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基于Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3通路探讨松柏醛对脑缺血再灌注氧化应激与炎症反应的调控作用

申报人：赵帆清 申报日期：2025-03-25

基本情况

2025创新项目
基于Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3通路探讨松柏醛对脑缺血再灌注氧化应激与炎症反应的调控作用 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)是临床上常见且棘手的高发疾病，最有效的治疗方法是恢复脑血流，但血流恢复会引发一系列复杂的病理生理反应，导致脑组织损伤加重、神经功能障碍，炎症反应发生等不良后果。目前针对CIRI的治疗方法很有限，因此寻找具有神经保护功能的药物和治疗方法很关键。松柏醛(Coniferylaldehyde,CFA)是一种无毒的天然化合物，具有潜在的药用价值。已有研究证明CFA在减少氧化应激损伤，抵抗炎症反应具有一定作用，但关于其对CIRI的保护作用及具体作用机制尚未明确。本项目旨在研究CFA对CIRI的治疗效果及作用机制，为开发新的脑缺血治疗药物及高效治疗办法提供理论依据。
负责人自2024年5月以来，于济宁医学院精神卫生学院神经生物学实验室学习基础实验技能，掌握多项实验基础，为本课题开展提供坚实基础。
2019年主持济宁医学院科研扶持基金一项，APJ-CRHR1异源二聚体信号转导及调控及其对抑郁症的作用（JYFC2018JS001），结题。
2019年主持济宁医学院 2018 年度贺林院士新医学临床转化工作站科研基金项目一项，APJ-CRFR1 异源二聚体在抑郁症的作用及机制研究（JYHL2018MS04），结题。
2021年主持山东省自然科学基金一项，APJ-CRFR1异源二聚体通过调节β-arrestin2 介导的内吞导致ERK晚期阶段持续激活及其对大鼠抑郁行为的影响研究（ZR2020QC089），申请结题。 
指导老师一直在研究神经保护作用的相关机制，在研项目经费充足，基本可以保证此课题的顺利完成。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
赵帆清 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2023 细胞模型构建，论文撰写
刘家祺 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 RT-qPCR
田光泽 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 免疫荧光，整理分析数据
邹红梅 精神卫生学院 精神医学（本科） 2022 MCAO 模型的手术操作及行为学评分，WB

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
王培香 精神卫生学院 否

立项依据

1.1验证CFA在体内外对CIRI的保护作用。
1.2探讨CFA作用的分子机制，研究CFA是否通过激活Nrf2/HO-1通路减少氧化应激损伤，并通过抑制JAK2/STAT3通路减轻炎症级联反应。
1.3明确CFA对Nrf2与JAK2/STAT3通路的调控关系及相互作用，分析两条信号通路的交互作用，进一步验证其在CFA神经保护中的核心作用。 
2.1研究CFA对CIRI体内外模型的治疗作用
体内研究：构建小鼠的大脑中动脉阻塞 (Middle cerebral artery occlusion, MCAO) 模型，缺血 1h 时腹腔注射CFA，然后在再灌注6h、12h、1d、2d和3d后，检测CFA对缺血性脑中风模型行为、病理的影响。从脑组织提取物中用ELISA或 RT-qPCR检测ROS、MDA、SOD、GPX等氧化应激相关指标以及TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子。
体外研究：采用SY5Y细胞或原代皮层神经元进行氧糖剥夺/复氧（Oxygen glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）处理模拟CIRI，在复氧时加入CFA处理不同时间段，检测CFA 对SY5Y细胞或原代皮层神经元活力、凋亡、氧化应激以及炎症因子的影响。
2.2研究CFA对CIRI体内外模型Nrf2/HO-1和JAK2/STAT3通路活化的影响。
