济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的制备及促进骨修复机制研究

申报人：尹艺桥 申报日期：2025-03-25

基本情况

2025创新项目
PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的制备及促进骨修复机制研究 学生申报
创新训练项目
工学
生物医学工程类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
聚左旋乳酸（PLLA）是FDA批准的临床医用植入材料，但其促骨生成能力较弱。申请人前期利用蛋白质环化技术构建了高稳定性的重组Ⅲ型胶原蛋白纳米球（rhCol Ⅲ-），但其对促成骨的作用尚未有文献报道。因此，申请人团队前期通过多次实验尝试并成功利用低温3D打印技术制备了PLPG/rhCol Ⅲ-复合支架。本项目将系统考察复合支架rhCol Ⅲ-的装载量、药物释放性能。同时，将在细胞和动物水平研究此类复合支架对骨组织生长的影响，阐明此类支架促进骨再生的效果与作用机制。本项目的顺利实施可解决骨科植入物骨整合难题提供理论依据和物质基础。
无
指导老师主要从事生物可降解骨修复材料的制备及3D打印植入器件方向，主持2021年山东省自然科学基金青年项目一项（ZR2021QC205）。
给予课题指导、实验指导以及论文撰写指导。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
尹艺桥 医药工程学院 制药工程（本科） 2023 数据的整理和论文撰写
张春宇 医药工程学院 制药工程（本科） 2022 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的制备
王雨彤 医药工程学院 生物制药（本科） 2022 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的制备
魏语航 医药工程学院 生物制药（本科） 2023 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的加工成型及性能表征

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
范田堂 医药工程学院 否

立项依据

  • 通过低温3D打印技术构建具有促骨生成能力的PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架；
  • 通过体内、体外实验阐明PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架促进骨组织再生的细胞、蛋白和基因水平分子机制。
       本项目以PLPG共聚物为基样，重组Ⅲ型胶原蛋白纳米球（rhCol Ⅲ-NS）为药物，采用拟通过低温3D打印技术构建具有促骨生成能力的PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架。在体内外条件下，对成骨细胞增殖相关基因/蛋白表达水平、药物动力学及骨组织再生等方面进行考察。同时，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western-blot、组织学、免疫组化考察细胞因子及蛋白信号评价治疗骨缺损效果。主要从以下几个方面进行研究：

2.1 PLPG/rhColⅢ-NS复合支架的制备及性能表征

2.1.1 PLPG共聚物的制备及性能表征

       以辛酸亚锡（Sn(Oct)2）为引发剂，引发LLA、PDO和GA开环聚合制备PLPG共聚物。通过核磁共振仪（NMR）证实PLPG共聚物的结构，凝胶渗透色谱仪（GPC）考察分子量及其分布，X射线衍射仪（XRD）确认晶体结构，差示扫描量热仪（DSC）分析热性能，热失重仪（TGA）分析热降解性能。

2.1.2 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的加工成型及性能表征

       采用低温3D打印机制备PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架。采用ElectroForce®3220高精度生物材料试验考察支架的力学性能；扫描电镜（SEM）表征支架表面形貌及rhCol Ⅲ-NS在支架中的分布；载药量分析通过高效液相峰面积比计算得出；分别在不同pH的PBS溶液中使用高效液相色谱分析观察药物的释放速度；通过水降解和蛋白酶K降解考察支架的降解性能，如表面形貌、质量损失、降解过程中力学性能变化等。

