of Various Drugs and Biologically Active Agents. Molecules (Basel, Switzerland) 2022, 27(13).
22. Rayala R, Chaudhari P, Bunnell A, Roberts B, Chakrabarti D, Nefzi A: Parallel Synthesis of Piperazine Tethered Thiazole Compounds with Antiplasmodial Activity. International journal of molecular sciences 2023, 24(24).
23. Biernasiuk A, Berecka-Rycerz A, Gumieniczek A, Malm M, Łączkowski KZ, Szymańska J, Malm A: The newly synthesized thiazole derivatives as potential antifungal compounds against Candida albicans. Applied microbiology and biotechnology 2021, 105(16-17):6355-6367.
24. Borcea AM, Ionuț I, Crișan O, Oniga O: An Overview of the Synthesis and Antimicrobial, Antiprotozoal, and Antitumor Activity of Thiazole and Bisthiazole Derivatives. Molecules (Basel, Switzerland) 2021, 26(3).
1.立题新颖
  本项目探究一种新型噻唑类小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞的作用及其机制。发现，其在抑制膀胱癌细胞增殖和迁移方面表现出显著的活性，其差异表达的基因主要富集于癌症及其调控相关信号通路。进一步研究发现，MPSBT 还能够通过疏水及静电等相互作用与胰岛素受体蛋白相互结合。与传统抗癌药物相比，MPSBT 拥有与众不同的化学结构和作用机制。它可能通过诱导坏死过程来抑制膀胱癌细胞的增殖，而这一过程可能是通过其对胰岛素受体蛋白的作用，进而调控相关癌症信号通路来实现的，具有一定的创新之处。
2.设计创新
  本项目结合了药物化学、分子生物学、细胞生物学和生物信息学等多学科的研究方法，从不同角度深入探讨了 MPSBT 的抗肿瘤机制。除此之外，本实验不仅在细胞水平上验证了 MPSBT 的抗肿瘤效果，还通过裸鼠模型进一步探究小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞形成肿瘤能力的作用及在C57BL6小鼠体内的药代动力学变化。通过多种实验方法（如 CCK - 8、克隆形成实验、Wound Healing实验、RNA-Sep、细胞流式术等）对 MPSBT 的作用机制进行了全面的验证，确保了研究结果的系统性和完整性。
3.思路先进
  本项目通过组合生物合成策略，成功设计并合成了新型噻唑类小分子化合物 MPSBT，为抗肿瘤药物的开发提供了新的思路。通过系统的机制研究，揭示了 MPSBT 的靶点作用机制，为开发具有更高选择性和更低毒性的新型抗癌药物提供了理论支持。有望为膀胱癌的治疗提供新的选择。
1.技术路线

                                                         summernote-img                          
                                                                                 图3小分子化合物MPSBT 敏感细胞系筛选

                                                         summernote-img        
                                            图4 体外实验探究小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞增殖、迁移能力以及细胞凋亡的影响

                                                          summernote-img
                                                                          图5 体内实验探究小分子化合物MPSBT对裸鼠肿瘤增殖的影响

                                                          summernote-img                                  
                                                                     图6 探究小分子化合物MPSBT对膀胱癌杀伤作用的相关信号通路的影响

                                                           summernote-img
                                                                     图7 探究小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞杀伤的作用机制探究

