济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

济宁医学院 创新创业管理系统

详情

OX1R同源二聚体经ERK-CREB-BDNF介导CUMS抑郁机制研究

申报人：高湘 申报日期：2025-03-25

基本情况

2025创新项目
OX1R同源二聚体经ERK-CREB-BDNF介导CUMS抑郁机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本课题旨在探究OX1R同源二聚体与OX1R单体在抑郁症发病机制中的不同作用，通过检测OX1R同源二聚体的形成，以及二聚体之后信号传导和信号通路的改变，探究同源二聚体对抑郁症的影响，为抑郁症的治疗提供新的理论基础。
       本人参与挑战杯和大学生创新创业项目，参与《童年创伤与父亲在位对成人依恋的影响调查》的研究，承担此项目中报告撰写，数据归纳分析工作。2024年10月加入济宁医学院神经生物研究所，并随实验室老师学习，参与《5-HT2A受体和食欲素受体1二聚化》的研究，为本课题的顺利展开打下基础。
       博士期间主要从事植物病原真菌与寄主免疫互作分子机制的研究。参与国家自然科学基金面上项目（32172370）和国家自然科学基金重点项目 （32030089）。主持中国农业大学校级课题1项（资助6万元）并结题。主要研究成果以第一作者发表在国际顶级学术期刊Nature Communications上。
       工作期间主要从事人类病原真菌分子致病机理研究，和G蛋白偶联受体二聚化在抑郁症中的作用及其机制研究。主持校级思政课题1项，指导大学生创新创业重点项目数项，挑战杯3项等。申报2025年国家自然科学基金青年项目。
       全力支持该项目。提供研究课题和思路指导；提供分子生物学技术，软件分析，生物信息学分析等技术指导。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
高湘 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 细胞实验、质粒构建、Co-IP实验、BRET检测、免疫荧光实验、PLA、动物实验等
李葛昊阳 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 Western Blot、冰冻切片、动物实验等
陈鸿麟 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 细胞培养、Western Blot、Confocal荧光显微观察、冰冻切片、动物实验等