体内研究：动物处理同上，采用Western Blot、RT-qPCR检测不同时间点的Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3等基因表达水平，免疫荧光观察Nrf2、p-STAT3核定位情况。
体外研究：细胞处理同上，采用Western Blot、RT-qPCR检测不同时间点的Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3等基因表达水平；免疫荧光观察Nrf2、p-STAT3核定位情况。
2.3探究Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3通路在CFA神经保护中的相互作用机制
2.3.1单一通路干预实验
2.3.1.1 Nrf2/HO-1通路：
①使用Nrf2 siRNA或Nrf2抑制剂（抑制）
②过表达Nrf2或使用Nrf2激活剂（激活）
预处理的SY5Y细胞或原代皮层神经元进行OGD/R处理，在复氧时加入CFA处理24小时，检测细胞存活、凋亡、氧化应激和炎症因子、JAK2/STAT3通路活化情况。
2.3.1.2 JAK2/STAT3通路：
①过表达JAK2或STAT3组成型活性突变体（激活）
②使用JAK2抑制剂或STAT3抑制剂（抑制）
预处理的SY5Y细胞或原代皮层神经元进行OGD/R处理，在复氧时加入CFA处理24小时，检测细胞存活、凋亡、氧化应激和炎症因子、Nrf2/HO-1通路活化情况。
2.3.2联合通路干预实验
①Nrf2 siRNA或Nrf2抑制剂 + JAK2抑制剂或STAT3抑制剂（同时抑制两条通路）
②过表达Nrf2或Nrf2激活剂 + 过表达JAK2或STAT3组成型活性突变体（同时激活两条通路）
③Nrf2 siRNA或Nrf2抑制剂 +过表达JAK2或STAT3组成型活性突变体（抑制Nrf2/HO-1而激活JAK2/STAT3）
④过表达Nrf2或Nrf2激活剂 + JAK2抑制剂或STAT3抑制剂（激活Nrf2/HO-1而抑制JAK2/STAT3）
预处理的SY5Y细胞或原代皮层神经元进行OGD/R处理，在复氧时加入CFA处理24小时，检测细胞存活、凋亡、氧化应激和炎症因子、Nrf2/HO-1及JAK2/STAT3通路蛋白。 
3.1 CIRI临床现状与迫切需求
   缺血性脑卒中是全球致死及致残的主要病因之一，其治疗核心在于尽早恢复脑血流[1]。然而，再灌注虽然能够挽救部分缺血半暗带组织，却会诱发严重的继发性损害，被称为“脑缺血再灌注损伤（CIRI）”[2]。CIRI的病理过程复杂，涉及氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等多个环节，常在短期内导致神经功能进一步恶化 [3]。目前临床主要通过溶栓、机械取栓等方式进行急性期再灌注治疗，但对于再灌注后继发性炎症和损伤缺乏安全有效的干预手段[4]。因此，寻找在缺血-再灌注不良反应上具有显著保护作用的药物或复合治疗策略，是当前卒中防治研究的重要方向之一。
3.2 氧化应激与炎症在CIRI中的关键作用
3.2.1 氧化应激加速脑组织损伤
   脑组织对氧供中断极为敏感，再灌注时突然恢复的氧供应会在缺血区域引发氧化应激。大量活性氧(ROS)在再灌注早期迅速产生，包括超氧阴离子(O₂⁻)、羟基自由基(·OH)和一氧化氮(NO)等[5]。这些ROS可以促进内皮功能障碍、DNA 损伤和炎症反应[6]。ROS还会诱导细胞损伤，并通过自噬、有丝分裂、坏死和坏死性凋亡以及细胞凋亡导致细胞死亡[7]。因此，精准抑制或缓解再灌注早期的氧化应激是预防后续炎症扩散和细胞死亡的关键环节。目前，自由基清除剂在动物实验中已显示出一定的神经保护作用。
3.2.2 炎症反应促进神经功能恶化
   缺血后，脑内微胶质和血管内皮细胞感知到局部组织损伤信号，释放多种促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6 等）；血脑屏障破坏后，中性粒细胞及单核-巨噬细胞等外周免疫细胞也迅速浸润缺血区，引发严重的免疫炎症连锁 [8]。再灌注时的高灌注压力和氧化因子会进一步刺激胶质细胞过度激活，形成“炎症风暴”，并加重血脑屏障损伤，引发脑水肿与继发性损害 [9]。因此，抑制过度炎症被认为是减轻CIRI损伤的重要策略。
3.3 Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3通路在CIRI中的病理学地位
3.3.1 Nrf2/HO-1通路：内源性抗氧化与抗炎核心轴
