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miR-124-3p靶向CREBRF调控细胞凋亡在阿尔茨海默症中的神经保护机制研究

申报人：李奕轩 申报日期：2025-03-25

基本情况

2025创新项目
miR-124-3p靶向CREBRF调控细胞凋亡在阿尔茨海默症中的神经保护机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
阿尔茨海默症（AD）是一种典型的神经退行性疾病，主要病理特征为Aβ沉积、Tau蛋白异常磷酸化及神经元凋亡，目前无有效治愈方法。近年来，研究发现miRNA在AD的发病过程中发挥重要调控作用，其中miR-124-3p作为一种神经系统中高表达的miRNA，可能参与AD病理进程，但机制尚不明晰。生物信息学分析表明，miR-124-3p可以靶向调控CREBRF基因。数据库及前期实验结果显示，AD模型中miR-124-3p表达下调，CREBRF则高表达，提示两者在AD中的潜在关联。本研究通过构建细胞、动物模型及病毒载体，结合qRT-PCR、流式细胞术、Western blot、行为学、双荧光素酶报告及共注射等策略和技术，系统探讨了miR-124-3p在AD中的功能及分子机制。包括：（1）明确miR-124-3p在AD模型中的表达特征；（2）揭示其通过调控凋亡相关蛋白抑制神经元死亡并改善认知功能；（3）证实其通过靶向调控CREBRF表达，抑制神经元凋亡通路，改善AD的神经退行性病理特征。为miRNA在AD早期诊断中的标志物开发及靶向治疗策略提供了理论依据，具有重要的科学研究价值及潜在的临床应用前景。
2024年10月起，本人作为本科生科研训练成员，参与车荣波老师负责的“AD致病机制研究”课题组的研究工作，系统学习并掌握了基础实验技能，如质粒提取、qRT-PCR、WesternBlot、细胞培养以及小鼠灌流取脑等实验技能。
指导老师自19年从事阿尔茨海默病的研究，积累了一定的经验，掌握相关的背景知识；主持省自然科学基金和贺林院士工作站科研基金项目各 1 项。博士科研启动经费及科研总经费共计 60 万元。
指导老师在科研技术和经费上都能够充分的支持本项目可以高质量的完成。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
李奕轩 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 细胞的培养和传代，qRT-PCR实验
肖彭悦 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 动物实验，脑立体注射等
王彦 临床医学院（附属医院） 临床医学（麻醉学方向） 2023 提取蛋白、RNA，构建载体
李浩然 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 行为学、生物信息学预测
张语涵 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 行为学、双荧光素酶报告基因实验
胡盈盈 精神卫生学院 精神医学（本科） 2023 分子实验，检测各蛋白和mRNA的表达量