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
刘航 研究生处 否
宋方宇 精神卫生学院 否

立项依据

       随着社会的快速发展，物质需求提升叠加流行病高发态势，导致民众身心压力倍增。据中国精神卫生调查显示，目前我国抑郁症患者9500万人，每年自杀人数约28万，其中40%与抑郁症有关。而目前抑郁症治疗手段存在显著局限性，传统的药物疗法副作用明显，心理干预覆盖率不足，新型治疗靶点开发滞后等问题，拓展抑郁症的治疗途径势在必行。
       食欲素系统通过G蛋白偶联受体（GPCR）介导生理活动，在神经调控中具有广泛性脑区分布特征、兼具睡眠调节与情绪调控功能的双重优势，在抑郁症的发生发展中具有重要作用。而食欲素主要依赖于受体的激活来调控生物体内一系列重要的生理活动。目前已有研究证明OX1R在抑郁症中发挥作用，也有研究表明OX2R发挥作用以及OX1R和OX2R共同发挥作用，但OX1R同源二聚体机制尚未阐明，二聚化对受体功能的影响未知，与抑郁症的病理关联缺乏证据。本研究通过建立OX1R同源二聚体体系，系统研究二聚化对受体信号传到特征的影响，构建抑郁症模型评估治疗潜力。揭示GPCR二聚化新机制，为抑郁症治疗提供新型分子靶点，精准的干预政策以及个性化治疗方案。该研究不仅填补了该领域的研究空白，更为突破当前抑郁症治疗瓶颈提供了创新性解决方案，推动基于受体二聚化理论的新型抗抑郁药物开发，具有重要的科学价值和社会意义。
       在人源胚胎肾母细胞（HEK293T）中，
       1. 验证OX1R同源二聚体的形成。本研究首先利用免疫共沉淀（Co-IP）、生物发光共振能量转移（BRET）、双分子荧光互补（BIFC）以及邻近连接分析技术（PLA）等多种方式在体外和体内分别验证OX1R同源二聚体的存在。具体如下：
     （1）Co-IP：针对目标蛋白的特异性抗体与抗原的结合，通过偶联抗体的Protein A/G磁珠捕获抗原-抗体复合物，从而将与目标蛋白直接相互作用的蛋白质共同沉淀，通过后续Western blot分析，验证互作蛋白的存在。在本研究中，分别构建OX1R-3Flag和OX1R-Myc质粒，在人源胚胎肾母细胞（HEK293T）中过表达这两个质粒，通过Co-IP验证OX1R同源二聚体的形成，设置OX1R-3Flag/EV-Myc组为对照组。
     （2）BRET：是一种无激发光依赖的能量转移技术，利用生物发光蛋白（如荧光素酶）作为供体，荧光蛋白（如GFP）作为受体。当供体与受体靠近时（1-10 nm），供体催化底物发光，能量转移至受体并发射更长波长的荧光，用于定量分析OX1R的同源二聚化特征。在本研究中，分别构建OX1R-Rluc（Renilla 荧光素酶）与OX1R-GFP（绿色荧光蛋白）融合表达载体，共转入HEK293T中，进行BRET检测。检测时，外源加入荧光素酶底物--腔肠素（coelenterazine），检测BRET信号（GFP 发射强度Reading2 / Rluc发射强度）供体 Rluc 催化底物腔肠素氧化发光，记为Reading1；GFP荧光信号记为Reading2，分别设置OX1R-Rluc/EV-GFP和OX1R-GFP/EV-Rluc为对照组。
     （3）BIFC：直接可视化活细胞中的蛋白质相互作用。将荧光蛋白（如YFP）分成两个非发光片段，分别与目标蛋白融合。当目标蛋白相互作用时，荧光蛋白片段互补重组，恢复荧光。。在本研究中，将Venus荧光蛋白截断，分别构建Venus1-155aa::OX1R和Venus156-239aa::OX1R质粒，在HEK293T细胞中过表达这两个质粒，通过BIFC验证OX1R同源二聚体的形成，设置Venus1-155aa::OX1R/Venus156-239aa（EV）和Venus1-155aa（EV）/Venus156-239aa::OX1R为对照组。
     （4）PLA：基于抗体介导的 DNA 连接反应实现蛋白质相互作用原位可视化。针对OX1R特异性抗体分别偶联寡核苷酸探针，当两受体在细胞膜上间距<40 nm 时，互补探针通过 DNA 连接酶形成环状模板，启动滚环扩增生成荧光标记的 DNA 链。每个直径约 200 nm 的荧光信号点代表 1-5个相互作用事件，检测灵敏度达 0.1 fmol/μL。该技术具备单分子分辨率（<40 nm），可保留蛋白质天然构象，并适用于石蜡包埋组织样本和冰冻切片组织样本分析。在本研究中，通过前期构建小鼠CUMS抑郁症模型以及OX1R-TM的治疗挽救模型，取小鼠海马组织进行冰冻切片，进一步通过PLA检测OX1R是否在体内形成同源二聚体。