   Nrf2（核因子红系2相关因子）被认为是机体应对外界或内源性应激的主要转录因子，在正常状态下与Keap1结合而被降解。在缺血-再灌注所致的氧化应激刺激下，Nrf2从Keap1解离并转位入核，与抗氧化反应元件(ARE)结合，诱导下游包括血红素氧合酶-1 (HO-1）、NQO1、GSH合成酶等在内的多个解毒/抗氧化基因表达，从而清除过量ROS并维持细胞稳态 [10]。HO-1的上调不仅可分解血红素产生具有抗氧化作用的胆绿素和一氧化碳，还能抑制促炎细胞因子释放[11]。脑缺血模型研究显示，增强Nrf2/HO-1信号可有效减小梗死体积并改善神经功能，提示其在CIRI防治中的潜能[12]。
3.3.2 JAK2/STAT3通路：炎症放大的关键通路
   脑缺血后再恢复血流会引发炎症等继发性损伤，JAK2/STAT3通路在其中起关键调控作用。缺血再灌注时，大量细胞因子（如IL-6、IFN-α/β等）与细胞膜受体结合，激活受体相关的JAK2酪氨酸激酶，使其自身磷酸化[13]。活化的JAK2进一步磷酸化信号转导子及转录激活子STAT3，促使STAT3形成二聚体并转位入核。进入细胞核的磷酸化STAT3 (p-STAT3)作为转录因子，与特定基因启动子结合，上调多种下游基因的表达[13]。总之，急性缺血应激可迅速激活JAK2/STAT3轴，诱导大量炎症介质和凋亡相关分子表达，促进神经炎症和细胞死亡。研究发现，抑制JAK/STAT信号可显著减少血管炎症和神经细胞凋亡，从而减轻再灌注损伤[14]。
   氧化应激和炎症是相互作用的，在大脑缺血/再灌注损伤中起关键作用。开发合适的联合治疗方法已成为一个热门话题。然而，目前对CIRI的临床干预尚缺乏特异性小分子药物，可兼具高效抑制炎症与低毒性的通路抑制剂亟待开发。故同时靶向Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3两大通路，可望在氧化应激和炎症环节实现“双管齐下”。
3.4 CFA在神经保护与抗炎中的研究现状
3.4.1 CFA的化学特征与多重生物学功能
   CFA是一种天然存在的酚醛(图1A)，早期研究发现CFA是一种来自膳食来源的无毒天然化合物，一直被用作调味剂。体外和体内研究表明，CFA可以影响人体细胞中的多种生物学功能。CFA能够抗氧化[15]、抑制炎症[16]、调控代谢[17]、抵抗铁死亡[18]以及改善线粒体功能，从而保护神经元[18,19]，在阿尔兹海默症和帕金森等疾病中均发挥作用。最近的研究表明，CFA还有延长寿命的功效[20]。
   CFA可通过多条细胞信号途径发挥功能。首先，CFA是一种有效的 Nrf2 激活剂[18,19,21]。它导致 Nrf2 从 Keap1 解离并转位到细胞核中，在那里 Nrf2 结合 DNA 中的抗氧化反应元件（ARE）。这导致一组细胞保护基因的转录上调，包括血红素加氧酶-1 （HO-1）。HO-1 的诱导是一种中枢防御机制：HO-1 将血红素分解成胆绿素、游离铁和一氧化碳 （CO）;其产物中，胆绿素及其代谢产物胆红素和 CO 具有抗氧化和信号传导功能，可保护细胞免受氧化损伤。因此，通过化学激活 Nrf2，CFA启动了内在的抗氧化防御计划。
   CFA已被证明选择性地抑制 JAK2信号传导，从而减弱炎症[16]。活化的巨噬细胞显著诱导脑膜细胞释放促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β 和 IL-6），从而激活 JAK2 信号通路，并随后增强中枢神经系统中小胶质细胞的免疫反应。而CFA 通过抑制 JAK2 信号通路，有效抑制脑膜细胞的炎症效应。
3.4.2 CFA的安全性与脑保护潜力
   CFA作为来源广泛的天然产物，在常规剂量下毒副作用低。在神经系统方面，已有体外实验提示CFA可减轻神经元遭受氧化或炎性刺激的损伤[16]，并在动物模型中表现出一定的抗炎与保脑效果[18,19]。CFA尤其在激活Nrf2/HO-1通路与抑制JAK2/STAT3两方面具备突出作用。目前缺乏CFA对脑缺血再灌注作用的系统性研究，而CFA的多靶点特性及显著的抗氧化、抗炎双重功能，为其在CIRI干预中提供了充分的理论可行性。因此我们进行了初步探索。设置了不同浓度的CFA（5、10、20、50和100 μM）处理SH-SY5Y细胞，但该成分对细胞活力几乎没有害影响（图1B）。接着我们采用OGD/R模型模拟体内的脑缺血再灌注损伤，分析了CFA对SH-SY5Y细胞的治疗作用。结果表明，CFA在复氧2、4、6h后均可以提高细胞的存活力（图1C-E）。 
summernote-img图1 CFA提高了SH-SY5Y神经细胞的存活率。(A)CFA的化学结构。(B)不同浓度CFA处理后SH-SY5Y细胞的细胞活力。（C-F）OGD/R不同时间损伤后CFA处理的SH-SY5Y细胞的细胞活力。####P < 0.0001 vs. 对照组；*P < 0.05，****P < 0.0001 vs. OGD/R组。
