济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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卡介苗路径的EB病毒特异性抗体和抗肿瘤抗体融合基因的免疫学验证

申报人：王永茹 申报日期：2025-03-25

基本情况

2025创新项目
卡介苗路径的EB病毒特异性抗体和抗肿瘤抗体融合基因的免疫学验证 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生自主选题
二年期
本研究拟通过RT-PCR方法获取的EB病毒EBNA1的cDNA，与IL-2基因融合，得到融合基因EBIL，构建出重组大肠杆菌-卡介(BCG)穿梭载体pMV261-EBIL，电转化至BCG，以获得不断高效表达EBNA1蛋白的重组BCG。体内外实验对重组卡介苗进行验证，探索有效预防和治疗EB病毒阳性肿瘤的新思路。
两篇中文论文与一篇 sci 论文在投，作为成员参与创新训练项目。
山东省医药卫生科技发展计划项目（No.2017WS339）；山东省重点研发计划项目（No.2018GSF118137）；济宁医学院教育科学研究重点课题（No.16008）；2020年第二批卫生部产学研项目两项
2020 年第二批卫生部产学研项目两项
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
王永茹 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 确定实验路线，体内抗肿瘤实验
周晓涵 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 文献检索，融合基因构建
陈孖怡 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 实时荧光定量分子水平检测
徐沐然 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 重组质粒的构建 体外抗肿瘤实验
赵芮 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 论文写作
窦淑菻 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 生物信息学预测

