1) 缺血性脑卒中
脑卒中是人类疾病中致死、致残的首要病因，随着人口老龄化加剧和城市化进程的不断推进，我国脑卒中疾病的发生率呈爆发式增长的趋势。据统计，缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)患者约占全部脑卒中患者的80%。2018
年两项临床研究将机械取栓的时间窗扩展至 16-24 h，通过血管内治疗恢复脑血流是缺血性卒中主要的治疗手段。然而，缺血性卒中即使恢复了脑血流，梗死依然可以继续增长，这主要归因于脑缺血再灌注损伤 (Cerebral ischemia reperfusioninjury，CIRI)。CIRI会引起能量生成障碍、氧化应激损伤、线粒体损伤、钙超载、酸中毒、神经毒性氨基酸损伤、氧自由基（ROS）堆积以及炎症反应过度激活，导致脑细胞水肿，神经元损伤、坏死甚至凋亡，最终造成脑功能障碍甚至脑死亡，同时血脑屏障（BBB）微结构也受到损坏。脑缺血的治疗可涉及很多方面，如炎症反应、细胞凋亡、自噬、血脑屏障完整性、血管再生、突触再生、髓鞘修复、神经再生等。脑缺血发生后，缺血核心区严重灌注不足导致细胞代谢、能量供应和和离子稳态破坏，致使细胞在几分钟内失去完整性，导致细胞和组织的急性坏死，在缺血半影区中，侧支血管维持残留灌注，防止组织和细胞结构立即崩解，促进缺血半影区内细胞延迟死亡和神经发生是目前我们可研究的一大靶点。Wnt/β-catenin通路广泛参与脑血管内皮细胞、星形胶质细胞炎症表型转化，并参与神经元增殖分化与中枢神经系统构建，从而促进神经功能的恢复，有望成为治疗脑卒中的关键环节。
2) Wnt/β-catenin通路
Wnt基因编码一组保守的糖蛋白，调控出生后动物的早期发育、细胞增殖和分化以及组织再生，Wnt常与β环形蛋白（β-catenin）信号相耦联，调节细胞增殖，被称为细胞增殖的主要调节剂。Wnt/β-catenin信号通路主要包括Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受体蛋白Dishevelled、糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3,GSK3β）、APC基因、Axin、β-catenin及T细胞因子4(T-cell factor 4,TCF4）/淋巴增强因子家族转录调节因子，这些蛋白构成Wnt通路共同参与中枢神经系统的发育。Wnt/β-catenin通路细胞外信号主要由Wnt蛋白介导，包括Wnt3a、Wnt1和Wnt5a等。细胞膜受体主要为Frizzled蛋白（FZD）和低密度脂蛋白相关受体5/6（LRP5/6）。下游相关因子包括β-catenin、3β（GSK-3β）、体轴抑制因子（AXIN）、和酪蛋白激酶I（CK1）等。其中核内作用物包括TCF/LEF家族成员和β-catenin下游靶基因。激活受体FZD后可抑制GSK-3β与CK-1α双重诱导β-catenin蛋白磷酸化标记从而进行后续泛素化降解的作用，使其入核结合TCF因子进而调控细胞生理反应，此通路可以对中枢神经系统和脑血管循环系统进行双向的广泛调节，而脑血管疾病也在很大程度上影响中枢神经系统的功能。
① Wnt/β-catenin通路促进血管新生
血管新生是指新血管从已有血管网络中生成的过程，血管新生可以改善局部血液供应，促进受损脑组织的修复和神经功能的恢复。在血管发育过程中Wnt信号通路是关键调控系统之一。众多Wnt配体参与调控血管内皮细胞的功能发生和稳态维持，例如Wnt1可增加毛细血管的稳定性、促进细胞的体外增殖，Wnt3a可诱导细胞的增殖、分化和迁移等过程。VEGF在胚胎发育起始阶段调控血管生成和血管通透性，病理情况下起着刺激血管内皮细胞增殖和诱导新生血管生成的作用。Wnt信号通路是VEGF的主要调节剂，通过与VEGF中经典Wnt信号通路的TCF位点结合发挥作用，且β-catenin/ TCF复合物还可介导IL-8和基质金属蛋白酶的转录，共同参与调节血管生成。可见，Wnt信号通路是血管生成的重要调节因素，其缺失或突变会影响血管生成。
② Wnt/β-catenin通路促进内皮细胞增值
中枢神经系统(central nervous system，CNS)血管新生是内皮细胞(endothelial cell， ECs)增生、迁移以及再塑、成熟的过程，而Wnt信号通路在其中起到重要调控作用。研究发现，CNS血管的ECs膜主要表达Fzd4、Fzd6和Fzd8，其中Fzd6表达尤高，阻断Fzd受体会出现CNS血管发育异常。体外实验继而证实了Wnt配体(包括Wnt1，Wnt3，Wnt5a、Wnt7a和Wnt7b)在诱导CNS的ECs增殖(和/或迁移)中的重要作用。研究发现，胚胎期脑组织和脊髓可以产生Wnt7a和Wnt7b，在内皮中能够通过激活经典Wnt信号通路促进血管新生和BBB的形成；联合剔除神经上皮Wnt7a和Wnt7b导致CNS的血管发生无法正常进行，且会发生动脉出血。
③ Wnt/β-catenin通路降低氧化应激
由于脑血管阻塞导致缺血性脑卒中的发生，进而造成神经组织损伤及神经元细胞凋亡，这是导致中枢神经系统疾病的巨大诱因之一。中枢系统损伤激活Wnt/β-catenin通路，此通路也参与脑缺血再灌注损伤过程。Wnt/β-catenin信号通路由于其众多的上下游作用因子，进而交叉影响形成复杂的网络架构，因此可通过不同的通路内作用因子的调控进行脑卒中治疗机制的研究。关于β-catenin在缺血性脑损伤中的作用机制尚未完全明确，有待进一步研究证实。
④ Wnt/β-catenin通路抑制炎症反应
