(1)与本项目相关的研究工作积累
在原发免疫性血小板减少症的免疫发病机制研究领域，检验科室已开展一系列工作，本项目指导老师承担了山东省自然科学基金(编号：ZR2010HL038)、山东省医药卫生科技发展计划项目(编号：2013WS0337)、山东省中医药科技发展计划项目(编号：2015-244)及济宁市科技发展计划项目2项(编号：2012jnjc16；2014jnnk23)等。在上述课题资助的基础上，成功建立了特发性血小板减少性紫癜小鼠模型，掌握了Th细胞培养、流式细胞术、血液成分单采术以及其他相关的分子生物学和免疫细胞化学技术，并对PPAR-γ、T-bet、GATA-3、一氧化氮、一氧化氮合酶、CD62P、PAIgG、细胞因子(如IL-2、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、INF-γ)、凋亡蛋白Fas、FasL、PKC信号、氧化还原指标等因素在ITP发病机制中所起的作用进行了深入研究。通过以上研究，在国内外医学核心期刊发表论文50余篇，其中13篇论文被SCI收录，在本学科的发展中起到一定的促进作用。
2012年指导老师们收集了附属医院血液科确诊的慢性ITP患者血清48例，健康对照为42例健康体检者，发现慢性ITP患者NO/NOS、ROS均升高(见表1)且NO/NOS与ROS呈正相关，NO可作为一种介质和自由基参与血小板的破坏，其作用在ITP发生机理中具有与ROS同样或协同的作用，NO/NOS、ROS的检测对慢性ITP的诊治具有潜在的临床指导意义，2013年该成果发表在《中国免疫学杂志》上。
Tab.1 The concentration of ROS、NO and NOS in chronic ITP group and normal control group
Compared to the control group,t(ROS)=1.24；t(NO)=0.91； t(NOS)=0.82；all P<0.05。
在此基础上，2012年继续收集ITP患者和健康对照者标本，增加标本量，扩大研究指标，发现慢性ITP患者血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化状态(TAS)明显低于健康对照组，而慢性ITP患者血清一氧化氮(NO)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、丙二醛(MDA)、总氧化剂状态(TOS)明显升高(见图3)，且NO、GSSG、MDA、TOS分别与血小板数呈负相关(见图4)。结果表明，ITP患者氧化应激状态的升高可能是血小板破坏突出的因素，这为进一步研究高氧化应激状态对血小板的破坏机制和利用清除氧自由基手段作为ITP患者的治疗方法提供了理论依据，该成果2013年发表在《Scand J Immunol》上。
Fig.3 Expression (mean ± SEM) of NO,GSSG,MDA,TOS were studied by ELISA in control subjects and ITP patients in active disease phase without any treatment (platelet count <100×109/L). *Significantly different(P＜0.05) using unpaired 2-tail t test.Comparisons between control subjects and patients with ITP wre made under the same experimental conditions separately.
Fig.4 Correlations between platelet number and NO, GSSG, MDA, TOS，SOD, CAT, GSH-Px, GSH, TAS. The number of platelets showed a negative correlation with NO(f)(R=-0.6422，P =0.0012), GSSG(g)(R=-0.7794，P =0.0007), MDA(h)(R=-0.8326，P =0.0002), TOS (i)(R=-0.8315，P =0.0002 )respectively，while platelet number showed a positive correlation with SOD(a)(R=0.8186，P =0.0003), CAT(b)(R=0.8657，P =0.0001), GSH-Px(c)(R=0.8321，P =0.0002), GSH(d)(R=0.7795，P =0.0006), TAS(e)(R=0.7711，P =0.0007) respectively. R: correlation coefficient of nonparametric Spearman’s rank.