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
孔涵 基础医学院 否

立项依据

①获得高效、稳定表达EBNA1与IL-2的融合基因EBIL；
②电转化得到包含融合基因的重组卡介苗（rBCG）；
③实验验证rBCG体外及体内抗EB病毒阳性肿瘤细胞作用及毒副作用。
①融合基因的获得：根据已有的数据和材料，获取213个aa的EBNA1和含154aa的IL-2基因编码序列的cDNA，将EBNA1和IL-2两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 DNA序列连接以获得融合基因EBIL（图1）。
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图1 获取融合基因EBIL
②融合基因重组BCG的构建及检测：将融合基因ILBZ利用酶切位点插入大肠杆菌-卡介苗穿梭表达载体pMV261中(图2），并转化至感受态E.coli.DH5α中，对pMV261-BZIL是否正确插入进行鉴定，培养大肠杆菌DH5α，提取并纯化pMV261-BZIL质粒后将其电转化至BCG，固体培养基中筛选rBCG，液体培养基扩增rBCG菌体，实时荧光定量和Westen blotting技术检测EB病毒融合蛋白分子及蛋白水平是否有效表达。
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图2 pMV261质粒
③体外抗肿瘤实验：将成功构建的rBCG分别肌肉注射C57BL/6J小鼠，采用ELISA检测其特异性抗体，流式细胞术分析各组淋巴细胞增殖情况，乳酸脱氢酶法检测机体产生的特异性CTL，ELISPOT法检测免疫小鼠脾脏细胞产生的特异性细胞因子及IFN-γ的分泌水平，MTT法检测rBCG对EB病毒阳性肿瘤增殖抑制率，Hoochest法检测、观察并分析细胞凋亡形态。
④体内抗肿瘤实验：培养获得的rBCG，纯化后将其注射至以EB病毒阳性肿瘤细胞建立的荷瘤小鼠模型瘤灶内（先用鼠源性瘤，再用人源性瘤），检测细胞及肿瘤组织中融合基因表达，HE染色观察rBCG对肿瘤组织的形态学影响，流式细胞术检测各组肿瘤细胞的坏死和凋亡，CCK-8法检测rBCG特异性杀伤作用，预防性实验及治疗性实验分析、观察目的基因表达对肿瘤细胞凋亡和增殖的影响以及抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的作用。从细胞和分子水平分析肿瘤细胞凋亡的规律，探讨融合基因诱导特异性CTL，协同杀伤肿瘤细胞的分子机制
    EB病毒(EBV)引起的鼻咽癌等在欧美发达国家为罕见疾病，因此一直以来在这些国家未得到重视，但在国内患者相对较多（图3），并且研究也相对缓慢。由于EBV的潜在致癌性，EBV减毒活疫苗不适合对健康人预防,在EBV亚单位疫苗基础上开展的疫苗研究已成为国内外研究的热点，但至今没有EB病毒亚单位疫苗的报导。随着分子生物学和肿瘤免疫学的发展,用免疫治疗的方案来预防鼻咽癌的复发和远处转移以及作为传统治疗手段的补充,越来越得到人们的重视。
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图3 鼻咽癌患者人数及分布
EBV是Epstein和Barr在非洲儿童恶性淋巴瘤的瘤细胞中提取出的一种嗜人类淋巴细胞的γ疱疹病毒，是一种基因组全长184kb的双链DNA病毒（图4）。EBV感染可表现为增殖性感染和潜伏性感染。不同感染状态表达不同的抗原，增殖性感染期表达的抗原有EBV早期抗原、EBV衣壳蛋白和EBV膜抗原，潜伏感染期表达的抗原有EBV核抗原和潜伏膜蛋白。
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图4 EB病毒模式图
EBV主要感染B淋巴细胞和上皮细胞，涉及病毒多个表面糖蛋白及多个细胞受体的多过程，EBV感染B淋巴细胞主要通过受体CD21及HLA II。在EBV感染上皮细胞过程中，EBV糖蛋白gH/gL首先与细胞表面的整合素和NMHC-IIA结合；接着，gH/gL/gB复合物与EphA2、NRP1相互作用，触发gB的构象转变；最后，gB插入细胞膜，完成EBV的融合（图5）。
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图5 EBV感染过程
EBV可促使不同癌症类型的发展，包括传染性单核细胞增多症，鼻咽癌、淋巴瘤、多发性硬化症、胃癌、霍奇金淋巴瘤、鼻NK淋巴瘤等(表1）。近年来的研究显示它与口腔腺体肿瘤、胸腺瘤、器官移植后肿瘤以及艾滋病病人所患的B淋巴细胞瘤等也有密切联系，因此EB病毒对人体的危害非常大。
表1 EB病毒引起的相关疾病