2.拟解决的问题
越来越多的证据表明，噻唑类小分子化合物在癌细胞治疗方面具有极大潜能，但在其治疗中的具体分子机制尚不明确。 因此，本团队旨在选取噻唑类小分子化合物MPSBT 来探究其抗肿瘤作用和分子机制，从而设计相关项目。
（1）探究噻唑类小分子化合物MPSBT是否对细胞系有活力抑制作用？
  本项目计划先通过CCK-8细胞计数实验，初步得出噻唑类小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞系抑制效果极强，再通过克隆形成实验，以及采用不同浓度梯度给药处理，验证噻唑类化合物对膀胱癌的抑癌作用。
（2）研究噻唑类小分子化合物MPSBT能否影响膀胱癌细胞增殖和迁移能力？
  本团队使用工作浓度为IC50的MPSBT和对照组对膀胱癌细胞进行共同处理，通过Wound Healing实验和流式细胞术探究噻唑类小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞增殖能力的影响，利用克隆划痕实验，评估该化合物对细胞迁移能力的影响。
（3）探究噻唑类小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞转录调控的影响？
  我们对MPSBT（工作浓度为IC50）和对照组分别处理的细胞进行裂解 Total RNA，随后进行RNA 提取、建库、RNA-seq 测序以及生信分析，利用 KEGG 信号通路分析，研究小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞发挥其杀伤作用的癌症相关信号通路，对其惊醒抑制或激活后，进行CCK-8细胞计数实验、克隆形成、Wound Healing实验及流失细胞术等技术进一步验证其结果。
（4）预测噻唑类小分子化合物MPSBT参与调控抗膀胱癌的作用靶点并验证其信号通路？
  通过数据库，并基于噻唑类结构特点，初步预测MPSBT的可能靶点，再通过Pull-down、Western blot实验进行验证。
  2025.05-2025.12，本团队将进行第一阶段研究内容：细胞培养以及药物筛选。依据前期实验，选择噻唑类小分子化合物MPSBT作为我们主要的研究对象。我们使用CCK-8细胞计数实验检测了MPSBT对多种细胞系（膀胱细胞癌细胞（UM-UC-3、T24、SW780）、人永生化表皮细胞（HaCat）、结直肠癌细胞（HT-29、SW480、RKO）以及人正常肠上皮细胞 NCM-460 细胞）活力的影响。并通过设计工作浓度为IC50的MPSBT对膀胱癌细胞进行克隆形成、Wound Healing实验及流失细胞术等实验测定MPSBT对膀胱癌迁移和增殖能力的影响。
  2026.01-2026.06，本团队将进行第二阶段研究内容：体内动物实验验证，对购买的膀胱癌荷瘤小鼠和C57BL6小鼠分组持续给药观察肿瘤重量变化，进一步探究小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞形成肿瘤能力的作用及在C57BL6小鼠体内的药代动力学变化。
  2026.06-2026.12，本团队将进行第三阶段研究内容：小分子化合物MPSBT的抗肿瘤机制研究，从转录组学角度阐明噻唑类小分子化合物MPSBT对膀胱癌基因转录的影响。对细胞RNA-seq测序以及 KEGG 信号通路分析，以此来选出候选因子。此外，我们计划进行了 MPSBT 的结合靶蛋白预测以及二者的分子对接，进一步探究其抗膀胱癌的作用机制。
  2027.01-2027.05，本团队将进行第四阶段内容：项目总结、文章撰写和成果汇报。
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

（1）MPSBT 抑制膀胱癌细胞增殖
  小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞系中的 UM-UC-3 细胞的抑制效果极强，其 IC50 为 0.2519 μM（图8 A），显著优于其他癌细胞系，例如结直肠癌细胞 SW480 的 IC50 为 54.34 μM（图 8 B）。在小分子化合物MPSBT 具有对正常细胞的毒性较低的特点，例如人正常肠上皮细胞 NCM-460 的 IC50 为 4.723 μM 和人永生化表皮细胞 Hacat 的 IC50 为 5.801 μM（图8A、B）。综合上述结果可知，小分子化合物 MPSBT 可以抑制膀胱癌细胞增殖，并且表现出了一定的选择性。基于以上考虑，我们决定将膀胱癌细胞作为主要研究对象。 
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 图 8 小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞增殖的影响 （A）人膀胱癌移行癌细胞和人永生化表皮细胞 IC50 结果; （B）人结直肠癌细胞和人正常肠上皮细胞 IC50 结果

（2）MPSBT 抑制膀胱癌细胞迁移
  为测定小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞的迁移能力的影响，我们将不同浓度的（0 μM、IC50 对应浓度）的 MPSBT 处理细胞 0 h、24 h、48 h，并对其划痕间隙图像面积大小变化进行分析，并统计其愈合率。结果表明：对于 UM-UC-3 细胞来说，24 h 时对照组的愈合率为 55.87%，处理组的愈合率显著降低，为 38.17%；48h 对照组的愈合率为 100%，处理组的愈合率为 59.85%； 对于 UM-UC-3 细胞来说，也具有相似的变化趋势。以上结果表明 MPSBT 可以显著抑制膀胱癌细胞的迁移。   
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  图 9 小分子化合物MPSBT对膀胱癌细胞迁移的影响 （A、B）人膀胱癌移行癌细胞UM-UC-3划痕图像及愈合率统计结果；（C、D）人膀胱癌移行癌细胞T24划痕图像及愈合率统计结果（标尺：200 μm）