       2. 细胞水平，检测OX1R二聚化对下游细胞信号通路的作用。
     （1）利用BRET，检测OX1R同源二聚体与G蛋白（Gαq、Gai、Gas或Ga12）的结合情况，与OX1R单体进行对照，使用OX1R激动剂OrexinA进行诱导结合。如，共转Venus1-155aa::OX1R/Venus156-239aa::OX1R/Gas-Rluc三个质粒进HEK293T细胞中进行BRET检测，设置Venus-OX1R/Gas-Rluc作为单体对照组。
     （2）采用ELISA法测定环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）浓度,检测cAMP积累。比较单独表达OX1R和表达OX1R同源二聚体的HEK293T细胞中cAMP的积累。
     （3）利用BRET检测细胞中Ca2+积累；cAMP应答元件（cAMP response element，CRE）等细胞 核内报告基因的表达。比较单独表达OX1R和表达OX1R同源二聚体的HEK293T细胞中Ca2+积累变化和报告基因表达变化等。
     （4）利用OX1R敲降模型验证信号依赖性（Ca2＋）成像
     （5）进行皮质酮处理或LPS刺激，观察应激后二聚化动态及信号活性变化。
     （6）本课题为进一步讨论OX1R同源二聚化改善抑郁样行为的机制研究。从细胞水平方面，利用BRET和MALDI-TOF质谱法确定OX1R同源二聚化的关键TM区，检测不同时间下用Orexin A刺激，孵育不同OX1R-TM，干扰OX1R二聚化的产生，检测HEK293T-OX1R/OX1R细胞中下游BDNF、pCREB、ERK蛋白的表达水平变化以及Ca2+积累、报告基因表达水平变化等。
       3. 动物水平，进一步探究OX1R同源二聚体在体内影响抑郁症发病的作用机制。利用慢性温和不可预知性刺激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）的方法构建小鼠抑郁症模型，实验组分为注射生理盐水的CK对照组（n = 10）、CUMS模型组（n=10）和注射OX1R-TM多肽的CUMS治疗组（n = 10），分为三组。通过行为学检测（小鼠体重，糖水偏好，旷场实验、悬尾实验、强迫游泳实验），以及检测小鼠海马体、皮层中ERK、pCREB、BDNF相关蛋白表达量等，来评估小鼠抑郁状态。与此同时，通过WB和qPCR分别从蛋白和基因表达水平检测小鼠海马体、皮层中相关炎症因子表达水平变化（NLRP3、Caspase1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-a、TGF-1β等）。 
       抑郁症是一种复杂的多因素精神障碍，临床以心情低落，兴趣减退和睡眠障碍（如失眠或嗜睡）为核心症状。世界卫生组织提供的最新统计数据显示，全球有超过3.5亿人受其困扰，患病率达5%，已成为世界上第四大疾病负担[1]。抑郁症的发作与大脑功能渐变有关。
       近期，大量研究表明，食欲素系统与某些精神疾病有着密切的联系[2]。食欲素系统（Orexin/Hypocretin System）由下丘脑分泌的两种神经肽构成，神经肽组分(食欲素A、食欲素B)和受体系统（两类G蛋白偶联受体）。一项关于食欲素和抑郁症之间关系的动物实验模型显示，抑郁样行为严重度与脑内食欲素水平呈显著负相关，人工恢复食欲素表达可使抑郁行为减少[3]。前期已有研究发现，它们的受体功能具有分化，OX1R促进觉醒和应激反应，与焦虑抑郁情绪有关，OX2R主要调节睡眠-觉醒周期[4]。因此对它们的治疗机制进行了探索。双受体拮抗剂（DORAs）通过抑制OX1R/OX2R改善睡眠障碍，选择性OX1R拮抗剂（SORA1s）具有靶向调控边缘系统功能，临床前研究显示抗抑郁效应强于传统SSRIs[5]，这两种受体基因高度保守[6]，OX2R存在于所有脊椎动物中，而OX1R只存在于哺乳动物中，因此OX1R可能是生物进化的产物[7]。OXA可与OX1R和OX2R相结合，且亲和力相当，而OXB对OX2R的亲和力是OX1R的10倍。食欲素受体能够与至少3个G蛋白家族的成员偶联，通过它们调节非选择性阳离子通道，进而影响下游通路发挥作用[8]。如图1所示。