2.2 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的细胞水平研究

2.2.1复合支架对细胞生物学功能的影响

①通过CCK-8、活/死细胞染色、细胞骨架染色实验考察复合支架的生物相容性；

②通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色评价复合支架对成骨分化水平的影响；

③采用Fluo4-AM钙指示剂检测复合支架对成骨细胞内Ca2+水平的影响。

2.2.2探索PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架对成骨细胞的影响以及相关的分子机制

①采用Real-time PCR法检测成骨相关基因（RUN2、BMP2、OCN和Col-Ⅰ）表达，评价复合支架的成骨诱导能力；

②采用Western-Blot技术考察复合支架的成骨相关蛋白表达；

③通过ELISA评估不同支架组和空白对照组处理后的BMP2、OPG等细胞因子的表达水平，以及检测炎性蛋白（IL-1、IL-6和TNF-α）的表达水平。

2.3 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的体内动物骨修复研究

构建SD大鼠胫骨缺损模型，研究支架材料的骨修复效能。通过 Micro-CT、组织学染色等评估骨修复，并检测 IL-4、IGF-1 水平及破骨细胞活性。
       骨科植入物是生物材料的重要组成部分，拥有极为庞大的市场需求。联合国经社部最新统计数据显示，2020年全球65岁及以上人口为7.27亿，预计2050年将激增至15亿，揭示了人口老龄化的加速趋势。值得注意的是，骨科疾病的发病率与年龄紧密相关。骨质疏松症流行病学调查显示，2022年骨质疏松患者约为9000万，预计到2050年将攀升至2.12亿。随着人们的健康观念不断增强，对骨科医疗器械的需求也在持续提升。华经产业研究院统计数据显示，我国骨科 植入物市场规模已从2016年的191亿元增长至2023年的548亿元，展现出巨大的市场潜力和发展空间。然而，尽管市场需求旺盛，我国在高端骨组织生物医用材料领域仍面临严重依赖进口的困境。2021年《中国骨科植入医疗器械行业细分发展前景分析报告》指出，我国骨科植入器械在各细分市场的渗透率不足5%，高端产品国产化率偏低，给患者和政府财政带来了沉重负担，严重制约“健康中国2030”战略实施。因此，有必要结合骨科临床的实际需求情况，对骨科植入材料开展系统深入的基础研究，为我国骨植入材料的研发提供源头活水和基础保障，这具有深远、显著的社会和经济意义。
       
       聚左旋乳酸（PLLA）是FDA批准的临床植入材料，具有与骨组织匹配的弹性模量、稳定的化学性质和较好的热稳定性，在生物医学工程领域展现出独特优势[1, 2]。然而，长期临床研究发现，PLLA植入体内后的组织整合效果不佳。影响其效果的原因主要包括以下两个方面，一方面，韧性差、降解周期长，易发生断裂及影响细胞代谢[3-5]。申请人团队前期通过分子设计制备了PLLA-PDO-GA（PLPG）共聚物，不仅优化了材料的力学性能，缩短了降解周期，还提升了加工性能[6-8]。另一方面，生物活性差，促骨组织修复能力不足[9]。因此，有必要基于骨修复过程的病理生理特点，开展系统深入的基础研究，进而提升PLPG材料的促成骨能力。
     
       重组Ⅲ型人源化胶原蛋白（rhCol Ⅲ），因其具有与天然胶原相似的三螺旋结构和生物活性，在组织再生方面取得了一定进展[10, 11]。然而，线性结构使其肽链相对暴露，导致体内半衰期较短[12]。为克服这一挑战，研究者探索了rhCol Ⅲ的微球化（rhCol Ⅲ-MS）策略，旨在通过物理形态的改变提升其稳定性。但是，尽管这一尝试在一定程度上延长了材料的体内留存时间，但rhCol Ⅲ-MS仍存在易聚集降解和释放动力学不可控等缺陷[13]。基于此，我们团队前期创新性地制备了直径约为7 nm，孔径约为 3 nm的rhCol Ⅲ-NS，规避了外源性成分可能带来的干扰。相比于rhCol Ⅲ和rhCol Ⅲ-MS，rhCol Ⅲ-NS具有更高的稳定性、更可控的释放速率和更好的生物相容性等优势。体内降解实验结果表明，rhCol Ⅲ-NS的降解周期约是市售rhCol Ⅲ的2-3倍，高达56天。这一结果进一步验证了rhCol Ⅲ-NS的高稳定性，为其在生物医学领域的应用提供了有力支持。但其对促骨形成机制还有待研究。基于此，申请人团队前期通过多次实验尝试并成功使用低温3D打印技术制备了PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架。实验结果表明，rhCol Ⅲ-NS能够均匀分散在PLPG基样中，并保持良好的活性。
     
       在前期工作的基础上，本项目拟进一步优化PLPG/rhCol Ⅲ-NS的加工成型条件，系统考察rhCol Ⅲ-NS的装载量、药物释放。同时，将在细胞和动物水平研究此类复合支架对骨组织生长的影响，阐明此类支架促进骨再生的效果与作用机制。本项目的顺利实施可解决骨科植入物骨整合难题提供理论依据和物质基础。