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
车荣波 精神卫生学院 否

立项依据

  MicroRNA-124-3p（miR-124-3p）作为一种关键的调控分子，在神经退行性疾病中发挥重要作用。初步研究提示，miR-124-3p可能通过下调CREB3调节因子（CREBRF）影响AD的进程。本研究旨在深入探究
  1.明确miR-124-3p在AD模型细胞和模型小鼠中的表达状况；
  2.探究miR-124-3p通过抑制细胞凋亡改善AD的作用及其分子机制；
  3.揭示miR-124-3p/CREBRF调控轴在缓解AD症状中的分子机制。
  本研究整合分子、细胞与整体动物水平研究，聚焦机制深度与转化潜力，可为AD的miRNA靶向治疗提供理论依据和实验基础。 
1.miR-124-3p在AD中的表达特征
（1）AD细胞模型中miR-124-3p的表达分析
复苏SH-SY5Y及N2a细胞系，分别过表达APP构建AD细胞模型；设立正常细胞组（未处理）与AD模型组（APP过表达），提取各组细胞总RNA，合成cDNA，使用miR-124-3p特异性引物进行qRT-PCR，检测miR-124-3p在两种细胞及过表达模型中的表达量。
（2）AD小鼠模型中miR-124-3p的表达验证
使用6月龄5×FAD转基因小鼠（AD模型）和同背景野生型小鼠（WT组），分别取皮层和海马，提取组织总RNA，合成cDNA，使用miR-124-3p特异性引物进行qRT-PCR验证miR-124-3p在小鼠中的表达水平，比较AD小鼠和正常小鼠中miR-124-3p的表达水平。
2.miR-124-3p在AD中的作用研究
（1）miR-124-3p对AD细胞模型凋亡的影响
在SH-SY5Y细胞和N2a细胞及对应过表达APP细胞共同转染miR-124-3p模拟物和miR-124-3p抑制剂，分别设置① 对照组；② AD模型组；③ AD+miR-124-3p模拟物组；④ AD+miR-124-3p抑制剂组。用流式细胞术和荧光显微镜统计凋亡率和红/绿荧光比值，通过Western blot检测Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白水平。
（2）miR-124-3p对AD小鼠认知及病理的影响
a.使用AAV病毒载体构建miR-124-3p过表达载体和miR-124-3p抑制载体，通过脑立体注射的方式将载体导入5×FAD小鼠脑内并将AD小鼠分组为：①对照组；②miR-124-3p过表达组；③miR-124-3p敲低组。通过水迷宫与Y 迷宫行为学实验检测小鼠认知能力是否存在差异。
b.行为学完成后处死小鼠，取海马组织和大脑皮层组织裂解提取蛋白，通过Western blot检测APP及p-Tau 的蛋白表达情况，脑组织切片后通过Annexin V /PI双染色法和Tunel检测法观察细胞凋亡情况。分析miR-124-3p对Aβ沉积、Tau磷酸化和神经元凋亡的影响。
3.miR-124-3p靶向的CREBRF下调对细胞凋亡的影响
（1）miR-124-3p与CREBRF的靶向关系验证
a.生物信息学预测与结合位点分析
使用TargetScan、miRBase、miRDB和miRanda预测miR-124-3p与CREBRF 3'UTR的结合位点，筛选保守性评分＞90%的位点。通过RNAhybrid计算结合自由能验证结合的稳定性。
b.双荧光素酶报告基因实验
将野生型和突变型CREBRF 3'UTR片段克隆至pmirGLO载体在SH-SY5Y和N2a细胞中共转染miR-124-3p模拟物载体与对照质粒，48小时后检测荧光素酶活性，确定miR-124-3p和CREBRF的靶向调控关系。
（2）miR-124-3p/CREBRF通路对凋亡的调控机制
a.细胞模型
1）过表达CREBRF对AD模细胞凋亡率的影响
在过表达APP的SY5Y细胞和N2a细胞共中转染CREBRF过表达质粒，分别分为①模型组和②CREBRF过表达组，运用Annexin V /PI双染色法通过流式细胞术和Tunel检测法观察过表达CREBRF对两种细胞的细胞凋亡情况，提取蛋白质进行Western blot，提取总RNA后反转录做qRT-PCR检测凋亡相关因子（CHOP、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-12）蛋白质和mRNA的表达变化。
2）共转染过表达CREBRF和miR-124-3p对CREBRF蛋白水平的影响
将SY5Y细胞和N2a细胞共转染CREBRF过表达质粒、miR-124-3p过表达质粒，分为①对照组；②CREBRF过表达组；③阴性对照共转染组；④CREBRF过表达+miR-124-3p过表达组；⑤CREBRF过表达+miR-124-3p模拟物对照质粒组，通过Western blot检测CREBRF蛋白的表达水平。
3）过表达CREBRF对miR-124-3p调控的AD模型细胞凋亡率的影响
在APP过表达的SH-SY5Y细胞和N2a细胞中，共转染CREBRF过表达质粒、miR-124-3p模拟物和miR-124-3p抑制剂，并分别设置CREBRF过表达SH-SY5Y细胞和N2a细胞作为对照，运用Annexin V /PI双染色法通过流式细胞术检测细胞凋亡率变化，并检测CREBRF、Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白水平和mRNA水平变化。
