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肠道菌群与儿童免疫性血小板减少症的相关性研究

申报人:李苏熠 申报日期:2025-03-26

基本情况

2025创新项目
肠道菌群与儿童免疫性血小板减少症的相关性研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是儿童时期临床最常见的获得性出血性疾病。其年发病率约为8.4/10万,占儿童出血性疾病的25%~30%,约20%的患者病程可持续1年以上。糖皮质激素及静注人免疫球蛋白是ITP治疗的一线药物,二线治疗包括重组人血小板生成素、利妥昔单抗以及脾切除术等。尽管一线或二线治疗已被使用,复发和糖皮质激素抵抗仍然是ITP治疗中的巨大挑战,因此研究更有效的治疗方法对儿童ITP的治疗至关重要。最近人们发现肠道菌群与人类多种免疫性疾病的发生和进展之间存在重要联系,强调肠道菌群衍生的代谢产物在自身免疫性疾病中起着不可忽视的作用。本项目拟采用16SrRNA技术检测ITP患儿肠道菌群,拟探索(1)ITP患儿与健康儿童肠道菌群特征的差异。(2)经糖皮质激素和/或静脉用免疫球蛋白进行治疗后的患儿与治疗前的肠道菌群特征的差异。通过测定肠道菌群,寻寻找肠道菌群和ITP之间的相关性,筛选候选菌群,合理推测肠道菌群在ITP病因学中的作用,进一步分析ITP患儿治疗前后肠道菌群中关键菌种或菌群变化,为ITP的临床治疗手段研究提供新的思路.
1.一篇sci一作在投,一篇sci二作在投。
2.参与2024年度校级创新训练项目“基于水溶性聚噻吩衍生物的细胞中铜离子生物成像研究”
3.参与第19届山东省“挑战杯”济宁医学院大学生课外学术作品竞赛临床医学院(附属医院)院赛三等奖,作品名称:基于网络药理学和分子对接技术探讨二陈汤对小细胞癌的作用机制
4.参与第19届山东省“挑战杯”济宁医学院大学生课外学术作品竞赛,进入校赛,被校赛复赛淘汰,未进入校级决赛,作品名称:眩立停
1、主持济宁市重点研发计划项目1项 儿童免疫性血小板减少症的肠道菌群特征 在研
2、参与院级课题1项,济宁医学院附属医院主诊组项目1项。 
1、项目研究方法与规划:协助学生对项目基本研究路线及方法进行梳理,明确研究思路,制定合理的研究方案,规划好研究目标、任务与时间节点,确保项目有条不紊地推进。
2、项目成果指导:帮助学生学会运用软件进行数据分析,总结实验结论,撰写论文,及指导论文发表等。 
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
李苏熠 临床医学院(附属医院) 临床医学(本科) 2023 统筹规划项目,主要实验操作,论文撰写
张晨月 临床医学院(附属医院) 临床医学(本科) 2023 部分实验操作,医患沟通
刘可 临床医学院(附属医院) 临床医学(本科) 2023 搜集资料并撰写部分计划书

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张滕 临床医学院(附属医院)