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EBNA1是一种DNA结合蛋白，由213个氨基酸组成，在EBV各种潜伏状态下均可表达，能稳定病毒环状附加体，维持基因在细胞增殖过程中不丢失。有研究表明，调节信号通路，改变基因的转录程序的EBNA1可使EBV持续处于潜伏感染却不影响细胞中其他基因的表达。EBNA1编码蛋白刺激机体产生的特异性T细胞能有效杀伤EBV阳性肿瘤细胞，而这也是目前EBV治疗型疫苗的主要研究重点。
IL-2是一种具有四个α-螺旋束的细胞因子，主要由活化的T细胞、树突状细胞和B细胞产生，具有诱导和维持T细胞的生物活性，并且能够诱导和增强细胞毒活性，应用IL-2治疗某些疾病、特别是对肿瘤治疗的研究得到了广泛开展，研究已证明结构稳定的高亲和力IL-2受体复合物，对于体外研究IL-2与IL-2受体的相互作用、免疫动物制备抗体或抗体的体外筛选等具有重要意义（图6），有望用于病毒感染、免疫缺陷病及自身免疫病的治疗。
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图6 IL-2与低亲和力、中等亲和力和高亲和力IL-2受体结合的示意图
本申请站在理论的基础上，针对EB病毒及其引起的多发性疾病，结合最新的分子生物学手段，设计一整套方案，力争填补这项国内外空白。同时，本研究也可为EB病毒引起的鼻咽癌等相关EB病毒肿瘤的基因治疗提供实验和理论依据，为该治疗方法最终走向临床实践迈出坚实的一步。
①研究目标创新
将EB病毒特异性抗原基因片段与人的白细胞介素IL-2相融合，然后与pMV261-EBIL进行重组质粒的构建，将pMV261-EBIL导入BCG,并用特异性启动子在BCG（卡介苗）中高效的表达，获得稳定分泌表达的重组BCG，研究重组BCG分泌表达的EB病毒融合蛋白在体外抗肿瘤细胞增殖作用及效应细胞的抗肿瘤活性，用荧光定量PCR、双酶切、Westen blotting、免疫共沉淀鉴定，建立荷瘤小鼠肿瘤模型并进行体内外实验，研究3种重组BCG对EB病毒阳性肿瘤的预防及治疗作用，目标是制备能有效预防和治疗EB病毒阳性肿瘤的亚单位疫苗。
②研究方法创新
首先运用IEDB、SYFPEITHI、BLAST、Uniprot等生物信息学软件，预测N蛋白的理化性质，免疫原性，评估其作为疫苗的可行性。
③疫苗载体创新
融合基因疫苗载体的选择，我们选择了卡介苗，因其有如下优点：
a.卡介苗在特殊的人工培养基上，经数年的传代，对人的致病力降低，但仍保持有足够高的免疫原性，可增强巨噬细胞活性，加强巨噬细胞杀灭肿瘤细胞的能力，活化T淋巴细胞，增强机体细胞免疫功能。因此它能够成为高效的疫苗载体；
b.卡介苗对非结核病相关疾病具有交叉保护作用。从机制上讲，BCG疫苗的这种交叉保护作用可以部分地解释为训练有素的免疫力，这是最近发现的一种先天免疫记忆程序，其特征是巨噬细胞的非永久性表观遗传重编程，导致炎症细胞因子产生增加，从而产生强大的免疫反应。
c.活菌苗中最耐热的一种，其制备、运输及保存都很稳定、方便，接种途径及剂量等为基层接种人员所掌握。
④研究技术创新
a.使用IL-2与EB病毒结合技术创新
IL-2由活化的T细胞、树突状细胞和B细胞产生，具有诱导和维持T细胞的生物活性，IL-2能够诱导活化的CD4+和CD8+T细胞上IL-2和IL-2 Ralpha的表达并刺激它们的增殖。同时，IL-2在维持外周自我耐受性方面也起着重要作用，其机制是通过Fas介导的CD4+T细胞在抗原再刺激后死亡。应用IL-2治疗某些疾病、特别是对肿瘤治疗的研究得到了广泛开展。
b.连接肽创新
运用Linker连接肽连接EB病毒特异性抗原基因片段和IL-2。引入连接肽在一定程度上可以提高融合蛋白的活性和表达量，提高融合的基因的稳定性。此外，连接肽还可以分离和固定功能域，避免功能蛋白间的相互干扰。
c.诱导融合蛋白高效表达创新
通过适当提高培养温度来提高融合蛋白的表达，液体培养基中重组卡介苗培养一周，45℃诱导蛋白表达30min/次，一天一次，总共诱导3天。具体步骤如下：蛋白提取分别取2ml菌液、pMV261-BCG和BCG于45℃诱导45min,PBS洗涤2次后用细菌裂解液（50mmol/LTris)-HCL,2mmol/LEDTA,100mmol/lNacl,100μｇ/ml溶菌酶，0.1%TritonX-100)重悬，300W冰浴超声，10s超声，15s间隔，持续30min。4℃1200r/min(离心半径6cm）离心30min间隔，取上清。
分别取10μｌrBCG、pMV261-BCG和BCG蛋白提取液，利用Westernblot分别进行蛋白质12%SDS-PAGE电泳，80V 45min后调电压至120V 45min。再进行转膜电泳2h,用3%BSA封闭2h,分别用BZLF1抗体和IL-2抗体4℃孵育过夜，24h后用TBST洗膜6次，每次10min，用山羊抗小鼠抗体室温摇床孵育2h，用TBST洗膜６次，每次10min，滴加超敏ECL化学发光试剂至覆盖膜表面后进行曝光,观察结果。

