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Nrf2-PCC通路调控心肌缺血再灌注损伤中细胞代谢与氧化应激机制研究

申报人：谢永芳 申报日期：2025-03-26

基本情况

2025创新项目
Nrf2-PCC通路调控心肌缺血再灌注损伤中细胞代谢与氧化应激机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生自主选题
二年期
本项目聚焦核因子E2相关因子2（Nrf2）对丙酰辅酶A羧化酶（PCC）的转录调控机制及其在心肌氧化应激损伤中的保护作用。前期离体心肌灌流实验发现，缺氧可导致心肌组织内丙酰辅酶A异常累积，且其浓度与缺氧时间呈显著正相关。同时，丙酰辅酶A的代谢障碍也会导致心肌ROS增加，基于此，本研究创新性地提出“Nrf2-PCC通路”调控假说：Nrf2可能通过调控PCC参与心肌缺血再灌注的代谢重构，减轻氧化应激。研究将通过生物信息学深度挖掘Nrf2与PCC的调控网络，采用双荧光素酶报告系统解析Nrf2对PCC启动子的直接调控作用，并建立心肌细胞缺氧/复氧模型和小鼠IRI模型，通过基因干预手段阐明该通路在心肌缺血再灌注损伤模型中的动态变化。旨在阐明Nrf2-PCC通路维持心肌细胞功能稳态的分子机制，为IRI防治提供新靶点。
本人具备扎实的科研实践能力，曾利用课余时间在实验室系统学习并掌握了分子生物学实验技术，积累了丰富的实验操作经验。作为核心成员参与大学生创新创业大赛，并获得省级奖项；同时，以团队成员身份在第十八届“挑战杯”济宁医学院大学生课外学术科技作品竞赛中取得优异成绩。
承担济宁市重点研发计划项目1项，山东省医药卫生科技项目1项。
可以提供实验室及相关的设备可以完成本项目。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
谢永芳 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 数据分析整理，撰写申报书，对接工作，设计实验修改申报书，绘图等
张婷婷 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 动物实验、数据整理
易茗婧 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 查阅文献、动物实验
亓相群 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 查阅文献、分子生物学实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
朱苏红 基础医学院 否

立项依据

1. Nrf2通过转录调控PCC影响心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究
本研究旨在系统解析核因子E2相关因子2（Nrf2）对丙酰辅酶A羧化酶（PCC）的转录调控机制，阐明其在心肌缺血再灌注损伤（IRI）中的作用。通过生物信息学分析，预测Nrf2与PCC启动子区域的潜在结合位点，并结合双荧光素酶报告系统实验，验证Nrf2对PCC转录活性的直接调控作用。这一研究将为揭示Nrf2-PCC通路的分子机制提供关键的实验依据，并为理解Nrf2在心肌代谢调控中的功能奠定理论基础。
2.探索Nrf2-PCC通路在心肌氧化应激（ROS)损伤中的保护作用
前期研究表明，缺氧应激可诱导心肌组织内丙酰辅酶A的异常累积，且其浓度与缺氧时间呈显著正相关。基于此，本研究将通过构建心肌细胞缺氧/复氧模型及小鼠IRI模型，系统评估Nrf2-PCC通路在减轻心肌氧化应激损伤中的作用。重点探讨Nrf2通过调控PCC表达，促进丙酰辅酶A代谢，从而维持心肌能量稳态的分子机制，为心肌氧化应激损伤的防治提供新的理论依据。
3.揭示丙酰辅酶A代谢失衡对心肌能量稳态的影响