立项依据

       免疫性血小板减少症是临床中常见的一种血液系统疾病。血小板数量和功能异常均可造成出、凝血障碍,破坏血管系统稳定性,临床表现为瘀点、紫癜、黏膜出血,以及严重的甚至危及生命的胃肠道或颅内出血[1][2]。临床中针对血小板减少症的治疗主要集中于两个方面:1.阻止血小板破坏,包括运用糖皮质激素、人免疫球蛋白以及抗CD20+单克隆抗体等治疗措施,对于经系统治疗后仍有危及生命的严重出血情况的患者,可考虑脾切除术;2.促进血小板生成,如应用重组人血小板生成素、血小板受体激动剂类药物等治疗[3][4]。近年来在临床工作中发现,相当一部分的血小板减少症患儿的治疗过程不顺利,存在病情迁延不愈及反复发作的情况[5]。这种些情况引起了儿童血液病临床工作者的高度重视,本研究旨在探究儿童患者中血小板减少症是否存在潜在的发病机制,并通过对这些机制的研究来寻找全新的治疗角度,达到缩短血小板减少症患儿病程、改善血小板减少症患儿的预后、提高现有治疗方案的治疗效果的目的。
       ITP的发病机制非常复杂且尚未研宄清楚, 涉及到感染、环境以及遗传等多种因素。ITP的发生与多种细菌和病毒感染均有密切联系。作为一个重要的环境因素,肠道微生物群是迄今为止研究过的最复杂的群落之一, 估计有1000种不同的微生物,其编码的基因数量非常庞大,功能多种多样。肠道菌群作为人体内最大的微生物群,已经和人类宿主形成了一种互利互惠的共生关系,人类宿主为肠道菌群提供碳水化合物等营养素,肠道菌群为宿主提供强化肠道完整性、肠道上皮调节、抵御病原体、脂肪代谢支持和血管生成等益处[6],因此,肠道菌群对于许多疾病具有潜在治疗价值。有研究针对急性淋巴细胞白血病易感小鼠模型的肠道菌群进行了研究,该研究表明了易感性本身可以改变小鼠胃肠道微生物群,并且通过对小鼠肠道菌群进行人为干预可以影响小鼠的发病率[7],这证明了肠道菌群构成与血液系统疾病的发生密切相关。另有研究通过外源性的补充肠道微生物的代谢物,有效地降低了血友病A的小鼠模型FVIII 抗体的免疫应答[8],由此可见,为了改善血液系统疾病的预后,可以对肠道菌群及其代谢产物进行干预,以此来降低治疗过程中不良反应的发生率。肠道菌群检测在临床研究中也有了一定的进展,已有许多临床研究研究针对急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、镰状细胞病贫血患者的肠道菌群进行分析来寻找肠道菌群在疾病的诊疗过程中存在的价值。
       本项目旨在深入剖析儿童免疫性血小板减少症与肠道菌群之间的内在联系,通过研究ITP患儿的肠道菌群特征、与健康儿童肠道菌群的差异、ITP患儿经不同治疗方案前后的肠道菌群特征的变化,探索肠道菌群失衡与ITP发病的关系,同时,进一步分析肠道菌群中关键菌种或菌群组合对ITP病情严重程度及治疗效果的影响。本项目通过可以进一步把通过恢复肠道菌群平衡作为防治ITP的一种新的策略,为临床开发基于肠道菌群调节的创新治疗手段和干预措施提供科学依据 ,提升儿童ITP的诊疗水平,降低疾病对患儿健康和生活质量的不良影响。
1. 项目目标
      本项目拟采用16SrRNA技术检测肠道菌群,拟探索:(1)本地区健康儿童的肠道菌群特征。(2)本地区ITP患儿的肠道菌群特征。(3)经糖皮质激素和/或静脉用免疫球蛋白进行治疗前后的患儿肠道菌群特征的差异。
2.一般资料
      选取2025年4月至2026年10月在济宁医学院附属医院儿科就诊的(包括住院及门诊患者),符合入组标准的40例ITP患儿及20例健康查体患儿作为研究对象。研究通过济宁医学院附属医院医学伦理委员会审查,所有入组ITP患儿家属均签署知情同意书。
3.诊断标准
      ITP患儿纳入标准:(1)符合《儿童原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南(2021版)》诊断标准:a.至少2次血常规检查示血小板计数减少(<100×109/L),外周血涂片中血细胞形态正常;b.脾脏一般不增大;c.骨髓穿刺检查结果示巨核细胞数量增多或正常,伴成熟障碍;d.排除其他继发性血小板减少症;(2)年龄小于14岁。(3)采集粪便前患者至少连续30天未服用抗生素及抗真菌药物,采集粪便前两周患者未服用微生态活菌制剂;
     健康组纳入标准:(1)年龄小于14岁的健康儿童;(2)采集粪便前患者至少连续30天未服用抗生素及抗真菌药物,采集粪便14前两周患者未服用微生态活菌制剂。
符合纳入标准的患儿,记录患儿一般临床资料:年龄、性别、血常规血小板计数结果、用药治疗情况等。所有患儿均在明确诊断后用药治疗前取粪便,快速置于-80℃冰箱保存,批量待检。治疗组患儿在经治疗后血小板计数提升至>50×109/L后再次留取粪便标本测定肠道菌群。采用16SrDNA测序方法,进行标本物种复杂度分析及组间物种差异分析。
4.治疗方法:
    4.1健康对照组:20例健康查体儿童,不必给予治疗手段,采集粪便,检测肠道菌群即可
    4.2患儿组(治疗前组):40例患儿在治疗前采集粪便,检测肠道菌群。
    4.3患儿组(治疗后组):40例患儿使用一线治疗手段糖皮质激素和/或静脉用免疫球蛋白进行治疗后,待血小板计数提升至>50×109/L后再次留取粪便标本测定肠道菌群。
5.实验室检验技术:
    5.1 DNA提取:粪便基因组提取采用天根粪便基因组DNA提取试剂盒,取提取样品的DHA1ul与Nano Drop分光光度计检测其浓度,琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
    5.2 PCR扩增建库和文库制备:16srRNA基因包括9个变异区(V1-V9)和10个保守区(C1-C10)。16srRNA基因的V3-V4区域为微生群落的分类提供了足够多的信息,采用通用引物341F和785R来扩增该区域,试验通过两轮PCR扩增进行文库构建,文库质检合格后,定量上机测序。
    5.3数据分析:进行生物信息分析。
6.统计学分析
    采用SPSS 25.0统计软件进行处理。以Alpha多样性分析单个样品中的物种多样性,用shannon指数和simpson指数反映群落的多样性,chao指数、observed otus指数和ace指数反映样品中群落的丰富度。以Beta多样性分析,比较各组间在物种多样性方面差异的大小。
    LEfSe分析为基于线性判别分析效应量的方法筛选出两组样品之间存在显著性差异的菌群。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,两组间比较采用两独立样本t检验。非正态分布计量资料以中位数(四分位数范围)表示,用秩和检验。计数资料以百分比表示,组间比较采用Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。
 