b.动物模型
1）过表达CREBRF对AD小鼠模型的影响
对5×FAD脑立体注射CREBRF过表达病毒以及敲低病毒，将实验组分为①对照组；②模型组；③CREBRF过表达组；④CREBRF敲低组；⑤阴性对照质粒组。进行行为学实验，并在实验后处死小鼠，取海马组织和大脑皮层组织裂解提取总RNA和蛋白，通过qRT-PCR检测CREBRF的表达情况，Western blot检测CREBRF蛋白、APP 及 p-Tau 的蛋白表达情况。
2）miR-124-3p/CREBRF通路对AD模型小鼠的作用
对5×FAD小鼠侧脑室共注射miR-124-3p模拟物和CREBRF过表达质粒或共注射miR-124-3p抑制剂和CREBRF过表达质粒，评估海马神经元凋亡（TUNEL）和Aβ沉积，将小鼠分为：①WT组；②5×FAD组；③共注射miR-124-3p模拟物和CREBRF腺病毒组；④共注射miR-124-3p抑制剂和CREBRF腺病毒组；⑤阴性对照共转染组，进行水迷宫和Y迷宫实验评估小鼠的认知能力。
在行为学之后处死小鼠并取海马组织和大脑皮层组织进行检测Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平，脑组织切片后通过Annexin V /PI双染色法和Tunel检测法观察细胞凋亡状况。分析miR-124-3p/CREBRF通路对AD模型小鼠细胞凋亡的影响。 
1．阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD）
阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD），是一种以中枢神经系统退行性病变为特征的复杂疾病，目前发病原因仍未明确。AD的主要病理特征包括神经元丢失、β-淀粉样蛋白（Aβ）异常沉积以及tau蛋白过度磷酸化等。在中枢神经系统退行性疾病中，细胞凋亡普遍存在，尤其是在AD患者中，可以发现大量的神经元细胞凋亡和小胶质细胞凋亡。
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图一 AD的发病机制[1]
Aβ的异常聚集和沉积，可导致严重的氧化应激、神经炎症和细胞凋亡，进而启动了一系列的与AD相关的病理及临床改变。患者主要临床症状表现为认知功能障碍、记忆力衰退、语言能力丧失及执行功能受损等，目前尚无有效根治手段。随着国际社会人口老龄化进展加速，世界卫生组织预测 2050年全球将有约1.39亿人发病[2]，因此深入解析其致病机制并探索新型治疗靶点具有重要的临床意义。
2．miRNAs与AD
MicroRNAs （miRNAs/miRs）是一类长度为22个核苷酸的单链非编码RNA[2]。大量研究证实，miRNAs通过控制靶基因的表达在体内参与细胞增殖与凋亡、生长发育、代谢激活、DNA修复等一系列生物学过程，与各种疾病特别是肿瘤的发生发展密切相关[3,4]。多达70％的miRNA在大脑中被发现，现在越来越多的证据强调miRNA是小胶质细胞功能的关键调控者。miRNA几乎是AD各个发病机制主要调控因子之一。miRNA参与AD细胞的凋亡调控，并在其中发挥重要的作用。miR-9-5P过表达可以通过调节小鼠海马神经元细胞对激活糖原合成酶激酶3β的表达来抑制Aβ25-35诱导的线粒体功能障碍和细胞凋亡[3]。在AD患者中发现miR-34和miR-125表达异常，其过表达可以降低AD细胞凋亡和氧化应激，从而抑制Aβ诱导的神经毒性[4]。miR-26b在PC12细胞AD模型中可抑制神经突生长，诱导细胞凋亡[3]。在AD患者大脑中Aβ的产生和异常沉积伴随着许多不同miRNA水平的改变，例如miR-10和miR-106,可以靶向调控APP，导致Aβ产生增加[4]。miR-340可以通过抑制端粒保护蛋白1（POT1）的表达，增加细胞端粒的长度，从而减轻了细胞衰老和AD症状[5]。近年来，miRNA已成为突触功能和记忆的重要调节因子，在 AD 中，miR-124 通过靶向BACE1、APP调节Aβ的产生，并通过PTPN1信号传导调节tau磷酸化水平，并且在 AD 患者的脑脊液中检测到其降低，支持其作为AD中的潜在诊断生物标志物的作用[6]，miR-124被认为是AD患者新的治疗靶点。总之miRNA可以调控AD的多种发病机制，进一步研究miRNA在AD中的作用机制，为AD患者提供潜在的治疗方案。
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图二 microRNA的合成路径[7]
3．miR-124在AD病理进程中的多重机制
miR-124占成人大脑总miRNA的25％-48％，在除垂体外的所有脑区都有高表达，因为它主要在神经元细胞中表达，所以miR-124也被认为是神经元特异性miR[8]。它在神经发育过程中短暂性上调、参与维持神经元的分化状态、调节突触可塑性和记忆信号分子。此外，miR-124在小胶质细胞中也高表达，参与小胶质细胞的静息调控[9]。研究显示，miR-124在年龄相关的退行性疾病中低表达，在AD患者脑样本和小鼠模型中发现miR-124的表达下调，而miR-124被认为与认知障碍有关，下调miR-124的表达会导致Aβ的沉积。miR-124影响AD的机制主要是干扰淀粉样前体蛋（APP）的清除[10]，APP代谢产物Aβ的过度生成和积累所形成神经毒性的淀粉样斑块是AD特征性淀粉样斑块的主要成分，这些沉积物可以激活小胶质细胞引发炎症反应，损害线粒体，并通过激活蛋白激酶加剧Tau蛋白的异常磷酸化。有实验证明miR-124是一种靶向钙离子依赖的中性蛋白酶1（calpain-1）的miRNA，可通过抑制其翻译，体外转染miR-124的成员miR-124-3p降低calpain-1蛋白水平，从而减弱APP和Tau蛋白的过度磷酸化[11]。β淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1）是β-分泌酶，在APP的剪切过程中起关键作用。BACE1的活性直接影响Aβ的生成，抑制BACE1可以减少Aβ的产生从而减轻AD的病例进程。先前研究证明了miR-124与BACE1表达之间存在负调控的关系，因此miR-124可能是AD患者有希望的治疗靶点。