丙酰辅酶A代谢失衡可能通过干扰三羧酸循环（TCA）影响心肌细胞的能量供应。本研究将采用代谢组学技术，全面分析丙酰辅酶A代谢在心肌IRI中的病理生理学意义，并深入探讨其通过回补反应途径增强心肌能量代谢的潜在机制。研究结果将揭示丙酰辅酶A代谢在心肌能量稳态调控中的关键作用，为心肌IRI的代谢干预提供新的科学依据。
4.为心肌IRI的防治提供新靶点及促进相关心血管疾病研究发展
本研究将通过基因或药物干预手段（如Nrf2过表达或敲减、PCC调控等），动态解析Nrf2-PCC通路在病理条件下的变化规律，明确其在心肌IRI中的保护作用。研究结果不仅为心肌IRI的防治提供新的分子靶点和治疗策略，还将通过氧化应激机制，为相关心血管疾病（如心力衰竭、心肌病等）的机制研究开辟跨学科视角。
1.通过生物信息学分析，预测Nrf2与PCC启动子区域的潜在结合位点，构建荧光素酶报告基因载体，验证Nrf2对PCC转录活性的直接调控作用，并进一步探讨其在心肌细胞缺氧/复氧模型中的功能。
1.1通过NCBI数据库获取PCCB基因的启动子区域序列，并利用Ensemble数据库分析其保守性和功能区域。
1.2使用Jaspar数据库中的转录因子结合位点预测工具，筛选Nrf2在PCCB启动子区域的可能结合位点。
1.3结合生物信息学分析结果，设计包含预测结合位点的PCCB启动子荧光素酶报告基因载体，为后续实验验证提供理论依据。
1.4构建包含预测结合位点的PCCB启动子荧光素酶报告基因载体；将报告基因载体与Nrf2表达载体共转染至心肌细胞，检测荧光素酶活性变化，明确Nrf2对PCCB启动子的调控效应。
2.Nrf2-PCC通路在心肌氧化应激（ROS）损伤中的保护作用研究
2.1构建心肌细胞缺氧/复氧模型，检测Nrf2和PCC表达水平的变化，评估其对活性氧（ROS）积累、细胞损伤及能量代谢的影响。
2.2建立小鼠心肌IRI模型，通过心功能检测、组织病理学分析及氧化应激标志物（如MDA、SOD、GSH/GSSG）的测定，评估Nrf2-PCC通路对心肌氧化应激损伤的保护作用。
2.3通过基因干预手段（如Nrf2过表达或敲减、PCC调控），明确Nrf2通过调控PCC表达促进丙酰辅酶A代谢，从而维持心肌能量稳态的分子机制。本研究将采用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术优化 PCC 基因的敲除与过表达策略： PCC 基因敲除通过设计靶向 PCC 基因的特异性 gRNA 序列，构建 CRISPR-Cas9 质粒转染心肌细胞，筛选稳定敲除细胞系。通过 Western blot 和 qPCR 验证 PCC 表达沉默，并检测其对心肌能量代谢（ATP/AMP/CP）和氧化应激（ROS、MDA）的影响。 PCC 基因的过表达利用构建 PCC 过表达载体，转染心肌细胞后通过 Western blot 和 qPCR 确认表达水平，进一步分析 PCC 过表达对 Nrf2 通路活性、丙酰辅酶A代谢及细胞存活率的作用。
3.丙酰辅酶A代谢失衡对心肌能量稳态的影响研究
3.1利用代谢组学分析，检测心肌细胞和小鼠心肌组织中丙酰辅酶A及其代谢产物的动态变化，揭示其在心肌IRI中的代谢特征。
3.2探讨丙酰辅酶A代谢通过回补反应途径对三羧酸循环的贡献，评估其对心肌能量代谢的影响。
3.3通过干预丙酰辅酶A代谢关键酶（如PCC），验证其在维持心肌能量稳态中的作用。
4.Nrf2-PCC通路在心肌IRI防治中的应用及跨学科研究拓展
4.1筛选并验证能够特异性激活Nrf2或调控PCC表达的小分子化合物，评估其对心肌IRI的治疗潜力。
4.2通过氧化应激机制，探讨Nrf2-PCC通路在代谢相关性心血管疾病（如心力衰竭、心肌病等）中的潜在作用。
4.3结合临床样本分析，验证Nrf2-PCC通路在人类心血管疾病中的表达特征及其临床意义。
5.丙酸预处理通过增加心肌能量供应减轻心肌IRI的机制研究
5.1离体实验