summernote-img

图1 食欲素信号通路图
 
       OXA与OXB之间的结构高度相似。由于OXA中6号和12号及7号和14号氨基酸的桥接结构，使得OXA中6号至10号氨基酸之间的区域结构接近于OXB所对应的区域。这解释了为什么食欲素受体对这两种多肽的分辨能力很差。Trivedi等通过mRNA原位杂交技术研究了OX1R和OX2R编码基因在小鼠脑内的分布，结果显示OX1R在下丘脑腹内侧(ventromedialhypothalamic nucleus,VMH)表达最丰富，在顶盖背侧腱肌张力带(dorsal tenia tecta,DP/DTT)、海马结构(hippocampal formation)、中缝背侧(dorsal raphe,DR)和蓝斑核(locuscoeruleus,LC)中也有高水平表达；而OX2R主要在室旁核(paraventricularnucleus,PVN)表达，在伏隔核(nucleus accumbens,NAc)、丘脑室旁核(paraventricular thalamic nucleus,PVT)等部位也均有表达[9,10]。如图2，图3所示。

   

     summernote-img

图2 食欲素神经元的投射及食欲素受体的分布

       mPFC,内侧前额叶皮层；BNST,终纹床核；AMY,杏仁核；NAc,伏隔核；PVN,下丘脑室旁核；PVT,丘脑室旁核；HIP,海马体；TMN,结节乳头核；LDT/PPT,被盖外侧核/桥脑脚核；DR,中缝背侧；VTA,腹侧被盖区；LC,蓝斑


summernote-img

图3 与OX1R和OX2R激活相关的信号机制和主要第二信使
       
        一项病例对照研究发现抑郁症患者血浆OXA的水平升高，且相比低自杀倾向的患者，高自杀倾向的患者OXA水平更高[11]。在一项随机对照动物实验中研究人员发现，OX1R也参与了抑郁样行为的发生。而SB-334867长期给药可以减轻CUMS引起的小鼠抑郁样行为，并提高前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)中突触后密度-95 (PSD-95)蛋白的表达。此外，CUMS提高了海马和PFC的γ频段的功率，而SB-334867长期给药则逆转了这一现象[12,13]。小剂量的L-NAME (一种非选择性一氧化氮合酶，NOS)与阈值以下剂量的SB-334867协同治疗，可显著缩短实验小鼠强迫游泳和悬尾实验的不动时间[14]，而这些发现与先前的研究相矛盾。Deats等[15]的一项随机对照动物实验发现，小鼠腹腔注射SB-334867显示出促抑郁的结果，FST不动时间增加并降低蔗糖偏好。无独有偶，在另一项随机盲法对照实验中发现，脑内注射SB-334867到实验小鼠腹内侧前额叶(ventromedial prefrontal cortex,vmPFC)脑区没有改变FST的不动时间[16]。
       关于亲和力的问题在此前的研究就已证实Orexin-A优先与OX1R相互作用，但OX2R对Orexin-A和Orexin-B都具有高亲和力。但以上并不是说OX1R在唤醒方面毫无作用，蓝斑核的去甲肾上腺素能神经元接受Orexin能神经元投射，而该区域OX1R大量表达，OX2R却表达较少；桥脚被盖层的胆碱能神经元是上行唤醒系统的关键元素，而该区域的食欲素受体表达OX1R更为突出[17-19]。
       ERK作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）家族中的一员，广泛存在于大脑内，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，它能够通过Ras/ERK信号通路激活一系列蛋白激酶参与多种生理反应，如神经细胞的增殖与分化、细胞形态的维持和细胞凋亡等。CREB是一种选择性与环磷酸腺苷反应元件（cAMP response element,CRE）结合并调节基因转录的核蛋白，广泛分布于海马和大脑皮层，是胞内酶级联和效应基因反式激活的关键，需要被ERK等磷酸化后形成phospho-CREB(pCREB）才能作为转录激活因子，进而调节靶基因BDNF的转录，参与神经元兴奋、发育、凋亡、再生以及突触可塑性调节等多个环节。脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子家族中表达最高的成员[20]，在神经元细胞的增殖、迁移、成熟等过程中起到关键作用[21]，参与神经发生、突触发生及树突生长等多种神经保护过程[22]。
       大量证据表明，抑郁患者血液中BDNF水平降低，然而通过促进BDNF表达[22-25]，能有效缓解抑郁症患者的症状，可见调节BDNF表达在抗抑郁治疗中具有关键作用[26,27]。BDNF/CREB作为海马神经再生的关键信号通路，可促进神经细胞的生长，参与神经突触的重塑，也是大脑调节情绪行为的关键节点[28,29]。其中BDNF作为神经营养因子，在神经系统中调节广泛的细胞功能，包括海马中的树突和轴突生长、神经元存活、突触传递和LTP，在神经系统的发育以及促进神经元分化、细胞存活和神经发生中具有至关重要的作用[30]。BDNF被认为是介导中枢神经系统功能和结构可塑性的重要因子，能够长期调节兴奋性或抑制性突触的结构和功能，同时通过影响树突棘的功能来促进神经发生，并且对各种神经细胞的发育分化与生长再生具有维持和促进作用[31]。
       研究发现，磷酸化的ERK1/2(phosphoERK1/2,p ERK1/2）可以进一步磷酸化转录因子CREB，两者被磷酸化激活可调节BDNF基因转录，以诱导细胞神经发生，从而促进神经元存活，改善抑郁样行为[32]。ERK作为细胞生长、分化和细胞对应激反应的调节因子，被报道有助于各种应激诱导的突触可塑性改变、神经发生，并与抑郁症的发病机制相关[33]。有学者发现CREB在神经元发育期间较为活跃，在神经元生长发育中起重要作用，是神经元分化和存活的重要步骤[34]。作为CREB的下游目标因子，BDNF的合成与CREB磷酸化有关[35]，同时BDNF参与了神经发生，通过上调BDNF水平促进抑郁样行为恢复[36]。抑郁症动物模型证实，BDNF表达降低会导致海马神经发生减少，并且出现抑郁行为，BDNF在抑郁症小鼠海马过表达后可导致神经发生增加[37]。CREB是BDNF信号通路上游的重要调节因子，BDNF的表达部分也会受到CREB的调控。CREB在转录调控位点被BDNF磷酸化，CREB可通过钙依赖机制调控其基因转录，从而对BDNF进行反馈[38]。当BDNF通过激活Trk B促进相关神经细胞存活，上调突触相关蛋白的表达，促进神经突触发生，调节神经元分化和生长，修复神经损伤，发挥抗抑郁作用[39]。此外，CREB还与BDNF/Trk B信号可形成一个正反馈回路，Trk B信号可通过磷酸化激活CREB，磷酸化的CREB随后会激活BDNF以增强Trk B信号，从而增强机体的抗氧化能力，降低神经细胞凋亡率，从而发挥抗抑郁作用。
       研究表明，pCREB参与神经细胞凋亡过程，其部分由BDNF介导，pCREB过表达抑制神经细胞凋亡，而CREB活性的抑制可促进神经细胞凋亡[40]。Wang等[41]发现，显著上调pCREB、BDNF的表达，不仅阻止了海马神经元的凋亡，而且改善了抑郁症小鼠的抑郁样行为。同时还有研究发现，抑郁症小鼠的pERK表达降低，此外pCREB蛋白表达水平以及BDNF的mRNA和蛋白表达水平均下降[42]。由此可知，ERK、CREB、BDNF信号分子共同参与了神经发生的过程，ERK/CREB/BDNF信号通路是抑郁症发生发展的关键的信号通路，也进一步说明了抑郁症与神经发生的密切关系[31]。
       综上可得，研究已证明OX1R和ERK-CREB-BDNF信号通路在改善抑郁症方面均发挥作用，但未曾有人探讨基于ERK-CREB-BDNF信号通路OX1R-OX1R改善抑郁症，因此，本课题将对此进行探究。
    