      血小板减少症的具体发病机制尚不明确,目前认为血小板减少的主要发病机 制是血小板清除增加和生成减少[9]。血小板减少症的发生与细胞免疫以及体液免疫过程密切相关。为了改善血小板减少症患儿的临床治疗效果,国内外已经开始从不同角度探 寻血小板减少症发病的潜在机制。有研究表明了:对于血小板减少症患儿进行免 疫抑制治疗前,运用维生素A、维生素C、维生素E以及硒酵母进行抗氧化治疗,相比安慰剂组,抗氧化治疗组的血小板计数的到了有效的提高,出血风险较安慰剂组显著降低[10]。
近年来,肠道菌群与疾病的关系受到了国内外的广泛重视。多种疾病的发病与肠道菌群的丰富度降低有关,有研究表明脓毒症患者的肠 道菌群丰富度的显著降低[11]。该研究还发现,在脓毒血症患者的肠道菌群构成 中,致病菌的丰富度呈现上升趋势,有观点认为该改变是因为某些微生物群组成的变化使患者倾向于免疫抑制状态[12]。肠道菌群丰富度降低导致免疫失调的机制 可能与短链脂肪酸的代谢水平相关。短链脂肪酸是主要存在于肠道中的饱和脂肪酸,如乙酸、丙酸和丁酸,在肠道的正常生理功能中起到了屏障作用。短链脂肪 酸可有效降低致病菌脂多糖引发的肠道炎症反应,并且肠道菌群还可以通过调节 肠道微生物群来使其发挥免疫调节作用,起到抑制促炎细胞因子(如TNF-α、IL 1β、IL-6、IL-8)的产生,增强IL-10的表达,激活调节性T细胞等[13]。因此,肠道微生物群多样性以及产生短链脂肪酸的菌群的相对丰度对于短链脂肪酸发挥作用起着决定性的作用[14]。于此同时,有研究为了探究人外周血单核细胞的免疫调节作用,将其暴露于不同浓度的单个短链脂肪酸或其乙酸盐,丙酸盐和丁酸盐 的混合物中。结果显示,经短链脂肪酸诱导的细胞的IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17 和IL-21 水平显著降低, IL-23和TGF-β1水平略有降低[15]。有研究表明,血小 板减少症患者体内IL-23、IL-17表达显著升高,提示IL-23、IL-17在血小板减少 症的发病中起重要作用[16],血小板减少症患者体内也出现了一定程度的调节性T 淋巴细胞失衡[17]。因此,血小板减少症发病可能与肠道菌群失调导致的免疫失衡 相关。
      国内目前已有许多针对成人血小板减少症患者的肠道菌群进行分析的研究。其中,Zhang, X等人的研究显示,浙江地区血小板减少症组患者肠道菌群拟杆菌门丰富度较健康人群降低,同时,乳杆菌及链球菌呈现富集的趋势[18]。Wang, Y 等人的研究了北京地区血小板减少症组患者肠道菌群构成,提示了血小板减少症 患者的肠道微生物丰富度及多样性降低,瘤胃球菌以及双歧杆菌的丰度显著增加 [19]。Liu, Y 针对上海地区患者的肠道菌群进行分析,结果提示厚壁菌门丰富度具 有减少的趋势,而拟杆菌的丰富度具有升高的趋势[20]。上述结果均表明了,国内 各个地区血小板减少症的成年患者与该地区健康人群相比,肠道菌群均发生了显 著的改变。但是,当前国内外鲜有针对血小板减少症儿童患者的肠道菌群分析。 

参考文献
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[3]中国儿童原发性免疫性血小板减少症诊断与治疗指南改编工作组,中华医学会 儿科学分会血液学组,中华儿科杂志编辑委员会. 中国儿童原发性免疫性血小板 减少症诊断与治疗改编指南(2021版)[J]. 中华儿科杂志,2021,10:810-819.
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[20] Liu, Y; Li, Z; Wu, Y; et al.Intestinal Bacteria Encapsulated by Biomaterials Enhance Immunotherapy.[J].Front Immunol.2020,11():620170
 