使用复苏后正常培养3-5代的HL-1心肌细胞。首先构建PCC shRNA和PCC过表达慢病毒质粒，通过病毒转染细胞，36小时后通过荧光显微镜观察感染效率，并通过Western blot验证PCC基因敲减和过表达的效果。对细胞进行1天的丙酸预处理后，进行缺氧/复氧处理。检测细胞活力及乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）、肌钙蛋白T（Troponin T，TnT）等损伤标志物，评估心肌细胞损伤程度。测定心肌细胞中HNE、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（Glutathione/oxidized glutathione，GSH/GSSG）水平，评估氧化应激水平。验证PCC在丙酸预处理减轻心肌IRI氧化应激中的作用。
5.2在体实验
选取健康SPF小鼠作为研究对象，给予丙酸进行为期3天的预处理。预处理完成后，采用经典方法构建小鼠心肌IRI模型。运用心导管技术精确测量小鼠血流动力学参数，以此直观反映丙酸预处理对小鼠心功能的影响。对心肌组织进行取材，检测其中TnT、LDH含量，同时测定MDA、SOD活性以及GSH/GSSG比值，通过这些指标量化心肌损伤程度及氧化应激水平。此外，对心肌组织进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色，从组织形态学层面观察心肌损伤状况。利用Western blot技术，检测心肌组织中Nrf2、PCC、HNE的表达水平，进而评估心肌丙酸代谢通路的活性。通过上述系列实验，从整体动物水平全面剖析丙酸预处理上调PCC、增强心肌抗氧化能力、减轻心肌IRI的内在机制。
6.解析Nrf2在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用及其通过调控PCC表达减轻氧化应激损伤的分子机制
6.1离体实验
采用HL-1心肌细胞作为离体实验模型，分为三组：对照组、富马酸二甲酯（DMF）处理组和过氧化氢（H₂O₂）组，对细胞进行24小时DMF预处理，建立缺氧/复氧模型，模拟心肌缺血再灌注损伤。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，结合乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和肌钙蛋白T（TnT）含量测定，评估心肌细胞损伤程度。进一步采用荧光探针（DCFH-DA）检测细胞内活性氧（ROS）水平，并通过生化方法测定4-羟基壬烯醛（HNE）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）水平，全面评估氧化应激状态。利用Western blot技术检测Nrf2、PCC及HNE的表达水平，阐明Nrf2-PCC通路的活性变化。论述Nrf2通过调控PCC表达显著减轻心肌细胞氧化应激损伤，为Nrf2-PCC通路的分子机制提供了离体水平的实验依据。
6.2在体实验
以健康SPF小鼠为模型，评估富马酸二甲酯预处理对心肌缺血再灌注损伤（IRI）的保护作用及其机制。分为三组：对照组、DMF处理组和心肌IRI模型组。DMF处理组小鼠接受DMF灌胃预处理3天，构建心肌IRI模型（结扎左前降支冠状动脉30分钟，恢复血流再灌注120分钟）；对照组仅进行假手术。通过超声心动图检测心功能参数（左心室射血分数LVEF和左心室短轴缩短率LVFS），评估DMF对心功能的影响。取心肌组织进行蛋白质和RNA提取，利用Western blot和qPCR检测Nrf2、PCC及HNE的表达水平。采用苏木精-伊红染色和TUNEL染色评估心肌组织损伤和细胞凋亡的情况。进一步测定LDH、TnT、MDA、SOD及GSH/GSSG的水平，量化氧化应激状态。此外，通过代谢组学技术检测ATP、AMP及CP含量，评估能量代谢状态。阐明DMF通过激活Nrf2-PCC通路显著减轻心肌氧化应激损伤，改善心功能，为Nrf2-PCC通路的分子机制提供实验依据。
1.国内外研究现状：
国外研究方面，自缺血预处理的心肌保护效应被发现以来，近年研究揭示了代谢重编程在再灌注损伤调控中的核心作用。Davidson等[1]发表共识指出，靶向能量代谢通路（如琥珀酸积累抑制）可减少再灌注后活性氧爆发，为心肌保护提供了新范式。研究者们已揭示了多种内源性保护介质（如腺苷、缓激肽、前列环素和一氧化氮等）通过蛋白激酶C、MAPK等多条信号通路发挥保护作用的机制[2, 3]。近年来，国外学者开始关注肠道菌群代谢物在心血管疾病中的作用，特别是短链脂肪酸（SCFAs）的保护机制。研究表明，丙酸可通过GPR41受体调节AngII水平减轻心肌IRI[4]，并通过回补反应为心肌提供能量[5]。在代谢性心脏病[6]和心衰小鼠模型[7]中，丁酸补充显示出显著的心肌保护作用。