参考文献

[1] 胡雅瑄, 马子涵, 王将凌, 汪永跃. 可降解新型聚乳酸膜在引导骨组织再生中的应用. 国际口腔医学杂志. 2024, 51, 187-192.
[2] Li J., Jiang P., Yang J., Zhang Q., Chen H., Wang Z., Liu C., Fan T., Cao L., Sui J. Self-reinforced PTLG copolymer with shish kebab structures and a bionic surface as bioimplant materials for tissue engineering applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 2024, 16, 11062-11075.
[3] Fan T., Qin J., Dong F., Meng X., Li Y., Wang Y., Liu Q., Wang G. Effects on the crystallization behavior and biocompatibility of poly(LLA-ran-PDO-ran-GA) with poly(D-lactide) as nucleating agents. RSC Advances. 2022, 12, 10711.
[4] Wang C, Huang W, Zhou Y, He L, He Z, Chen Z, He X, Tian S, Liao J, Lu BH, Wei Y, Wang M, 3D Printing of Bone Tissue Engineering Scaffolds. Bioactive Materials, 2020, 5: 82-91.
[5] 明美华, 王林达, 周锋, 张勇, 聚乳酸增强增韧改性研究进展. 上海塑料, 2021, 49: 9-16.
[6] Fan T., Qin J., Li J., Liu J., Wang Y., Liu Q., Fan T., Liu F. Fabrication and evaluation of 3D printed poly(L-lactide) copolymer scaffolds for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 2023, 245, 125525.
[7] Fan T., Zhang Y., Meng X., Qu Y., Wang Y., Liu Q., Wang G. Three-dimensional printed poly(L-lactide) copolymers with nano-hydroxyapatite scaffolds for enhanced osteogenic and regenerative activities in bone tissue engineering. Colloid and Interface Science Communications. 2022, 51, 100671.
[8] Fan T., Meng X., Zhuge R., Qin J., Wang Y., Zhang C., Yin Y., Liu J., Fan T., Liu F. Design, fabrication, and biocompatibility of 3D-printed poly(LLA-ran-PDO-ran-GA)/poly(D-lactide) composite scaffolds for bone tissue engineering. International Journal of Bioprinting. 2024, 10, 532-543.
[9] 聂闻, 黄宏莉, 莫文文, 龙桂月, 廖红兵. 3D打印技术在牙周组织工程中的应用. 中国组织工程研究. 2024, 28, 4671-4676.
[10] You S., Zhu Y., Li H., He F., Liu S., Yang X., Zeng H., Dai J., Hu L. Recombinant humanized collagen remodels endometrial immune microenvironment of chronic endometritis through macrophage immunomodulation. Regenerative Biomaterials. 2023, 10, rbad033.
[11] Hu C., Liu W., Long L., Wang Z., Zhang W., He S., Lu L., Fan H., Yang L., Wang Y. Regeneration of infarcted hearts by myocardial infarction-responsive injectable hydrogels with combined anti-apoptosis, anti-inflammatory and pro-angiogenesis properties. Biomaterials. 2022, 290, 121849.
[12] 张悦, 贾元元, 孙秀丽, 王建六. 重组胶原蛋白在组织再生中的应用. 中国生物医学工程学报. 2024, 43, 741-750.
[13] Wu H., Yang L., Luo R., Li L., Zheng T., Huang K., Qin Y., Yang X., Zhang X., Wang Y. A drug-free cardiovascular stent functionalized with tailored collagen supports in-situ healing of vascular tissues. Nature Communications. 2024, 15, 735.
  • 本项目结合低温3D打印技术构建了一类新型骨组织工程复合支架，该复合支架不仅具有较好抗炎效果，而且能够促进周围健康组织生长，加速术后骨组织再生。
  • rhCol Ⅲ在体内的半衰期较短问题，申请人团队前期创新性制备了更高的稳定性、更可控的释放速率和更好的生物相容性的rhCol Ⅲ-NS，能够满足长期骨修复和再生的需求。此外，申请者使用的rhCol Ⅲ-NS，其对促成骨的作用尚未有文献报道。据此，本项目拟通过低温3D打印技术构建PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架，在细胞和动物水平研究此类复合支架对骨组织生长的影响，阐明此类支架促进骨再生的效果与作用机制，具有材料设计创新性。
5.1技术路线

      本项目的总体技术路线如图1所示：
                                                                             summernote-img
         