4．CREBRF与AD的潜在关联
CREBRF最早是由加拿大圭尔夫大学发现的一种具有未折叠蛋白质反应的碱基区亮氨酸拉链蛋白，其通过与细胞转录因子CREB3/Luman相互作用促进CREB3蛋白降解，抑制蛋白反应元件的激活[12]。CREBRF已被鉴定为多种核受体的新型转录调节因子，CREBRF通过内质网络应激途径参加与诱导细胞凋亡，还可通过CREB3/ATG5途径阻断缺氧诱导的自噬[13]。
细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种主要形式。CREBRF与细胞凋亡也有关联CREBRF通过调控CREB3家族蛋白（如CREB3、CREB3L1等）影响细胞凋亡[14]。这些蛋白在未折叠蛋白反应（UPR）和内质网应激（ERS）中起关键作用，而UPR和ERS与细胞凋亡密切相关。CREBRF通过调节UPR信号通路，帮助细胞恢复稳态。若应激持续，细胞可能启动凋亡程序[15]。此外，CREBRF还可以通过调控UPR相关基因的表达，影响细胞应对内质网应激的能力。在轻度应激下，它促进细胞存活；在重度应激下，可能促进凋亡。有研究表面CREBRF通过调控与细胞凋亡相关基因如（CHOP、Bcl-2家族等）影响细胞凋亡[16]。CHOP在内质网应激下表达增加，促进凋亡。CREBRF可能通过调控CHOP表达影响这一过程。CREBRF对细胞凋亡的影响因细胞类型和环境不同而异。在某些情况下，它可能促进凋亡以清除受损细胞，也可能抑制凋亡以维持细胞存活。总结来说，CREBRF通过调控CREB3家族蛋白和相关基因表达，在内质网应激和细胞凋亡中发挥重要作用。
有许多文献报道，miR-124-3p能促进宿主细胞凋亡。Fu等发现，miR-124-3p在膀胱癌阻止或细胞中的表达低于正常膀胱组织和细胞，且能够靶向抑制B型内皮素受体（Endothelin receptor type B, EDNRB）的表达来促进膀胱癌细胞的凋亡[17]。有研究证明过表达miR-124-3p促进了胶质瘤细胞的凋亡，同时通过下调CREBRF抑制细胞增殖[18]。此外，多项研究指出CREBRF具有调控内质网应激和细胞凋亡的功能，并加剧细胞凋亡[19]。目前的研究表明，CREBRF在AD中发挥重要的作用，而miR-124-3p可以通过负反馈调节CREBRF的表达和功能。因此，miR-124-3p可能通过调控CREBRF介导的细胞凋亡通路影响AD的病理进程[20]。
尽管miR-124-3p在AD病理进程中的作用已有报道，且也有证据显示miR-124-3p参与CREBRF的调节，但关于其在AD中靶向CREBRF调控细胞凋亡的具体作用机制仍属于未知。基于前期研究，本研究提出以下科学假设：miR-124-3p通过调控CREBRF进而改善神经元凋亡，从而驱动AD的病例进程。为此我们通过以下三个维度系统解析miR-124-3p-CREBRF调控轴在AD中的作用机制。（1）AD病理下miR-124-3p的表达及其功能验证；（2）验证miR-124-3p与CREBRF的靶向结合；（3）验证miR-124-3p/CREBRF通路对AD中细胞凋亡的影响。以期为基于miRNA的AD早期诊断标志物开发及靶向治疗策略设计提供理论依据，具有重要的科学意义和临床应用潜力。
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图三 本课题科学假说及研究思路
参考文献：
[1] Zhang J, Zhang Y, Wang J, et al. Recent advances in Alzheimer’s disease: Mechanisms, clinical trials and new drug development strategies[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2024, 9(1): 211.
[2] Pritam P, Deka R, Bhardwaj A, et al. Antioxidants in Alzheimer’s disease: Current therapeutic significance and future prospects[J]. Biology, 2022, 11(2): 212.
[3] Liu J, Zuo X, Han J, et al. MiR-9-5p inhibits mitochondrial damage and oxidative stress in AD cell models by targeting GSK-3β[J]. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2020, 84(11): 2273-2280.