2.国外发展动态：
国外最新研究动态显示，丙酸代谢通路与氧化应激的关系备受关注。研究表明，HNE-丙酰辅酶A代谢通路是心脏清除脂质过氧化产物的重要途径[8]。在PCC基因缺失模型中观察到线粒体能量代谢降低和氧化应激增加[9]，提示丙酸代谢通路在维持心肌能量稳态中的关键作用。研究证实再灌注早期（<15min）是靶向NRF2通路的黄金窗口，但其单剂给药模式难以满足持续保护需求[10]。在全球范围内，Nrf2激活剂的临床应用和研究已取得一些重要进展。Omaveloxolone作为一种Nrf2激活剂，在治疗亨特综合征、心力衰竭等代谢性疾病中取得了显著效果。近期一项临床试验表明，Omaveloxolone在心力衰竭患者中的使用，能够显著改善左心室功能，减轻氧化应激和炎症反应[11]。此外，丙酸通过Nrf2信号通路减轻氧化应激的机制在血脑屏障内皮细胞中得到证实[12]，通过这些国外案例的最新成果，本研究将进一步探索Nrf2-PCC通路在心肌缺血再灌注损伤中的作用，填补当前针对该通路临床转化应用的空白。
3.国内研究动态：
在国内，关于Nrf2在代谢性疾病中的作用机制研究逐渐受到重视。近年来，国内学者在Nrf2调控代谢和抗氧化反应方面取得了一系列进展。核因子E2相关因子2(Nrf2)作为抗氧化应激的核心转录因子，其靶向治疗策略在多种疾病领域的临床转化取得显著进展。2024年5月，华中科技大学同济医院李锋教授团队在《Cell Metabolism》发表突破性研究，报道新型Nrf2激活剂Bitopertin通过调控铁代谢和鸟氨酸途径，显著抑制破骨细胞分化，降低骨质疏松模型骨流失率达40%以上，首次揭示Nrf2-Slc40a1-铁代谢轴与Odc1-鸟氨酸通路在疾病调控中的耦联作用，为代谢-氧化应激交互研究提供新范式[13]。例如，有研究发现Nrf2在调节脂肪代谢和能量平衡中发挥重要作用[14]。如Nrf2通过激活抗氧化酶的表达，增强细胞的抗氧化能力，从而促进脂肪分解。此外，国内研究还关注到Nrf2在心血管疾病中的保护作用，Nrf2激活剂的临床转化仍面临严峻挑战，尤其是在氧化应激相关的心脏损伤中[15]。例如Nrf2能够激活一碳代谢，促进丝氨酸和甘氨酸的合成，从而支持谷胱甘肽（GSH）的生物合成。这种代谢重编程有助于维持细胞内的抗氧化防御系统，减轻氧化应激对心脏的损伤。第四军医大学2024年11月在《Free Radical Biology and Medicine》发表的研究表明，尽管纤维连接蛋白III型结构域4(FNDC4)通过ERK1/2-Nrf2通路可减轻心肌IRI，但蛋白类药物存在递送效率低、稳定性差等转化瓶颈[16]。同时国内学者在天然产物靶向Nrf2通路领域取得系列突破，2024年颜丙春等人发现衫叶素显著激活NrF2/HO-1信号通路，改善缺血再灌注所致的小鼠缺血性脑损伤[17]。这些研究为深入理解Nrf2在丙酸血症等代谢性疾病中的作用提供了理论基础。
然而，目前在国内针对Nrf2对丙酰辅酶A调控机制的研究还相对较少。大多数研究集中在Nrf2对氧化应激的调节作用上，而对于其在丙酸血症中的具体作用机制，尤其是对丙酰辅酶A代谢的调控，仍需进一步探索。
4.研究假说
Nrf2可能通过负性调控PCCA的表达，在心肌缺血再灌注损伤过程中抑制氧化应激反应，从而减轻心肌细胞损伤，发挥心肌保护作用（图1）。
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图1 研究假说模式图
1. Timmis, A., et al., Global epidemiology of acute coronary syndromes. Nature Reviews Cardiology, 2023. 20(11): p. 778-788.