                                                                                                                                                                
 图1总体技术路线图

5.2 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的构建及性能表征

5.2.1 PLPG共聚物的制备及性能表征

       以Sn(Oct)2为催化剂，将LLA、PDO、GA单体和Sn(Oct)2加入到玻璃聚合管中，在避免发生酯交换的温度下（135℃），进行开环聚合反应得到PLPG共聚物。通过GPC、NMR表征共聚物分子量及分布、化学结构及组成；DSC和TGA考察热性能参数、结晶动力学以及热降解性能；XRD分析晶体结构。

5.2.2 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的加工成型及性能研究

       使用低温3D打印机对其加工成型，得到PLPG/rhCol-NS支架。通过ElectroForce®3220高精度生物材料试验机研究PLPG/rhCol-NS支架材料力学性能；采用SEM观察支架表面及其rhCol-NS分布；通过水降解和蛋白酶K降解考察支架降解性能。

复合支架中rhCol-NS载药量：称取复合支架置于液氮中，快速取出后充分研磨成粉末，之后将粉末溶解在DMSO溶剂中，使rhCol-NS完全溶解，经过滤后使用高效液相色谱仪测定rhCol-NS含量，得到复合支架载药量。

pH对复合支架药物释放的影响：将复合支架分别置于不同pH值的PBS中（pH设置为7.4，6.0，5.0和4.0），并在水浴振荡器（37℃）中释放。之后分别在规定时间（1 天、3天、5天和7天）取出释放液，并用新鲜PBS补齐，离心（8000 rpm）后，收集上清。使用RP-HPLC检测上清中的rhCol-NS含量，分析复合支架在不同pH下rhCol-NS的释放性能。

5.3 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的细胞水平研究

5.3.1 PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架对成骨细胞生物学功能的影响

①细胞毒性实验：将MC3T3-E1细胞（2×104/孔）接种于96孔板中并过夜后，吸去培养基，加入复合支架，共培养2天后，加入CCK-8检测 MC3T3-E1细胞存活率，计算IC50值。

②活/死细胞染色：将MC3T3-E1细胞（2.5×105/孔）接种于6孔板中，培养24 h后，加入空白对照组与含有待测样品组，孵育48 h和72 h后，PBS洗3次，使用活/死细胞检测试剂盒避光染色细胞20 min，使用2 mL PBS洗涤并在荧光显微镜观察染色情况。

③碱性磷酸酶活性（ALP）检测：将MC3T3-E1细胞以1×104/孔的密度接种在6孔板中，将待测支架置于上述孔板中，培养液更换为成骨分化培养液，每隔1天换液。培养7天和14天后，吸去培养基，使用PBS清洗3次，于室温下使用多聚甲醛固定20 min，吸去多聚甲醛并用1 mL PBS冲洗3次，使用ALP染色试剂盒中的缓冲液按比例加入BCIP和NBT溶液，室温下避光放置24 h后，吸去染液并使用1 mL PBS清洗3次，使用倒置荧光显微镜观察染色情况。

⑤MC3T3-E1细胞内Ca2+测定：将MC3T3-E1细胞以1×104/孔的密度接种在6孔板中，加入待测支架，共培养7天后，加入Fluo4-AM染色液，使用胰蛋白酶处理消化细胞，利用多功能酶标仪测定488 nm处的吸光度。

⑥Ca2+沉积实验：将MC3T3-E1细胞以2×104/孔的密度接种在6孔板中，加入待测样品，共培养7天和14天后，吸去培养基并用1 mL PBS清洗3次，在室温下加入40 mL的无水乙醇的固定液碧云天（C0148S-1）固定20 min。使用1 mL PBS冲洗3次，然后加入茜素红S染液（C0148S-2），均匀覆盖细胞即可，室温染色30 min。吸去染液并用蒸馏水充分洗涤后，使用荧光显微镜观察细胞染色情况。

5.3.2探索PLPG/rhCol-NS复合支架对成骨细胞的影响以及分子机制

①Western blot技术检测蛋白水平表达：使用复合支架处理MC3T3-E1细胞后，使用 10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用PVDF膜通过蛋白质印迹进行分析。在室温下，使用含5%牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich，USA）的Tris缓冲液封闭PVDF膜1 h后，使用一抗（1：1000，Abcam）与Runx2、OPN、Col-Ⅰ和抗β-Actin一起孵育过夜。最后，将PVDF膜与HPR标记的二抗（1：5000，Bioworld）孵育1 h后，洗涤PVDF膜并染色用于凝胶成像考察。