3.5 本课题的重要性与创新性
   基于上述背景，本课题聚焦Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3两个在CIRI中均极其重要且相互影响的通路，拟系统阐明CFA干预脑缺血再灌注损伤时对氧化应激与炎症反应的综合调控作用及其分子机制(图2)。相比于单一靶向抗氧化或抗炎的传统研究思路，CFA的“双向调控”模式（激活Nrf2/HO-1、抑制JAK2/STAT3）更能捕捉CIRI早期氧化冲击与中后期炎症风暴的病程特点，从而在整体上获得更显著且持久的脑保护效果。这将为后续开发安全高效的新型神经保护剂提供重要的实验依据与理论支持。
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                                    图2:CFA激活Nrf2/HO-1、抑制JAK2/STAT3的假设机制图

参考文献
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[15] H.-H. Chen, T.-C. Wang, Y.-C. Lee, P.-T. Shen, J.-Y. Chang, T.-K. Yeh, C.-H. Huang, H.-H. Chang, S.-Y. Cheng, C.-Y. Lin, C. Shih, C.-T. Chen, W.-M. Liu, C.-H. Chen, C.-C. Kuo, Novel Nrf2/ARE activator, trans-Coniferylaldehyde, induces a HO-1-mediated defense mechanism through a dual p38α/MAPKAPK-2 and PK-N3 signaling pathway, Chem Res Toxicol 28 (2015) 1681–1692.
[16] Y. Wang, Y. Gao, X. Li, X. Sun, Z. Wang, H. Wang, R. Nie, W. Yu, Y. Zhou, Coniferyl Aldehyde Inhibits the Inflammatory Effects of Leptomeningeal Cells by Suppressing the JAK2 Signaling, Biomed Res Int 2020 (2020) 4616308.
[17] Coniferaldehyde ameliorates the lipid and glucose metabolism in palmitic acid‐induced HepG2 cells via the LKB1/AMPK signaling pathway | Request PDF, ResearchGate (2024). net/publication/345349918_Coniferaldehyde_ameliorates_the_lipid_and_glucose_metabolism_in_palmitic_acid-induced_HepG2_cells_via_the_LKB1AMPK_signaling_pathway (accessed March 4, 2025).
[18] J. Meng, J. Fang, Y. Bao, H. Chen, X. Hu, Z. Wang, M. Li, Q. Cheng, Y. Dong, X. Yang, Y. Zou, D. Zhao, J. Tang, W. Zhang, C. Chen, The biphasic role of Hspb1 on ferroptotic cell death in Parkinson’s disease, Theranostics 14 (2024) 4643–4666.
[19] Y. Dong, T. Stewart, L. Bai, X. Li, T. Xu, J. Iliff, M. Shi, D. Zheng, L. Yuan, T. Wei, X. Yang, J. Zhang, Coniferaldehyde attenuates alzheimer’s pathology via activation of Nrf2 and its targets, Theranostics 10 (2020) 179–200.