2. Sarraju, A., et al., Cardiovascular Effects of Canagliflozin in Relation to Renal Function and Albuminuria. J Am Coll Cardiol, 2022. 80(18): p. 1721-1731.
3. Heusch, G., Myocardial ischaemia-reperfusion injury and cardioprotection in perspective. Nat Rev Cardiol, 2020. 17(12): p. 773-789.
4. Deng, F., et al., Propionate alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury aggravated by Angiotensin II dependent on caveolin-1/ACE2 axis through GPR41. Int J Biol Sci, 2022. 18(2): p. 858-872.
5. Lopaschuk, G.D., et al., Cardiac Energy Metabolism in Heart Failure. Circ Res, 2021. 128(10): p. 1487-1513.
6. Nakamura, M. and J. Sadoshima, Mechanisms of physiological and pathological cardiac hypertrophy. Nat Rev Cardiol, 2018. 15(7): p. 387-407.
7. Tsukamoto, Y., et al., A novel heart failure mice model of hypertensive heart disease by angiotensin II infusion, nephrectomy, and salt loading. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2013. 305(11): p. H1658-67.
8. !!! INVALID CITATION !!! [8,9].
9. Baumgartner, M.R., et al., Proposed guidelines for the diagnosis and management of methylmalonic and propionic acidemia. Orphanet J Rare Dis, 2014. 9: p. 130.
10. Böhm, A., et al., A Noninvasive System for Remote Monitoring of Left Ventricular Filling Pressures. JACC Basic Transl Sci, 2025. 10(3): p. 256-258.
11. Majed, M., et al., Alterations in Aquaporin-4-IgG Serostatus in 986 Patients: A Laboratory-Based Longitudinal Analysis. Ann Neurol, 2023. 94(4): p. 727-735.
12. Hoyles, L., et al., Microbiome-host systems interactions: protective effects of propionate upon the blood-brain barrier. Microbiome, 2018. 6(1): p. 55.
13. Dong, Y., et al., A clinical-stage Nrf2 activator suppresses osteoclast differentiation via the iron-ornithine axis. Cell Metabolism, 2024. 36(8): p. 1679-1695.e6.
14. Baldelli, S., K. Aquilano, and M.R. Ciriolo, Punctum on two different transcription factors regulated by PGC-1α: nuclear factor erythroid-derived 2-like 2 and nuclear respiratory factor 2. Biochim Biophys Acta, 2013. 1830(8): p. 4137-46.
15. Kutschka, I., et al., Activation of the integrated stress response rewires cardiac metabolism in Barth syndrome. Basic Res Cardiol, 2023. 118(1): p. 47.