[4] Li P, Xu Y, Wang B, et al. miR-34a-5p and miR-125b-5p attenuate Aβ-induced neurotoxicity through targeting BACE1[J]. Journal of the neurological sciences, 2020, 413: 116793.
[5] Kavoosi S, Shahraki A, Sheervalilou R. Identification of microRNA-mRNA Regulatory Networks with Therapeutic Values in Alzheimer’s Disease by Bioinformatics Analysis[J]. Journal of Alzheimer’s Disease, 2024, 98(2): 671-689.
[6] Gentile G, Morello G, La Cognata V, et al. Dysregulated miRNAs as biomarkers and therapeutical targets in neurodegenerative diseases[J]. Journal of Personalized Medicine, 2022, 12(5): 770.
[7] Cui J, Shu J. Circulating microRNA trafficking and regulation: computational principles and practice[J]. Briefings in bioinformatics, 2020, 21(4): 1313-1326.
[8] Angelopoulou E, Paudel Y N, Piperi C. miR-124 and Parkinson’s disease: A biomarker with therapeutic potential[J]. Pharmacological Research, 2019, 150: 104515.
[9] Labatut A E, Mattheolabakis G. Non-viral based miR delivery and recent developments[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2018, 128: 82-90.
[10] Jiménez-Ramírez I A, Castaño E. Non-coding RNAs in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: β-amyloid aggregation, Tau phosphorylation and neuroinflammation[J]. Molecular Biology Reports, 2025, 52(1): 183.
[11] Li A D, Tong L, Xu N, et al. miR-124 regulates cerebromicrovascular function in APP/PS1 transgenic mice via C1ql3[J]. Brain Research Bulletin, 2019, 153: 214-222.
[12] Lv B, Zhang D. Targeting CREBRF in Cancer: Mechanistic Insights and Future Directions[J]. Biologics: Targets and Therapy, 2025: 341-350.
[13] Xue H, Zhang J, Guo X, et al. CREBRF is a potent tumor suppressor of glioblastoma by blocking hypoxia-induced autophagy via the CREB3/ATG5 pathway[J]. International journal of oncology, 2016, 49(2): 519-528.
[14] Audas T E, Hardy-Smith P W, Penney J, et al. Characterization of nuclear foci-targeting of Luman/CREB3 recruitment factor (LRF/CREBRF) and its potential role in inhibition of herpes simplex virus-1 replication[J]. European journal of cell biology, 2016, 95(12): 611-622.
[15] Jäger R, Bertrand M J M, Gorman A M, et al. The unfolded protein response at the crossroads of cellular life and death during endoplasmic reticulum stress[J]. Biology of the Cell, 2012, 104(5): 259-270.