[20] M. Ramatchandirane, P. Rajendran, M.P. Athira, K. Suchiang, Coniferaldehyde activates autophagy and enhances oxidative stress resistance and lifespan of Caenorhabditis elegans via par-4/aak-2/skn-1 pathway, Biogerontology 26 (2025) 25.
[21] D. Cai, J. Wang, S. Chen, L. Jiang, J. Chen, J. Wu, J. Qin, Coniferaldehyde prevents articular cartilage destruction in a murine model via Nrf2/HO‑1 pathway, Mol Med Rep 23 (2021) 224.  
①从多维度（氧化应激+炎症）切入CIRI防治
    充分利用CFA的天然多靶点特性，一次性干预CIRI关键病理环节，与单纯“抗氧化”或“抗炎”思路相比，更具综合性和协同效果。
②深入机制层面
    同时聚焦Nrf2/HO-1和JAK2/STAT3这两条彼此存在交叉调控的重要通路，通过基因敲减或药理学拮抗试验等方式，进一步确证CFA的作用核心通路及分子靶标。
③潜在临床转化价值
    CFA安全性较高，来源广泛，未来可望通过口服或注射给药形式作为缺血性脑卒中辅助治疗，一旦研究证实其有效性，具有较强的专利与产品开发潜力。 
5.1关键技术
5.1.1研究CFA 对缺血性脑中风模型的治疗作用
 体内实验：
   利用MCAO 模型来研究缺血性脑中风，简单操作如下：26-30g的C57BL/6雄性小鼠用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉,并使用恒温毯将麻醉动物的直肠温度维持在37℃。暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），并结扎CCA。取一根硅胶涂层的单丝尼龙缝合线（线头直径0.22-0.23 mm），轻轻地经ECA端送入ICA，推进10 ± 0.5 mm，直至圆形末端到达右侧大脑中动脉入口并感到轻微阻力。闭塞开始一小时后，取出尼龙单丝实现再灌注同时腹腔注射 CFA（0，0.1，0.2mmol kg-1day-1），然后在再灌注后6h、12h、1d、2d、和 3d 后，检测 CFA 对缺血性脑中风模型行为学及病理的影响，评价CFA 对缺血性脑中风模型的治疗作用。具体步骤如下：
① 神经功能分析
   功能评分采用五级分级法：0 级：未观察到神经症状；1 分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋、肘外展、紧贴胸壁；2 分：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动，阻力降低；3 分：动物自由行走时向手术对侧倾倒或转圈；4 分：软瘫，肢体无自发活动。
   利用上述五级分级法，评价 CFA 对 MCAO 模型运动功能（神经功能评分）的影响。
② TTC 检测脑梗死面积
   取各组手术小鼠行灌注 TTC 染色：
   迅速取出动物脑组织，立即在-80°C下冷冻5分钟。然后使用脑组织切片器将全脑切成2 mm厚的冠状切片。切片用2% TTC在37°C的PBS溶液中染色20分钟，并用4%多聚甲醛固定。使用Image J图像分析软件测量梗死体积。
③TUNEL染色检测缺血半暗区神经元凋亡率
   在再灌注后 6h、12h、1d、2d 和3d后，分别取脑组织制备冰冻切片。
   采用商业化试剂盒按照制造商说明书进行TUNEL染色。简而言之，切片用4%多聚甲醛在PBS中固定25分钟（室温），PBS漂洗两次，每次5分钟，然后用20μg/mL蛋白酶K室温消化5分钟。PBS漂洗后，用1x平衡缓冲液平衡30分钟（室温）。然后，细胞在37℃下用50μ L TdT缓冲液孵育1小时，随后用DAPI进行核反染色。用发光显微镜在455 nm和594 nm观察荧光。分别计算梗死区和梗死周围区TUNEL阳性星形胶质细胞和神经元的百分比。
④免疫组化检测缺血半暗区MG 及AS活化
   冻存切片用快速抗原修复液室温孵育10分钟。自然冷却至室温后，脑切片用封闭液（含0.1% Triton-X-100、10%山羊血清和10% BSA的PBS溶液）室温孵育1小时，然后用封闭液稀释的一抗（小胶质细胞活化标记物Iba1, CD68 和星形胶质细胞活化标记物 GFAP）4℃过夜孵育。室温复温后，PBS洗涤，再用PBS稀释的二抗室温孵育。随后用PBS轻轻洗涤，用DAPI复染细胞核。所有图像均使用共聚焦显微镜SP8采集。每组实验均设二抗阴性对照以确保免疫荧光染色特异性。利用图像分析软件，定量分析缺血半暗区 MG 及 AS 的染色强度或阳性细胞数量，评估活化程度。