16. Xu, X., et al., Fibronectin type III domain containing 4 alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury via the Nrf2-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology and Medicine, 2024. 224: p. 256-271.
17. Lynch, D.R., et al., Efficacy of Omaveloxolone in Friedreich's Ataxia: Delayed‐Start Analysis of the MOXIe Extension. Movement Disorders, 2022. 38(2): p. 313-320.
1.创新点
1.1科学假说创新——首创“代谢-氧化应激”双轴调控机制
首次提出“Nrf2负向调控PCC表达→重塑丙酰辅酶A/甲基丙二酰辅酶A（PC/MMC）代谢平衡→维持心肌能量稳态→减轻氧化应激损伤”的全新通路假说。突破传统抗氧化研究单一路径局限，将转录调控（Nrf2）、代谢重构（PCC介导的丙酸代谢）与氧化应激（ROS清除）三者动态耦联，为心肌缺血再灌注损伤（IRI）提供跨尺度机制解析，为代谢相关性心血管疾病的研究开辟新方向。
1.2 研究路径创新——多维度交叉验证技术体系
基于前期发现的“缺氧致丙酰辅酶A累积”现象，反向溯源至转录调控源头（Nrf2-PCC轴），通过“生物信息学预测→双荧光素酶报告基因验证→离体/在体基因干预→代谢组学动态监测”四级递进研究链，突破传统“表型→机制”单向研究范式。创新性构建“细胞缺氧/复氧模型（分子机制）-小鼠IRI模型（病理生理功能）”双平台，结合CRISPR/Cas9介导的PCC基因编辑（敲减/过表达）与Nrf2激动剂（DMF）干预，实现通路功能的正反双向调控验证。通过整合“小分子化合物筛选→心功能/代谢组学评价→临床样本验证”三级转化模块，打通从基础机制到药物靶点发现的转化路径，为心肌IRI的防治提供了潜在的药物靶点。
1.3干预策略创新——代谢预处理新靶点
首次提出“丙酸预处理”作为IRI防治新策略，利用内源性代谢物（丙酸）激活Nrf2-PCC通路，规避外源性药物毒性风险；通过“代谢物（丙酸）→酶（PCC）→转录因子（Nrf2）”三级调控网络，实现多靶点协同保护，为代谢干预心血管疾病提供新范式，还为代谢相关性心血管疾病的研究开辟了跨学科视角，具有重要的学术影响力和临床应用价值。
2.项目特色
  心血管疾病仍是我国以及世界范围内重大的公共卫生问题。多种心血管疾病都与Nrf2有关，而Nrf2可作为包括心血管疾病在内的多种疾病的潜在治疗靶点。因此，探索开发调控Nrf2活性或者作用途径的药物，将成为未来临床治疗心血管疾病的重要方法。体内一些信号通路或活性物质可以通过激活Nrf2通路或促进Nrf2的表达，起到保护心脏的作用。目前国内很少有关于Nrf2和PCC调控方面的报道。基于前期发现的"缺氧致丙酰辅酶A累积"现象，结合生物信息学预测与双荧光素酶报告基因验证，锁定Nrf2对PCC转录的调控关系。构建"离体心肌细胞缺氧/复氧-在体小鼠IRI"双模型平台，通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑实现PCC表达双向调控。本项目聚焦“代谢性心肌保护”国际前沿，整合分子生物学、代谢组学、计算生物学交叉技术，从转录调控、代谢通路及细胞功能等多个层面深入剖析 Nrf2-PCC 通路对心肌氧化应激损伤的保护机制，构建从基础研究到临床应用的完整研究体系。创新性提出"丙酸预处理"新策略，利用内源性代谢物激活通路规避药物毒性风险。填补了Nrf2在丙酸代谢领域的研究空白，为心肌IRI防治提供新靶点，推动心血管疾病治疗的跨学科发展。
锁定Nrf2-PCC通路为可干预靶标，通过体内外实验相结合的方式，深入探究其在心肌 IRI中的保护作用及分子机制，具有较高的科学性和严谨性。我们从基因调控、代谢通路及细胞功能等多个角度出发，系统地研究Nrf2-PCC 通路在心肌氧化应激损伤中的作用，揭示丙酰辅酶A代谢失衡对心肌能量稳态的影响，并进一步探讨Nrf2-PCC 通路在代谢相关性心血管疾病中的潜在作用，为心血管疾病的防治提供了新的思路和靶点。
1.技术路线
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图2丙酸代谢通路在心肌细胞缺氧/复氧中的意义及丙酸预处理的保护机制技术路线
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图3 丙酸预处理对小鼠心肌缺血再灌注损伤保护机制的研究技术路线
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图4 Nrf2对PCC调控机制的技术路线