[16] Xue H, Yuan G, Guo X, et al. A novel tumor-promoting mechanism of IL6 and the therapeutic efficacy of tocilizumab: Hypoxia-induced IL6 is a potent autophagy initiator in glioblastoma via the p-STAT3-MIR155-3p-CREBRF pathway[J]. Autophagy, 2016, 12(7): 1129-1152.
[17] Fu W, Wu X, Yang Z, et al. The effect of miR-124-3p on cell proliferation and apoptosis in bladder cancer by targeting EDNRB[J]. Archives of Medical Science, 2019, 15(5): 1154-1162.
[18] Hu D, Zhang Y. Circular RNA HIPK3 promotes glioma progression by binding to miR-124-3p[J]. Gene, 2019, 690: 81-89.
[19] Tang X, Wen X, Li Z, et al. Hsa_circ_0102171 aggravates the progression of cervical cancer through targeting miR‐4465/CREBRF axis[J]. Journal of Cellular Physiology, 2021, 236(7): 4973-4984.
[20] Zeng H, Huang M, Gong X. MicroRNA-124-3p promotes apoptosis and autophagy of glioma cells by down-regulating CREBRF[J]. Neurological Research, 2022, 44(12): 1094-1103. 
创新点：
  1.新靶点发现：创新发现了CREBRF作为miR-124-3p在AD中的直接靶基因，补充miRNA调控AD病理的分子网络。
  2.治疗潜力：通过双靶点干预同时阻断ERS上游信号（miR-124-3p）和下游凋亡执行（CREBRF），实现病理级联的全通路抑制。
  3. 多维度解析：创新性整合细胞凋亡动态监测（流式/荧光显微技术）、病毒介导的脑区特异性基因编辑（AAV/lentivirus）、跨时间点病理分析（Aβ/Tau/神经元存活）及行为学评估（水迷宫/T迷宫），为AD精准干预提供更完善的事实依据。
项目特色：
  1.多层次的研究体系：从分子互作（miR-124-3p/CREBRF靶向验证）、细胞凋亡动态（流式/荧光显微技术）到动物行为学（水迷宫/T迷宫）及病理表型（Aβ/Tau/神经元存活），结合单时间点追踪与跨阶段分析，构建“分子-细胞-组织-行为”全链条研究框架，系统解析AD进程中miRNA调控网络的时空动态特征。
  2.前沿技术的运用：创新性整合病毒介导脑区靶向干预（AAV/lentivirus）、CRISPR基因编辑及双荧光素酶报告基因技术，突破传统研究在时空分辨率和靶向精准性上的局限，实现从基因表达到病理表型的多维度精准调控与动态监测。
  3.双导向研究设计：在机制层面揭示miR-124-3p/CREBRF轴对ERS-凋亡通路的调控作用，同时基于该通路设计基因-核酸联合疗法（如miR模拟物与siRNA共递送），并通过5×FAD模型验证其协同治疗效果，为AD治疗提供兼具理论深度和临床转化潜力的创新策。 
1.技术路线
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2．拟解决的问题
（1）miR-124-3p在AD模型中的表达特征与AD病理的关联性；
（2）miR-124-3p如何调控AD相关的细胞凋亡信号通路改善AD小鼠的认知障碍和神经的病理特征；
（3）证明miR-124-3p是否能够直接靶向CREBRF调控细胞凋亡有效缓解AD症状。
3．预期结果
（1）miR-124-3p在AD小鼠和AD细胞模型中的表达量较正常小鼠和细胞显著降低；
（2）上调miR-124-3p可以缓解细胞凋亡改善AD症状；
（3）miR-124-3p可以靶向调控CREBRF抑制细胞凋亡并有效降低AD病理标志物（如Aβ、p-Tau）的表达水平，从而改善AD小鼠的学习和记忆障碍。
研究结果以论文的形式发表，发表SCI 收录的高水平论文1-2篇；发表中华杂志期刊1篇；参加国内学术交流会议1次。 
2025年4月-2025年11月
  检测miR-124-3p在AD小鼠和细胞模型中表达情况。
2025年11月-2025年5月
  探究miR-124-3p在阿尔茨海默症中的作用。
    1.研究miR-124-3p在细胞模型中的表达差异；
    2.研究miR-124-3p在动物模型中的功能作用。
2026年6月-2026年12月
  探究miR-124-3p介导的CREBRF下调对细胞凋亡影响。
    1.验证miR-124-3p和CREBRF之间的靶向关系；
    2.验证miR-124-3p和CREBRF通路对细胞凋亡的影响。
2027年1月-2027年3月
  分析整理数据，撰写研究论文。 
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩


    前期实验结果1：通过在线数据库TargetScan预测miR-124-3p的下游靶基因，检测到miR-124-3p含有与CREBRF 3,UTR区域部分碱基特异性结合的核苷酸序列,提示CREBRF可能是miR-124-3p 的下游靶基因。
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图1 CREBRF的3’UTR中含有与miR-124-3p互补的核苷酸序列

       我们通过在线数据库TargetScan预测miR-124-3p的下游靶基因发现 CREBRF的3’UTR中含有与miR-124-3p互补的核苷酸序列，证明CREBRF可能是miR-124-3p 的下游靶基因，后续需要通过双荧光素酶实验进一步验证miR-124-3p与CREBRF靶向关系。


   前期实验结果2：在SY5Y细胞和N2a细胞中过表达APP，观察到miR-124-3p的表达量显著降低，CREBRF的表达量显著升高。
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图2 SY5Y细胞和N2a细胞过表达之后miR-124-3p和CREBRF的表达量

       我们在SY5Y细胞和N2a细胞中转染APP质粒，24h后收细胞，提取各组细胞总RNA，合成cDNA，通过qRT-PCR检测到miR-124-3p的表达量显著降低，CREBRF的表达量显著升高。
   
    前期实验结果3：在SY5Y细胞中过表达CREBRF，可以显著升高APP和ATF4表达量，显著降低PSD95的表达；过表达CREBRF还可以导致SY5Y细胞Caspase-3的高表达和Bcl-2的低表达。
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图3 SY5Y细胞过表达CREBRF后APP、ATF4、PSD95、Caspase-3和Bcl-2表达量变化