⑤检测ROS、MDA、SOD、GPX等氧化应激相关指标以及炎症因子。
   I：ROS检测：将脑组织提取物与 DCFH - DA 工作液按照一定比例混合，在 37℃孵育一定时间（通常为 30 分钟左右）。然后使用荧光分光光度计或流式细胞仪检测荧光强度。
   II：老鼠脑组织匀浆，离心后取上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。按照试剂盒说明书进行ELISA分析，检测氧化应激（ROS、MDA、SOD、GPX）和炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）。
   III：RT-qPCR检测ROS、MDA、SOD、GPX和TNF-α、IL-1β、IL-6的 mRNA 表达水平。首先，采用TRIzol试剂从脑组织匀浆中提取总 RNA，并进行 RNA 质量检测以确保 RNA 完整性。随后，使用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒逆转录生成cDNA。使用GoTaq qPCR Master Mix进行RT-qPCR分析。采用2−ΔΔCt方法进行相对定量计算mRNA水平。GAPDH作为内参对照。定量评估缺血半暗区相关基因的 mRNA 表达水平。
体外实验
   采用SY5Y细胞或原代皮层神经元进行OGD/R处理模拟CIRI，在复氧时加入CFA处理3h、6h、12h、18h、24h之后，收集细胞样品，检测CFA 对SY5Y细胞或原代皮层神经元活力、凋亡、氧化应激以及炎症因子的影响，具体步骤如下：
①细胞活力与凋亡检测： 使用CCK-8或MTT法检测细胞活力，通过流式细胞术检测细胞凋亡率，观察CFA是否能减轻OGD/R诱导的细胞损伤。
②氧化应激指标检测：方法同上。
③炎症因子检测： 通过 ELISA 或RT-qPCR检测炎症因子 (TNF-α、IL-1β、IL-6) 的表达水平，方法同上。
④对线粒体功能的影响
   线粒体膜电位检测：使用JC-1染料检测线粒体膜电位（ΔΨm）的变化。
   线粒体通透性转运孔（mPTP）功能检测：使用钙绿-5N（Calcein-AM）染料检测mPTP的开放状态。
   细胞能量代谢测定：通过ATP比色法检测OGD处理后细胞能量代谢变化
5.1.2.研究CFA对脑缺血再灌注损伤体内外模型Nrf2/HO-1和JAK2/STAT3通路活化的影响。
体内实验
   构建小鼠 MCAO 模型，随机分组：假手术组、MCAO 模型组、CFA治疗组。在 MCAO 后不同时间点 (24h、48h、72h) 取出脑组织，分离大脑皮层或缺血核心区域，研究CFA对脑缺血再灌注损伤体内模型Nrf2/HO-1和JAK2/STAT3通路活化的影响，步骤如下：
①基因表达水平检测:
   分离脑组织，提取核蛋白和胞质蛋白，通过 Western Blot 检测 Nrf2 、HO-1、NQO1、GCLC、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3等基因表达水平，通过RT-qPCR检测脑组织中 Nrf2、HO-1 、NQO1、GCLC、JAK2、STAT3的 mRNA 表达水平。
② Nrf2、 p-STAT3核转位检测：
   通过免疫荧光联合DAPI染色观察脑组织中 Nrf2、 p-STAT3 的定位和HO-1 在脑组织中的表达分布。
体外实验
   采用SY5Y细胞或原代皮层神经元进行OGD/R处理模拟CIRI，在复氧时加入CFA处理，在 OGD 复氧后不同时间点 (3h、 6h、12h、18h、24h)，收集细胞样品,研究CFA对脑缺血再灌注损伤体内模型Nrf2/HO-1和JAK2/STAT3通路活化的影响，具体步骤如下：
①基因表达水平检测:
   提取细胞的核蛋白和胞质蛋白，通过 Western Blot 检测 Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3等基因在核和胞质中的表达水平，通过RT-qPCR检测脑组织中 Nrf2、HO-1 、NQO1、GCLC、JAK2、STAT3的 mRNA 表达水平。
② Nrf2、 p-STAT3核转位检测：
   通过免疫荧光联合DAPI染色观察 Nrf2 、 p-STAT3在细胞内的定位变化。
5.1.3 探究Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3通路在CFA神经保护中的相互作用机制