本项目指导老师前期还研究发现常山酮(HF)可通过促进血小板的生成对慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)小鼠模型有令人满意的治疗效果。本项目指导老师以慢性ITP小鼠模型和体外培养的CD4+T细胞为研究载体，设置高剂量HF组、中剂量HF组、低剂量HF组和正常对照组，采用RT-PCR、ELISA、流式细胞术等技术进行了常山酮对CITP治疗效果及免疫作用机制的深入研究，实验结果见图5~图7，探讨了常山酮对CITP中Th0细胞分化及T-bet/GATA-3、NO/NOS表达的影响，阐明了常山酮对Th0细胞分化的免疫调节机制，揭示出了常山酮在CITP中的最佳治疗剂量及治疗时间规律，在很大程度上纠正了CITP患者中Th1/Th2细胞的失衡，为临床上治疗CITP提供可能的药物和治疗靶点，为治疗Th1/Th2细胞分化失衡的其它自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)提供科学依据，该成果2014年发表在《Int Immunopharmacol》上。
T细胞的活力：2%台盼蓝染色，观察细胞存活率，结果见图5。
Fig.5 Activity of T cells by trypan blue strain (×400)
(a: Vital cell b: Dead cell)
淋巴细胞纯度：用流式细胞仪检测各组细胞纯度，均大于95%(见图6)，对照组与HF组无统计学意义。
Fig.6 Purity of T cells by FITC-CD3 mAb gating
(A: isotype control； B: sample)
转录因子T-bet，GATA-3的mRNA的表达：
与对照组相比，HF组T-bet mRNA表达明显增加(见图7)。GATA-3 mRNA的表达明显降低。其中高剂量组和中剂量组的T-bet mRNA表达明显高于低剂量组，而高剂量组和中剂量组的GATA-3mRNA表达明显低于低剂量组。高剂量组和中剂量组的T-bet mRNA表达和GATA-3mRNA表达则无显著性差异。
Fig.7 T-bet and GATA-3 mRNA expression in Control group and Medium dose group (HF group)
本项目指导老师在收集血小板减少症患者标本及临床资料时，额外发现了两例特殊患儿病例，并对两例病例进行了全程跟踪。一例是国内罕见的口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)引起的血小板减少不良反应，该成果于2013年发表在《Hum Vaccin Immunother》上。
另一例是患儿胆囊炎引起的噬血细胞综合征致使患者血小板减少，老师们收集患者血液标本并进行了深入研究，发现以下特殊的骨髓涂片(见图8)，显示中性粒细胞、晚幼红细胞和一些血小板被吞噬细胞吞噬。老师们随后进行了流式细胞检测，结果(见图9)显示患者体内过度活跃的免疫功能，该成果2016年发表在《Clin Chim Acta》上。
Fig 8. Bone marrow smear (Optic microscope 10×40)
A neutrophil (a), two late erythroblasts (c) and a few platelets (b) were phagocytosed by
phagocytes in (A). A lymphocyte (d) and two late erythroblasts (d) were phagocytosed by
phagocytes in (B). A late erythroblast (c) and a few platelets (b) were phagocytosed by
phagocytes in (C). A neutrophil (a) was phagocytosed by phagocytes in (D). A few of the
platelets (b) were phagocytosed by phagocytes in (E). Different types of atypical lympho-
-cytes could be seen in the bone marrow smear in (F), (G), (H) and (I).
Fig 9. Flow cytometry results
We observed the activation and massive proliferation of T cells (A, B) and macrophages (E). The number of CD8+ cytotoxic T lymphocytes (D) was higher than the number of CD4+ Th cells (C),
while the number of natural killer (NK) cells was lower (G). A high expression of HLA-DR in CD14+ cells (including monocytes, macrophages, polymorphonuclear neutrophils, and chondrocytes)
indicated that the patient had hyperactive immune function (F).