技术路线summernote-img

拟解决的问题
a.将EBNA1与IL-2基因成功融合并重组分泌表达载体pMV261；
b.融合基因EBIL在卡介苗（BCG）中的高效分泌表达与筛选；
c.建立EB病毒阳性荷瘤小鼠动物模型并检测重组BCG的抑瘤作用。
预期成果
发表北大核心期刊论文一篇

2025年7月至2025年12月：
（1）用RT-PCR获取EBNA1与IL-2基因编码序列，获得EBIL融合基因；
（2）构建大肠杆菌-卡介苗分泌表达载体pMV261-EBIL；
（3）电穿孔技术将重组质粒pMV261-EBIL转入BCG；
（4）鉴定筛选出rBCG阳性克隆；
2025年12月至2026年7月：
（1）进行RT-PCR和Western Blotting检测重组卡介苗分子及蛋白水平的表达；
（2）体外抗肿瘤实验：检测其体外抗肿瘤细胞增殖作用及效应细胞的抗肿瘤活性。流式细胞术分析各组淋巴细胞增殖情况、用乳酸脱氢酶法检测特异性CTL、ELISPOT法检测脾脏细胞特异性细胞因子；
2026年7月至2025年12月：
体内抗肿瘤实验：rBCG免疫治疗的研究：建立荷瘤小鼠肿瘤模型，检测rBCG-对肿瘤的免疫治疗作用，流式细胞术检测观察各组肿瘤细胞的坏死和凋亡、CCK-8法检测rBCG对肿瘤细胞特异性杀伤作用、预防性实验、治疗性实验，并对各组数据进行统计学分析；
2025年12月至2026年7月：
撰写论文，结题。
研究积累
（1）信息学预测
①EBNA1的抗原性及保守性：根据生物信息学预测及查询相关文献，EBNA1基因有良好的抗原性及保守性，是未来EB病毒疫苗研发的新方向。
a.EBNA1基因的开放阅读框分析
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图7 EBNA1基因的开放阅读框
b.EBNA1的同源性
进行EBNA1核苷酸序列和与人的蛋白质匹配，BLAST显示（图8），仅429-524一处段和人的EGFR扩增和过度表达蛋白的12-43有44%（14/32）的相似度，占总序列1.95%（14/717），即核苷酸序列比对同源性低，再通过软件进行氨基酸序列比对结构显示氨基酸序列无同源性。因此同源性方面其可以作为候选疫苗。
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图8 EBNA1基因与人的同源性
c.EBNA1蛋白的B细胞表位
利用http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission.html预测EBNA1可能存在的B细胞表位，同时利用https://www.iedb.org/home_v3.php，柔韧性>1.0的氨基酸区段，可及性高于基线1.0的区域，筛选预测的B表位，再按β转角结构权重占40％，表面可及性、可塑性各15％，亲水性占30％的标准筛选出B细胞的优势表位。β转角为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，利于与抗体嵌合，较可能成为抗原表位，表面可及性指蛋白氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性；可塑性指蛋白抗原构象不是一层不变的，多肽链骨架有一定的活动性，活动性强的氨基酸残基，易形成抗原表位；亲水性，氨基酸一般疏水性残基在蛋白内部，亲水性残基在表面，蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有密切联系，综合分析得出可能的B细胞表位25个（表2）。
表2 EBNA1蛋白B细胞抗原表位的预测
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d.EBNA1蛋白的T表位
免疫表位数据库(IEDB)https://www.iedb.org/home_v3.php是由NIAID资助的免费资源。它收录了人类、非人类灵长类动物和其他动物物种中研究的抗体和T细胞表位的实验数据，涉及传染病、过敏、自身免疫和移植，得到T表位（图9）。
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图9 EBNA1蛋白的T细胞表位图
初步得到T表位93个，综合分析表位识别度和测试反应概率，优势表位35个，根据MHC限制性Ⅰ类20个（表3），MHCⅡ型15个（表4）
表3 EBNA1蛋白的CTL细胞表位信息