研究表明，缺血性脑损伤后海马神经元氧化应激与凋亡和Wnt2B诱导的Wnt/β-catenin有关，同时，抑制Wnt/β-catenin通路也可减轻大鼠慢性炎性疼痛。缺血性脑卒中发生后，脑组织细胞、血源性炎症细胞等均会参与炎症反应，胶质细胞也可在缺血性脑卒中发生后数分钟内转化成巨噬细胞，产生炎症介质与细胞毒性因子，加重神经细胞损伤。通过抑制β-catenin与TCF结合，从而调控巨噬细胞极化及其抗炎性，有利于缺血性脑损伤后的恢复。近年来又有研究表明，鼻内注射Wnt-3a可以改善缺血性脑损伤中小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞的毒性反应。
⑤ Wnt/β-catenin通路抗神经细胞凋亡
细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，也是缺血性脑卒中的主要病理反应。细胞凋亡与神经元损伤、炎症反应以及BBB破坏密切相关。凋亡不仅限于缺血核心区，也会在缺血边缘区发生，这是决定卒中后神经功能恢复程度的重要因素之一。HUANG等通过SH-SY5Y细胞系构建了OGD/R细胞模型，检测Wnt/β-Catenin信号通路的关键分子和下游基因的表达水平，以及线粒体功能和神经元凋亡水平，结果表明OGD/R处理抑制了Wnt/β-Catenin信号通路的激活，降低了下游靶基因的表达。此外，还发现OGD/R处理诱导ATP产生减少和ROS产生增加，加重神经元凋亡。有大量研究证实，靶向调节β-catenin表达量可以调控细胞凋亡、 氧化应激及炎性因子水平（bcl-2、凋亡相关因子caspase3/9等），以及修复线粒体缺氧后损伤，这不仅在控制癌细胞增殖、浸染、分化等方面有意义，更在神经细胞损伤修复中有巨大参考价值。
⑥ Wnt/β-catenin通路促进神经发生
在脑缺血期，lncRNA MEG和过氧亚硝酸盐的合成升高。高度表达的lncRNA MEG阻碍了Wnt/β-catenin信号通路的激活。相反，过氧亚硝酸盐水平的增加会激活Wnt/β-catenin信号通路。在脑I/R的后期，Wnt/β-catenin信号通路的激活在促进神经发生中起着至关重要的作用。山苦茶、鞣花酸和姜黄素增强Wnt/β-catenin信号传导的激活，从而促进神经发生并发挥对脑缺血或I/R损伤的治疗作用。
⑦ Wnt/β-catenin通路促进血脑屏障塑形
Wnt信号在调控BBB的完整性中起到重要作用。研究表明，Wnt蛋白不但存在于血管中，还存在于BBB中，是参与脑血管新生和BBB分化的重要调节介质。Wnt配体Wnt3a/Wnt7a/b以及β-catenin都能够提高闭合蛋白3(Claudin3)
的表达。Claudins(脑中主要为Claudin3、Claudin5和Claudin 12)
是紧密连接(TJ)的胞外结构之一，而TJ是BBB完整性的主要标志。
3) 食欲素-A（OXA）
食欲素（Orexin），也称下丘脑分泌素（Hcrts），是由下丘脑外侧（LH）产生的单一前体衍生的两种兴奋性神经肽激素：食欲素A(orexin-A）和食欲素B(Orexin-B)，1988年首次被发现，因能够增加食欲而命名。食欲素-1受体（OX1R）和食欲素-2受体（OX2R）是目前已知的两种与食欲素相结合的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR），食欲素A是一种由下丘脑外侧区神经元分泌产生的前体蛋白原加工修饰而成的单体神经肽，其直接受体目前发现有OX1R和OX2R，研究表明食欲素A与受体结合后对脑I/R损伤后神经损伤有显著的保护作用。下丘脑食欲素神经元投射被认为是自主神经功能状态依赖性（睡眠－清醒）调节的基础，并且能够增加交感神经活性、加快心率和升高血压，因此食欲素系统的过度激活可直接导致高血压的发生。食欲素A在缺血性脑卒中、发作性睡病、抑郁症、阿尔茨海默病等神经系统相关疾病的发病过程中也发挥重要的神经保护作用。李等人证实，H2O2氧化损伤后，食欲素可通过增强HT-22细胞内Nrf 2的表达水平从而降低引起的神经损伤。也可通过调节各种炎症反应相关因子例如caspaes-3、bcl-2等，这于前面提到的Wnt/β-catenin通路参与炎症反应、细胞凋亡的作用不谋而合。除此之外，食欲素A还可通过抑制内质网应激与神经元过度自噬减轻细胞凋亡。有研究证实，食欲素A可上调β-catenin、TCF-1表达量，从而实现神经细胞的保护和分化作用，但其中具体的机制并不明确，因此需要进一步深究。
综上所述，我们提出以下假说（图2）：Orexin-A/OX1R系统通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制脑I/R损伤中炎症反应和细胞凋亡，促进血管新生和神经元存活，改善行为学和认知功能，从而达到治疗脑卒中的目的。本研究在前期研究的基础上，以人脑微血管内皮细胞的OGD/R模型 为体外模型，大鼠MACO模型为体内模型，探讨 Orexin-A/OX1R系统如何通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制神经细胞的凋亡和炎症反应，促进血管新生和细胞活力，减轻或恢复神经组织损伤，改善神经功能的作用，以验证我们的假说。本课题为探索延缓或阻止 脑缺血再灌注神经损伤提供有效策略，为探寻新的药物靶点和新的治疗策略提供实验依据。
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