2016年9月-2016年11月，本项目指导老师金呈强由单位公派到意大利萨萨里大学(Universit degli Studi di Sassari)进行了三个月的研修，跟随国际知名专家Flavia Franconi教授学习分子生物学技术，本项目指导老师于2016年11月底顺利获得研修结业证书(见附件20)。
上述前期工作为2017年国家自然科学基金课题的申请打下了较好的研究基础。
儿科是济宁医学院附属医院的重点临床科室之一，是集医疗、教学、科研、保健、康复于一体的大型临床科室，一直以来在鲁西南儿科界享有盛誉。目前儿科开放床位479张，分为新生儿重症监护病区(NICU)、儿童重症监护病区(PICU)、新生儿病区、非感染病区(包括儿童血液病房、肾脏病房、内分泌病房、风湿免疫病房)、神经系统疾病病区、消化系统疾病病区、呼吸系统疾病病区、儿童康复病区、小儿先天性心脏病介入治疗病区，共9个病区，12个临床专业。现有医生92名，其中主任、副主任医师42人，主治医师28人，博士、硕士研究生56人。最大日门诊量1600人次，平均800余人次，年门诊量25万人次，年出院病人近2万人次。
(2)与本项目相关的已取得的研究工作成绩
过去几年来本项目指导老师已发表的与本项目有关的主要成果见下(*通讯作者)：
[1]Li Y-M, Xu X-H, Ren L-N, Xu X-F, Dai Y-L, Yang R-R and Jin C-Q (2024) The diagnostic value of neutrophil to lymphocyte ratio, albumin to fibrinogen ratio, and lymphocyte to monocyte ratio in Parkinson’s disease: a retrospective study.Front. Neurol.2024,15:1450221. (共同通讯作者)
[2]Xu X-H, Li Y-M, Ren L-N, Xu X-F, Dai Y-L, Jin C-Q and Yang R-R (2024) Cluster headache: understandings of current knowledge and directions for whole process management. Front. Neurol. 15:1456517. (共同通讯作者)
[3]Yi-Ming Li,Xiao-Hu Xu,Xiao-Fan Xu,Xia-Xia Yang,Yi-Long Dai,Dong-Xue Song,Cheng-Qiang Jin&Yan-Xia Jia. Association between vitamin B1 intake and hyperuricemia in adults.scientific reports,2024,14(1),16428.(共同通讯作者)
[4]徐小凡,李一鸣,徐小虎,代义龙,金呈强.免疫调节机制在免疫性血小板减少症中的研究进展.检验医学与临床2024,21(9):1332-1335.(通信作者 )
[5]徐小凡;李一鸣;徐小虎;代义龙;金呈强.外周血LMR、RP%、IgG、ALB对儿童免疫性血小板减少症诊断及病情评估价值.国际检验医学杂志,2024,45 (17):2148-2151
[6]徐小凡, 李一鸣, 徐小虎, 代义龙, 金呈强. Wnt信号通路在自身免疫性疾病中的作用研究进展[J]. 医学诊断, 2023, 13(4): 432-439. (通信作者 )
[7]Jin CQ,Dong HX, Zhou JW,Lu SH,Yang XX,Qian ZW,Jia,YX*.Therapeutic Uses of Lycium barbarum Polysaccharides on Idiopathic Thrombocytopenic Purpura Mice via Inhibition of Oxidative Stress. Journal of Biosciences and Medicines, 2016,4,17-23.
[8] Jin CQ, Dong HX, Zhou JW, Jia YX*.Secondary hemophagocytic lymphohistiocytosis induced by cholecystitis: A case report and a review of the literature.Clin Chim Acta,2016,460,236-239. ( SCI收录)
[9]Jin CQ#,Jia YX#,Jin CY,Dong HX,Cheng PP,Zhou JW,Wang Y,Zheng BY,Liu F*.Therapeutic effect of Halofuginone on ITP mice by regulating the differentiation of Th cell subsets.Int Immunopharmacol,2014,18(2):213-216.( SCI收录)
[10] Jin CQ,Dong HX,Cheng PP,Zhou JW,Zheng BY*,Liu F.Antioxidant status and oxidative stress in patients with chronic ITP.Scand J Immunol,2013, 77(9):482-487.( SCI收录)
[11] Jin CQ,Dong HX,Sun ZX,Zhou JW,Dou CY,Lu SH,Yang RR*.Acute immune thrombocytopenic purpura as adverse reaction to oral polio vaccine (OPV). Hum Vaccin Immunother. 2013,9(8):1739-1740.( SCI收录)