       我们在SY5Y细胞中分别转染pcDNA3.1-CREBRF-3×flag质粒和对照质粒，24h后提取细胞蛋白，Western blot结果证明在SY5Y细胞中过表达CREBRF，可以显著升高APP和ATF4表达量，并显著降低PSD95的表达；过表达CREBRF还可以导致SY5Y细胞Caspase-3的高表达和Bcl-2的低表达。
   
   前期实验结果4：5×FAD：CREBRF（+/-）杂交鼠与5×FAD小鼠相比，在皮层和海马中APP和ATF4表达量明显降低，PSD95表达量显著升高。在5×FAD小鼠中降低CREBRF表达，还可以导致Caspase-3的低表达和Bcl-2的高表达。
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图4 5×FAD小鼠敲低CREBRF后APP、ATF4、PSD95、Caspase-3和Bcl-2表达量变化

        我们通过用5×FAD小鼠和CREBRF（+/-）鼠杂交获得5×FAD：CREBRF（+/-）杂交鼠，6月龄后处死，取小鼠皮层和海马，Western blot结果证明5×FAD：CREBRF（+/-）杂交鼠与5×FAD小鼠相比，在皮层和海马中APP和ATF4表达量明显降低，PSD95表达量显著升高。在5×FAD小鼠中降低CREBRF表达，还可以导致Caspase-3的低表达和Bcl-2的高表达。
   
    前期实验结果5：敲低5×FAD小鼠脑中CREBRF，可以显著降低细胞凋亡现象
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图5 敲低CREBRF可以显著降低5×FAD小鼠脑中细胞凋亡

       我们通过脑立体注射，在12月龄5×FAD小鼠侧脑室注射CREBRF敲低病毒和对照病毒。病毒注射一个月后，灌流后取各组小鼠脑组织，固定，切片，进行HE染色，我们发现敲低CREBRF可以显著降低5×FAD小鼠脑中细胞凋亡的现象。
       指导老师长期致力于阿尔茨海默症（AD）致病机制的研究，精通分子生物学与细胞生物学领域的核心技术，为本项目的顺利实施奠定了坚实基础。在前期研究中，我们课题组已成功构建并培养了5×FAD模型小鼠，同时成功建立了AD模型细胞系（SH-SY5Y-APPs和N2a-APPs细胞）。这些研究成果为本项目的开展提供了可靠的技术支持和实验保障。项目依托单位配备了完善的实验设施，包括荧光定量PCR系统、荧光倒置显微镜、多功能蛋白印迹分析系统、Odyssey clx凝胶成像系统、赛默飞iBrightw CL1000凝胶成像系统等先进设备，能够满足本项目各项实验需求。
       项目组成员能熟练阅读和理解英文文献，具备较强的前沿知识获取能力，还拥有基金项目的参与经验，且在指导老师的带领下，已熟练掌握Western blot、qRT-PCR、各种动物实验（包括脑立体注射、灌流取脑、切片、电生理等）以及动物行为学实验和数据的统计分析等在内的各种实验方法和技术，为本项目的实施提供了坚实的技术支撑。
       本研究基于项目组前期的丰富研究积累和实验基础，立项依据充分，实验设计科学合理，研究基础扎实。学校拥有山东省行为医学重点实验室、神经生物学研究所省高校重点实验室等高水平科研平台，并获批成立了山东省精神疾病诊治与行为干预协同创新中心。近年来，学校引进了一批海内外优秀青年博士，组建了精神医学研究院，配备了完善的础研究设施，实验平台条件优越，学术氛围浓厚。综上所述，本项目在设备条件、技术储备、研究基础及团队支持等方面均具备充分保障，能够确保项目的顺利实施和高质量完成。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 11000.00 9000.00
1. 业务费 8000.00 无 3000.00 5000.00
（1）计算、分析、测试费 4500.00 引物设计、质粒构建和测序 3000.00 1500.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 1500.00 参加学术会议 0.00 1500.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 2000.00 发表论文版面费 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 12000.00 实验试剂耗材 8000.00 4000.00
结束

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