    预处理的SY5Y细胞或原代皮层神经元进行OGD/R处理，在复氧时加入CFA处理不同时间点 (3h、 6h、12h、18h、24h)，检测细胞存活、凋亡、氧化应激和炎症因子、JAK2/STAT3通路和Nrf2/HO-1通路，检测方法同上。除了control组、OGD/R、OGD/R+CFA组，根据预处理还包括以下几组：
①Nrf2/HO-1抑制组：转染 Nrf2 siRNA或加入Nrf2抑制剂ML385 （10 μM)预处理细胞 24 小时。
②Nrf2/HO-1激活组：转染 Nrf2 过表达载体或加入 Nrf2 激活剂四硫代氨酯（PDTC，10μM），预处理 24 小时。
③JAK2/STAT3抑制组：加入 JAK2 抑制剂AG490 (50 μg/mL)预处理 24 小时或STAT3抑制剂Stattic（10μM）预处理 6 小时。
④JAK2/STAT3激活组：转染JAK2-V617F突变载体或STAT3C突变载体，预处理 24 小时。
⑤同时抑制组：转染 Nrf2 siRNA 或加入Nrf2抑制剂ML385 （10 μM) 预处理细胞 24 小时，同时加入 JAK2 抑制剂AG490 (50 μg/mL)预处理 24 小时或STAT3抑制剂Stattic（10μM）预处理 6 小时。
⑥同时激活组：转染 Nrf2 过表达载体或加入Nrf2 激活剂四硫代氨酯（PDTC，10μM），同时转染JAK2-V617F突变载体或STAT3C突变载体，预处理 24 小时。
⑦抑制 Nrf2/HO - 1 而激活 JAK2/STAT3 组：转染 Nrf2 siRNA 或加入Nrf2抑制剂ML385 （10 μM)，同时转染JAK2-V617F突变载体或STAT3C突变载体，预处理 24 小时。
⑧激活 Nrf2/HO - 1 而抑制 JAK2/STAT3 组：转染 Nrf2 过表达载体或加入 Nrf2 激活剂四硫代氨酯（PDTC，10μM）预处理 24 小时，同时加入 JAK2 抑制剂AG490 (50 μg/mL) 预处理 24 小时或STAT3抑制剂Stattic（10μM）预处理 6 小时。
5.2技术路线: 
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5.3拟解决的关键问题：
① 在CIRI病理中，CFA是否具备确切的神经保护作用？
本项目将验证CFA在细胞及动物模型中减轻脑组织氧化应激、炎症损伤、改善神经功能的有效性和可靠性。
②CFA通过哪些分子机制/信号通路来干预CIRI的氧化应激与炎症反应？
本项目将深入阐明CFA对Nrf2/HO-1（抗氧化主轴）和JAK2/STAT3（炎症核心信号）两条通路的双重调控作用，从而揭示其“多靶点”特点。
③Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3通路间是否存在相互影响或协同效应？
本项目将探讨当其中一条通路被抑制或激活时，另一条通路的活性与CFA保护效果如何变化，明确其交互关系或潜在的“主从”机制。
5.4预期结果：
1．理论成果
①明确CFA对CIRI的神经保护作用。
②揭示CFA对Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3通路的调控机制；并探讨两者相互作用。
③为CFA在CIRI中的临床应用提供理论依据和实验支持。
2．国内外期刊发表论文（或综述）1～2 篇
3．参加学术会议（学术讲座）1～2 次 
（6）项目研究进度安排
2025.06-2025.11 CFA 对CIRI体内模型的治疗及对Nrf2/HO-1和JAK2/STAT3通路活化的影响。
2025.12-2026.05 CFA 对CIRI体外模型的治疗及对Nrf2/HO-1和JAK2/STAT3通路活化的影响。
2026.06-2027.01 Nrf2/HO-1与JAK2/STAT3通路在CFA神经保护中的相互作用。
2027.02-2027.06 整理分析数据，撰写论文，发表文章 
7.1网络药理学分析
①CFA药物潜在靶点的收集
通过pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swis - sTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/) 、TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和ctd数据库(http://ctdbase.org/)进行药物靶点收集，去掉重复项，共收集到105个潜在靶点。
②CIRI疾病靶点获取及CIRI,CFA治疗靶点预测