②ELISA检测炎性蛋白（IL-1、IL-6和TNF-α）的分泌：将MC3T3-E细胞（2.5 ×105/孔）接种于24孔板中，收集细胞培养液，并将培养基和不同浓度标准品分别加入 ELISA板中（100 μL/孔）；室温孵育2 h；洗板5次；加入生物素抗体工作液（100 μL/孔），室温孵育1 h；洗板5次；加入酶结合工作液（100 μL/孔），室温孵育20 min；洗板5次；加入显色剂（100 μL/孔），室温孵育20 min；加入终止液（50 μL/孔），混合后即刻测量OD450值。

5.4 PLPG/rhCol-NS复合支架的动物水平研究

5.4.1复合支架治疗骨缺损效果探索

       使用2%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉（1 mL/kg），并用聚维酮碘消毒。麻醉后取单侧胫骨内侧纵切口3 mm，切开皮肤、皮下、深筋膜，显露胫骨近端内侧面，使用2 mm克氏针钻头造成3 mm × 5 mm的矩形骨窗，植入支架，对照组不做任何处理。逐步缝合深筋膜及皮肤组织。自然条件下恢复清醒，在相同条件下喂养。术后4周和8周后使用空气栓塞法处死大鼠。

5.4.2考察指标

①成骨相关基因水平表达：取大鼠单侧胫骨，Trizol法提取各组RNA，使用RT-PCR技术定量评价骨组织形成相关基因（Runx2、OPN、Col-Ⅰ等）的表达情况。

②骨组织三维重建形态学分析：取大鼠单侧胫骨，使用微计算机断层扫描技术对胫骨缺损处修复情况进行评估。扫描结束后，使用CTvox软件三维重建标本并进行定量评价新骨形成。

③组织学染色评价：取大鼠单侧胫骨，使用10%多聚甲醛固定将单侧胫骨标本48 h，EDTA脱钙20天、梯度酒精脱水、二甲苯透明化处理、石蜡包埋，矢状面以5-8 μm 厚度连续切片，经HE染色后，在显微镜下观察局部骨组织炎性细胞浸润、死骨、软组织及感染骨缺损的修复情况。

5.4拟解决的问题

     本项目拟解决的关键科学问题具体如下：
  • 通过低温3D打印技术构建具有优异骨组织修复功能PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架；
  • 通过影像学、细胞学、蛋白组学和基因组学，探究复合支架在基因、蛋白、细胞及动物水平治疗骨缺损的作用机制。
5.5预期研究成果

  • 构建一类兼具抗炎和促骨再生的PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架，系统评价此类支架治疗骨缺损的效果和作用机制，为为全新骨组织工程支架的开发和临床应用提供理论依据和物质基础。
  • 预期发表高质量学术论文1-2篇。
2025年6月-2026年6月

  • 完成PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的优化及其理化性质表征，如化学结构、力学性能、孔隙率等表征；
  • 完成PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架的降解性能表征、rhCol Ⅲ-NS载药量及释放性能、体外矿化性能。
  • 完成PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架在细胞水平表征。
2026年7月-2027年6月
  • 建立SD大鼠骨缺损模型及PLPG/rhCol Ⅲ-NS复合支架对骨缺损治疗的动物水平生物学功能研究；
  • 总结本项目工作，撰写论文和验收报告，结题验收。
项目研究期间，不断整理和总结实验结果，撰写相关论文，为完成项目和下一步的研究计划奠定坚实基础。
PLPG共聚物及其骨修复支架的加工成型和性能研究
       申请人前期通过开环聚合制备了降解速率可控、力学性能优异和生物相容性良好的PLPG共聚物（图2）。通过调控LLA、GA和PDO单体比例，可有效改善PLPG的力学性能和降解速率。研究发现PLPG共聚物具有良好的加工性能。体外细胞实验表明，成骨细胞能够较好的黏附在PLPG支架表面生长增殖。该工作发表在International Journal of Biological Macromolecules, 2023, 245, 125525。本研究工作使申请人充分掌握了PLLA共聚物的合成以及 3D 打印成型，为本项 PLPG共聚物的制备、表征及加工成型奠定了良好基础。
                                                                              summernote-img 