（3）MPSBT 促进膀胱癌细胞坏死
 为进一步探究 MPSBT 对膀胱癌细胞凋亡的影响，我们利用流式细胞仪对处理后的膀胱癌细胞进行检测。结果表明，MPSBT 处理膀胱癌细胞 48 h 后，UM-UC-3 与 T24 的细胞凋亡和坏死细胞比例之和（Q1+Q2+Q3）由 10%和 10%左右都显著增加至 100%左右，特别是坏死细胞比例发生了剧烈变化（图 10A、B）。以上结果表明，说明小分子化合物 MPSBT 对膀胱癌细胞坏死具有明显促进作用。
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             图 10 小分子化合物MPSBT膀胱癌细胞流式结果（A）膀胱癌细胞UM-UC-3流式及统计结果；（B）膀胱癌细胞T24流式统计结果

（4）MPSBT 参与癌症调控相关生物学过程
  为进一步探究，MPSBT 在膀胱癌抑制中的作用，我们对对照组和 MPSBT 处理组的细胞进行 RNA-seq测序，并进行 KEGG 信号通路分析。结果表明：与对照组相比，处理组共有 581 个基因上调，297 个基因下调（图 11A、B）。这些差异表达基因除了参与癌症直接相关信号通路外（如：Colorectal cancer、Gastric cancer、Brest cancer），还参与了多条经典的癌症调控相关信号通路（如：Hippo signaling pathway、MAPK signaling pathway、FoxO signaling pathway 、Wnt signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、RAS signaling pathway）(图11C）。以上结果暗示，小分子化合物 MPSBT 激活了膀胱癌多个重要的癌症相关信号通路，进而发挥其杀伤作用。当然，具体的信号传导作用机制还需进一步探究及验证。
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  图 11 RNA-seq测序及生信分析结果 （A,B）差异表达基因种类及数目的火山图、热图；（C）差异表达基因KEGG分析结果

（5） MPSBT 可与胰岛素受体相互作用
  为进一步解释，MPSBT 杀伤膀胱癌细胞的根本原因，我们进行了 MPSBT 的结合靶蛋白预测以及二者的分子对接。我们通过 Similarity ensemble approach (SEA)数据库和 SwissTargetPred- iction 数据库中，得到两大数据库中预测的结合蛋白，胰岛素受体蛋白为二者中唯一的共同蛋白，我们将其认定为 MPSBT 结合靶蛋白（图 12A）。我们进一步分析其结合方式，通过分子对接，可以看出 MPSBT 可以很好地占据到由Asp1150、Ala1028、Val106、Gly1082、Leu1002、Met1079、Met1139、Ala1080 和 His1081 形成的结合裂隙中的口袋中，发生疏水相互作用。MPSBT 与周围胰岛素受体蛋白残基之间存在明显的大量正电荷及负电荷。以上结果表明 MPSBT 与胰岛素受体可以通过疏水及静电相互作用牢牢结合在一起。
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  图12 MPSBT与胰岛素受体相互作用（A）SwissTargetPrediction、SEA数据库预测结果; （B）分子对接结果；（C,D）MPSBT与周围残基之间的相互作用结果
（1）已经具备的条件
  本项目主要在山东省医工智融基因药物未来产业工程研究中心、山东省重大动物疫病新兽药创制工程研究中心、济宁市医工药协同创新转化重点实验室、济宁医学院医用功能纳米材料合成及转化实验室、济宁医学院公共科研平台及动物实验中心进行，项目所需的细胞培养、酶标仪、荧光定量PCR仪、倒置显微镜、细胞培养室、动物房、台式扫描电镜、光声成像系统等关键设备都已齐备。
  济宁医学院医药工程学院研究中心占地1500平方米，实验室仪器设备1500余台/套, 总价值2500余万元。并且中心不断深化对外交流，已与美国、韩国、新加坡、马来西亚等国外实验室及数十个不同类型的国内重点实验开展合作，积极拓展知识产权转化。
（2）尚且缺少的条件及解决方法
  由于本实验室无高通量测序、单细胞制备及测序平台，所以申请者计划将构建好的RNA-seq文库以及制备好的单细胞样品送至生物科技有限公司进行高通量测序。通过样品外送测序可以解决实验室无高通量测序仪器的问题。由于申请者及其团队具有丰富的生物信息学分析的经验，因此，本项目开展过程中不存在设备上和技术上的瓶颈。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 科研经费 8300.00 11700.00
1. 业务费 5000.00 科研经费 1300.00 3700.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 送检、分析 1300.00 700.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 1000.00 注册费及差旅 0.00 1000.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 2000.00 支付版面费等 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 15000.00 购置实验材料 7000.00 8000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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