在OMIM数据库(Https://omim.org)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中搜索“cerebral ischemia/reperfusion injury”，收集与CIRI相关的基因去掉重复项，共收集到1653个靶点。
将药物相关靶点和疾病相关靶点导入Venny2.1.0(网址://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ Venny /)，获得CIRI与CFA之间的相交靶点共45个，并构建Venn图(图3)。
③PPI网络相互作用分析
为了研究45个叉基因之间是否存在交互关系，我们利用STRING数据库(https://string-db.org)构建了45基因的PPI网络（图4）。在置信水平为0.4的情况下，没有发现离散的蛋白质，从而形成了一个包含45个白质的相互作用网络，这表明这些交叉基因之间存在强烈的相互作用。该网络包含15.8个节点和356个边。其中我们观察到Nrf2、NQO1、GCLC这三个蛋白相互作用，JAK2、STAT3蛋白相互作用，为本实验研究提供数据支持。
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图3:脑缺血再灌注疾病与CFA的维恩图
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图4:蛋白质-蛋白质相互作用网络图
7.2.申请者熟练掌握MCAO
申请人已熟练掌握MCAO造模方法，并使用线栓法造模（图5），在小鼠插入线栓后采用激光散斑血流成像系统检测小鼠的局部脑血流量（图6），发现脑血流下降大于80%。1h后取出线栓，待小鼠麻药苏醒之后观察小鼠的行为学反应，小鼠出现右侧Honer氏征（图7）。造模完成后给小鼠进行TTC全脑染色(图8) ，显示 MCAO导致外侧皮质和纹状体梗死呈白色，而正常组织呈暗红色，表明MCAO模型建立成功。
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图5:小鼠线栓法造模显微镜图
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图6: 激光散斑血流成像系统检测MCAO小鼠局部脑血流量图
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图7:MCAO小鼠行为学表现图
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图8:MCAO小鼠全脑TTC染色图

7.3.已取得的研究工作成绩
   本课题指导教师长期从事膜蛋白受体信号转导和神经保护作用机制的研究，在该领域积累了丰富的经验。
   本课题申请者已经在济宁医学院神经生物学研究所从事实验长达 1 年，掌握了本项目开展过程中涉及的各项技术，包括细胞培养、RT-qPCR，WB、MCAO造模等实验技术，申请者所实验室拥有独立的动物饲养场所、独立的细胞培养间、美国Stoelting脑立体定位仪、疲劳转棒仪、脑模具、荧光显微镜、荧光定量PCR 仪（Roche），免疫印迹分析，流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、实时细胞分析系统（RTCA）等分析仪器，完全具备本实验所需要的条件。本实验室已有多种细胞株及常用的载体，完全有条件完成细胞转染、对本项目激活和抑制通路相关实验奠定了基础。总之，该实验室具备了良好的人力物力基础，具备开展本项研究的实验条件。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 实验研究及论文出版 12000.00 8000.00
1. 业务费 7000.00 包含实验检测、论文出版等 3000.00 4000.00
（1）计算、分析、测试费 4000.00 实验数据计算分析 3000.00 1000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 专家外审费、论文版面费 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 13000.00 实验动物及饲养(购买 C57BL/6 小鼠及饲养):3000，分子生物学试剂(MCAO线栓、Nrf2 siRNA / 激活剂、JAK2 抑制剂等、ELISA 试剂盒、 WB抗体）:8000 ，细胞培养耗材（培养基、血清、流式管等）:2000 9000.00 4000.00
结束

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