2. 拟解决的问题
2.1丙酸代谢通路在心肌IRI中的病理生理学意义及其调控机制
在生理状态下，尽管心肌持续进行脂质过氧化反应，但其主要产物HNE可通过丙酸代谢途径有效清除（图5）。这一过程依赖于三羧酸循环的反应速率，而心肌组织因其高耗能特性，维持着远高于其他器官的三羧酸循环速率，使细胞内HNE浓度稳定维持在1μM的安全水平。这种独特的代谢特征表明，丙酸代谢通路是心肌清除脂质过氧化产物、维持氧化还原稳态的重要自我调节机制。然而，由于PCC的催化过程需要ATP参与，在心肌缺血时，丙酸代谢途径往往发生阻滞，导致HNE清除障碍，其蓄积进一步加剧氧化应激损伤。因此，在再灌注阶段快速恢复丙酸代谢通路功能，对于降低脂质过氧化损伤、保护心肌细胞膜完整性、减轻IRI具有重要的病理生理学意义。
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图5 HNE通过β氧化转变为乙酰辅酶A和丙酰辅酶A（Qingling Li et al.2013）
2.1.1Nrf2对PCCB基因转录的直接调控机制及其在心肌氧化应激损伤中的作用
通过生物信息学分析预测Nrf2与PCCB基因启动子区域的潜在结合位点，并构建荧光素酶报告基因载体进行验证，明确Nrf2对PCCB转录活性的直接调控作用。进一步利用体外心肌细胞缺氧/复氧模型和体内小鼠心肌IRI模型，探讨Nrf2-PCC通路在心肌氧化应激损伤中的保护作用及其分子机制，揭示Nrf2通过调控PCC表达维持心肌能量稳态的途径。
2.1.2丙酰辅酶A代谢失衡对心肌能量稳态的影响及其在心肌IRI中的作用机制
利用代谢组学技术检测心肌细胞和小鼠心肌组织中丙酰辅酶A及其代谢产物的动态变化，揭示其在心肌IRI中的代谢特征。探讨丙酰辅酶A代谢通过回补反应途径对三羧酸循环的贡献，以及其对心肌能量代谢的影响。通过干预丙酰辅酶A代谢关键酶（如PCC），验证其在维持心肌能量稳态中的作用，为心肌IRI的防治提供新的代谢靶点。
2.1.3Nrf2-PCC通路在心肌IRI防治中的应用价值及其在代谢相关性心血管疾病中的潜在作用
筛选并验证能够特异性激活Nrf2或调控PCC表达的小分子化合物，评估其对心肌IRI的治疗效果。通过氧化应激机制，探讨Nrf2-PCC通路在代谢相关性心血管疾病（如心力衰竭、心肌病等）中的潜在作用。验证Nrf2-PCC通路在人类心血管疾病中的表达特征及其临床意义，为心血管疾病的精准治疗提供理论依据和实践指导。
3. 预期成果
3.1明确Nrf2对PCCB基因转录的调控机制
通过生物信息学分析结合实验验证，确定Nrf2与PCCB启动子区域的结合位点，揭示Nrf2对PCCB基因转录活性的直接调控作用。同时，利用心肌细胞缺氧/复氧模型和小鼠心肌IRI模型，阐明Nrf2-PCC通路在心肌氧化应激损伤中的保护作用及其分子机制，为心肌IRI的防治提供新的靶点和理论依据。
3.2揭示丙酰辅酶A代谢失衡对心肌能量稳态的影响
通过代谢组学分析，明确丙酰辅酶A及其代谢产物在心肌IRI中的动态变化及其代谢特征。进一步探讨丙酰辅酶A代谢对三羧酸循环的贡献及其对心肌能量代谢的影响，验证关键代谢酶（如PCC）在维持心肌能量稳态中的作用，为理解心肌能量代谢调控机制提供新的视角。
3.3评估Nrf2-PCC通路在心肌IRI防治中的应用潜力
筛选并验证能够特异性激活Nrf2或调控PCC表达的小分子化合物，评估其对心肌IRI的治疗效果。结合氧化应激机制，探讨Nrf2-PCC通路在代谢相关性心血管疾病中的潜在作用，并通过临床样本分析，验证该通路在人类心血管疾病中的表达特征及其临床意义，为开发新型心血管疾病治疗策略提供科学依据。
1.2025年3月
质粒设计（PCCshRNA/过表达载体、荧光素酶报告载体），订购基因合成与载体构建服务。
2.2025年4月
慢病毒包装，HL-1心肌细胞复苏与传代培养，采集样本，进行细胞冻存液备份，慢病毒转染HL-1细胞，嘌呤霉素筛选稳转株，检测节点，转染72h后荧光显微镜观察感染效率，qPCR初筛PCC表达。
3.2025年5月
扩大培养稳转细胞系，构建双荧光素酶报告系统（Nrf2表达载体+ PCC启动子载体），稳转细胞系（分装冻存）。双荧光素酶检测（共转染实验组/对照组），荧光素酶活性测定，Western blot验证Nrf2/PCC蛋白表达。
4.2025年6月
数据整理与分析，优化基因干预条件（Nrf2激动剂DMF剂量测试），CCK-8检测细胞活力，ROS荧光探针（DCFH-DA）定量氧化应激水平。
5.2025 年7月-2025年12月，细胞缺氧/复氧模型制备，初步揭示Nrf2-PCC通路在心肌氧化应激损伤中的保护机制。
6.2026年1月-2026年6月
整理细胞实验的数据，订购在体实验的动物及相关试剂。
7.2026年7月-2026年12月
小鼠在体心肌缺血模型制备及相关实验，明确Nrf2-PCC通路在小鼠心肌IRI中的保护作用。整理实验数据，撰写研究论文。
8.2027年1月-2027年6月