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表4 EBNA1蛋白的CTL细胞表位信息
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e.EBNA1的空间结构
EBNA1的二级结构中α螺旋46个占19.33%，β折叠0占0%，β转角14占5.88%，延伸连35占14.71%，无规则卷曲143个，占60.08%（图10）。α螺旋、β折叠结构不易形变，较难嵌合抗体，该蛋白占比较低，该蛋白拥有较多的不规则卷曲，更容易和抗体嵌合，三级结构预测无同源二聚体，和模板的相似度96.64%（图11）。
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图10 EBNA1蛋白的二级结构                                                                                                                     图11 EBNA1蛋白的三级建模
(2)实验技术的积累
①温度诱导目的蛋白高效表达技术的成熟：通过适当提高培养温度来提高融合蛋白的表达，液体培养基中重组卡介苗培养一周，45℃诱导蛋白表达30min/次，一天一次，总共诱导3天。
②团队中多名老师从事卡介苗重组十余年，相关实验技术成熟项目中基因连接、电转化、流式细胞术、ELISA、细胞培养技术等已成为团队中常规实验项目。
已取得的成绩
实验组近年来新发表的相关论文：
[1]丁一,李昆芳,彭翱翔,刘乃婕,路嘉慧,薛庆节,屈艳琳.JAK抑制剂治疗中重度COVID-19患者临床疗效及安全性的Meta分析[J/OL].中国医院药学杂志:1-11[2023-03-02].
[2]孔令启,丁一,屈艳琳.新冠病毒N基因编码蛋白的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志,2022,17(07):745-750+756.
[3]丁一,李昆芳,薛庆节,屈艳琳.EB病毒BZLF1基因表位疫苗的预测及构建[J].中国病原生物学杂志,2023,18(01):12-18.

2.已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法
已具备的条件
① 仪器设备完善
我们所依附的实验室是P2实验室，省级重点实验室，济宁医学院“泰山学者”专家实验室。建有专门的分子生物学实验室、蛋白纯化实验室、细胞生物学实验室、动物实验室等，实验室拥有近2000万元的仪器设备，完全满足与该项目相关的实验条件，如凝胶成像分析系统、蛋白电泳及转印系统、成像分析系统、各种容量的离心机、无菌层流室和超净台、活细胞工作站、活体光学成像系统、ECM830电转化仪、TMQ.R-3250型自动台式灭菌器、自动控温摇床、日本产KUBOTA KR/702型低温离心机、CO2培养箱、流式细胞仪、紫外可见双通道可控温分光光度仪(岛津UV-160，JAPAN)、酶联免疫测定仪、凝胶电泳成像系统（Gel Doc2000，BIO RAD，USA）、荧光定量PCR、超纯水系统、等仪器设备及设施。
② 试剂
基因改建常见的酶，pmv261质粒、大肠杆菌培养基、结核分枝杆菌培养基、细胞因子的ELISA试剂盒，LgM、LgG的ELISA试剂盒，流式细胞检测相应的耗材。
③ 已获取融合基因EBIL，并已完成融合基因重组BCG的构建及实时荧光定量对分子水平检测及Western Blotting对融合蛋白蛋白表达水平的检测。
尚缺少的条件
还未进行C57BL/6J小鼠体内外抗肿瘤实验。
解决方法
扩增已构建的重组卡介苗，纯化后实验验证。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 10000.00 购买试剂 5000.00 5000.00
1. 业务费 5500.00 无 2750.00 2750.00
（1）计算、分析、测试费 1000.00 无 500.00 500.00
（2）能源动力费 1000.00 无 500.00 500.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 500.00 无 250.00 250.00
（5）论文出版费 3000.00 无 1500.00 1500.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 4500.00 无 2250.00 2250.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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