      儿童是血小板减少症的高发人群之一,多数儿童患者表现为急性发病,但临床工作中,许多患儿表现出了治疗效果欠佳,病程延长,停止治疗后不能维持病情缓解状态,或病情缓解后短期内出现反复发作等情况。因此,临床上需要寻找血小板减少症患儿出现免疫异常的原因,并针对患儿具体情况展开个体化治疗;针对急性发病的血小板减少症患儿,也应寻找合理的辅助治疗方案来改善患儿预后,降低急性发病患儿病情迁延不愈或反复发作的风险。目前国内外鲜有针对血小板减少症儿童患者的肠道菌群方面研究,本研究通过对儿童患者肠道菌群进行具体分析,为血小板减少症患儿的辅助治疗提供新思路。
      在初步了解到血小板减少症患儿病程中肠道菌群的改变趋势后,可以设计进一步的临床干预性研究,可以尝试通过口服活菌制剂,进行粪便移植等辅助治疗来恢复肠道菌群丰度以改善失衡的细胞免疫过程,从而改善血小板减少症患儿的病情,降低血小板减少症高风险人群的发病风险。 
1.技术路线
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2.拟解决的问题
      本研究通过对健康儿童及ITP患者肠道菌群进行具体分析,为ITP患儿的辅助治疗提供新思路。 
3.预期成果
     通过ITP患儿和正常儿童肠道菌群的特征对比,然后有望通过添加益生菌的方式来协助IITP患儿的治疗。
第1阶段:选择符合要求的健康及ITP患儿病例,收集临床资料、大便标本(2025年4月至2026年4月)置于-80℃冰箱批量待检,标本收集完成后,利用16SrDNA技术对大便标本进行检测并进行生信分析、数据统计。
第2阶段:资料汇总并统计(2026年4月至2026年7月)。
第3阶段:查阅文献、撰写论文(2026年7月至2026年9月) 
老师经验丰富,主持济宁市重点研发计划项目1项 儿童免疫性血小板减少症的肠道菌群特征 在研;参与院级课题1项,济宁医学院附属医院主诊组项目1项。指导老师为儿科临床医师,具有丰富的临床经验,熟练掌握儿童ITP的诊断和治疗技术;熟练掌握16SrRNA技术,有成熟的试验流程,可对肠道菌群进行准确检测;有专业的研究员对检测结果进行生物信息分析和数据统计。
 已具备的条件
    1、样本量丰富:济宁医学院附属医院为鲁西南区域医疗中心,为三级甲等综合医院,儿科病人数量大,为本课题研究提供了足够大的样本量。
    2、技术平台与硬件设施完善:项目申请人所在的近年来济宁医学院附属医院中心实验室已承担多项国家自然科学基金、山东省自然科学基金、山东省卫生厅等课题研究,在组织管理、课题研究、数据分析及撰稿投稿方面也储备了充足的经验,为本研究提供科学保障。
    3、项目组成员组成合理:指导老师为儿科临床医师,具有丰富的临床经验,熟练掌握儿童ITP的诊断和治疗技术;熟练掌握16SrRNA技术,有成熟的试验流程,可对肠道菌群进行准确检测;有专业的研究员对检测结果进行生物信息分析和数据统计。
    4、组内成员优秀,有SCI在投,参与过挑战杯,大创,医学实验创新大赛,三创赛等多项比赛。
项目实施风险及应对措施:项目实施过程中最大的风险是出血的风险。应对措施:
    1、对患儿家属进行相关出血风险宣教,尽量卧床休息,避免外伤;进食以软食为主,避免坚硬食物造成消化道出血;

    2、对于就诊时血小板计数<20×109/L时,入院时即完善血型+抗筛、输血前筛查,为紧急输血时节约时间;
    3、皮肤出血是基本可自行吸收;鼻出血时,可给与压迫止血,若出血不易停止时,可联系耳鼻喉科协助给与鼻腔填塞凡士林纱布条止血;
    4、对于出现重要脏器出血,如颅内出血等表现时,立即联系输血科,紧急输注血小板,必要时请其他科室协助手术止血。 
      

经费预算

开支科目 预算经费(元) 主要用途 阶段下达经费计划(元)
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 5000.00 样品检测试剂盒的购买 2000.00 3000.00
1. 业务费 1000.00 版面费 0.00 1000.00
(1)计算、分析、测试费 0.00 0.00 0.00
(2)能源动力费 0.00 0.00 0.00
(3)会议、差旅费 0.00 0.00 0.00
(4)文献检索费 0.00 0.00 0.00
(5)论文出版费 1000.00 论文出版费 0.00 1000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 0.00 0.00
4. 材料费 4000.00 购买试剂盒 2000.00 2000.00
结束