图2. PLPG支架的制备及性能研究：（a）PLPG支架的扫面电镜图和实物图；（b）不同组分PLPG的压缩性能；（c）水降解12周，不同组分PLPG支架的质量损失图；（d）不同组分PLPG支架的活/死染色图；（e）PLPG支架的制备流程图
rhCol Ⅲ-NS的制备及其性能表征
       申请人通过蛋白质环化技术将含有rhCol Ⅲ基因序列的重组质粒、剪切酶基因、环化酶基因导入工程菌中进行发酵表达，实现了在不引入任何外源插入或修饰基因前提下，通过“一步法”制备了分子量约为11.65 KDa的rhCol Ⅲ-NS（图3a和图3b）。通过高分辨串联质谱测得rhCol Ⅲ-NS氨基酸序列为gergapgf rgpagpngip gekgpagerg apgpagpr，氨基酸覆盖率为100%（图3c）。结合TEM和冷冻电镜测得rhCol Ⅲ-NS的直径约为7 nm，孔径约为 3 nm（图1d和图3e）。之后，将rhCol Ⅲ-NS和rhCol Ⅲ植入C57小鼠体内，比较了rhCol Ⅲ和rhCol Ⅲ-NS体内半衰期（图3e）。结果显示，植入14天后，植入rhCol Ⅲ组别的相对荧光强度约为7.2%，而植入rhCol Ⅲ-NS组别在第56天后，小鼠皮肤真皮层仍可见极少量的rhCol Ⅲ-NS荧光（图3f）。植入rhCol Ⅲ和rhCol Ⅲ-NS后，不同时间组小鼠的脏器系数均无明显差异（图3g）。
                                                                              summernote-img
图3. rhCol Ⅲ-NS的制备及性能研究：（a）rhCol Ⅲ和rhCol Ⅲ-NS的高效液相色谱图；（b）rhCol Ⅲ-NS的质谱图；（c）高分辨串联质谱测试rhCol Ⅲ-NS氨基酸序列图；（d）rhCol Ⅲ-NS的透射电镜图；（e）rhCol Ⅲ-NS的三维重构及三维空间构象图；（f）rhCol Ⅲ-NS皮下植入到C57B/6J小鼠56天后免疫荧光染色图；（g）rhCol Ⅲ皮下植入到C57B/6J小鼠14天后免疫荧光染色图；（h）rhCol Ⅲ-NS皮下植入到C57B/6J小鼠56天后免疫荧光定量图；（i）rhCol Ⅲ皮下植入到C57B/6J小鼠14天后免疫荧光定量图
PLPG/rhCol的制备及其性能表征
       我们通过低温3D打印技术制备了rhCol Ⅲ-NS均匀分布的PLPG/rh Col Ⅲ-NS复合支架（图4a-c）。
                                                                                    summernote-img 
图4. PLPG/rhCol Ⅲ-NS支架：（a）PLPG/rhCol Ⅲ-NS支架的实物图；（b）PLPG/rhCol Ⅲ-NS支架的扫描电镜图；（c）rhCol Ⅲ-NS在支架中均匀分布图
       本项目主要依托济宁医学院完成。济宁医学院，拥有博士后科研工作站、国家基因检测技术应用示范中心2个国家级平台，山东省细胞生物医疗技术重点实验室、山东省工程研究中心、山东省院士工作站等9个省级平台。目前建有生物化学与分子生物学、细胞生物学、病理学、加速康复学、心血管学、代谢与免疫学、材料科学、智能影像学、生物信息学、临床样本库等研究技术平台。实验技术人员和实验设备配备齐全，具有多功能酶标仪、荧光定量PCR仪、高通量测序仪、荧光分光光度计、超薄切片机、液质联用仪、流式细胞仪、细胞培养室、激光共聚焦、全自动蛋白质表达定量分析系统、高通量电化学免疫分析仪、台式冻干系统、电转染系统、单细胞凝胶电泳图像分析系统、紫外分光光度计、匀浆器、高速离心机、微生物培养箱、低氧培养箱、光声动物成像仪、真空干燥箱、旋转蒸发仪、小动物麻醉机、呼吸机和解剖镜等本课题所需仪器，能够满足 Western blot、real-time PCR、病理切片染色、流式分析、共聚焦荧光成像等大部分实验要求。同时，我校建有实验动物中心，拥有SPF级动物房，为本课题开展动物实验研究提供了方便。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 测试费、版面费、细胞费等 11400.00 8600.00
1. 业务费 7000.00 无 2400.00 4600.00
（1）计算、分析、测试费 3000.00 理化性能测试 1800.00 1200.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 1000.00 文献检索费 600.00 400.00
（5）论文出版费 3000.00 版面费或专利申请费 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 13000.00 试剂细胞动物费 9000.00 4000.00
结束

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