查缺补漏，完善课题研究，撰写、完成结题报告。 
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
1.1实验室前期研究成果
已经证实丙酸可增加心肌氧化应激（图6）
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图6 丙酸对小鼠心肌MDA 、对HL-1细胞氧化应激的影响
1.2本项目已取得的成绩
1.2.1前期研究表明，在离体心脏灌流实验中，停止灌流并复灌后，心脏组织内丙酰辅酶A的含量随缺血时间的延长而显著增加（图7 A）。通过使用0.5 mM丙酸对HL-1细胞进行48小时预处理，发现丙酸预处理能够显著减轻H2O2诱导的氧化应激损伤(图7 B-D)。进一步的机制研究表明，这一保护作用可能与丙酸处理上调心肌细胞中PCC（丙酰辅酶A羧化酶）的表达密切相关(图7 E)。通过生物信息学分析，我们预测PCC基因的启动子区域可能存在与Nrf2（核因子E2相关因子2）结合的潜在位点，提示Nrf2可能通过直接调控PCC的转录表达，参与丙酸代谢通路的调控(图8）。
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图7 丙酸预处理上调 PCC 的表达并减轻H2O2所致的氧化应激
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图 8 Nrf2 可能调控的下游靶基因预测图
1.2.2通过CCK8检测丙酸处理24h对HL-1细胞活力的影响
实验结果显示，随着丙酸浓度的增加，细胞活力呈现下降趋势，表明丙酸对细胞活力具有显著影响（图9）。
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图9丙酸对HL-1细胞活力的影响
1.2.3通过超氧化阴离子探针（绿色）来检测PCC敲减细胞的氧化应激状态
实验结果显示，与对照组相比，高浓度丙酸处理的细胞表现出更为显著的氧化应激反应，但其氧化应激水平仍低于阳性对照组（图10）。
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图10 丙酸对HL-1细胞ROS的影响
1.2.4Nrf2与PCC的qPCR(图11)结果
实验结果表明，当Nrf2呈现显著过表达状态时，其对PCC的调控作用为负性。
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图11 Nrf2 对PCCA mRNA的影响

2.已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法
2.1已具备的条件
项目团队成员已具备独立查阅相关文献、熟练使用生物信息学软件及实验操作的能力，能够独立完成细胞培养、分子生物学实验（如Western blot、qPCR等）以及动物模型构建等关键技术操作。同时向济宁医学院动物伦理委员会提交审批材料（含动物数量论证、麻醉/镇痛方案、人道终点标准） 并获得批准（JNMC-2023-DW-152）。
学校提供了完善的科研平台资源，包括细胞培养室、分子生物学实验室、动物实验中心等，为项目的顺利开展提供了硬件保障。指导教师长期从事心脑血管疾病研究，具有丰富的科研经验和扎实的理论基础，能够为项目提供专业的理论指导和技术支持，确保研究方向的科学性和创新性。
2.2 尚缺少的条件及解决方法
团队成员在创新创业大赛方面的经验较为有限。为此，团队将积极学习往届优秀项目的经验，参加相关培训与讲座，提升项目展示与答辩能力。为进一步提高实验水平，团队成员将加强对先进实验技术（如CRISPR/Cas9基因编辑、单细胞测序等）的学习，并通过与指导教师及有经验的师兄师姐沟通，优化实验方案，确保实验数据的准确性和可靠性。为弥补团队在部分领域（如生物信息学深度分析）的不足，团队将积极寻求与校内相关学科（如生物信息学、药学）的合作，整合多学科资源，提升项目的综合研究能力。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 科研实验及文章发表 14000.00 6000.00
1. 业务费 14000.00 无 8000.00 6000.00
（1）计算、分析、测试费 8000.00 荧光素酶测试 8000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 1000.00 学术会议、交流 0.00 1000.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 5000.00 无 0.00 5000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 6000.00 实验耗材、动物、细胞株 6000.00 0.00
结束

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