参考文献：
1. 张艺. 抑郁症发病机制及治疗预测因素的研究进展[J]. 心理月刊. 2025;20(01):215-7.
2. Ying H, Kai Y, Yongbo Z, Lin L. Orexin Receptor Antagonists as Emerging Treatments for Psychiatric Disorders[J]. Neuroscience bulletin. 2020;36(4):432-48.
3. Feng P, Hu Y, Vurbic D, Akladious A, Strohl KP. Chromosome 1 replacement increases brain orexins and antidepressive measures without increasing locomotor activity[J]. Journal of Psychiatric Research. 2014;59:140-7.
4. Matteo C, Laura P, Mariana F, Carmen C, Alexis GP, Mario M, et al. Clinical usefulness of dual orexin receptor antagonism beyond insomnia: Neurological and psychiatric comorbidities[J]. Neuropharmacology. 2024;245:109815.
5. 骆思宏, 张成宇, 梅继林, 李庆琳, 李晓宁. 食欲素(Orexin)受体拮抗剂治疗失眠的研究进展[J]. 卒中与神经疾病. 2024;31(06):609-14.
6. Department of Biophysics UoTSMC, Dallas, Texas, USA, Department of Structural Chemistry MRL, West Point, Pennsylvania, USA, Department of Biophysics UoTSMC, Dallas, Texas, USA, Department of Biophysics UoTSMC, Dallas, Texas, USA, Department of Biophysics UoTSMC, Dallas, Texas, USA, Department of Biophysics UoTSMC, Dallas, Texas, USA, et al. Structure and ligand-binding mechanism of the human OX1 and OX2 orexin receptors[J]. Nature structural & molecular biology. 2016;23(4):293-9.
7. Imamura K, Akagi KI, Miyanoiri Y, Tsujimoto H, Hirokawa T, Ashida H, et al. Interaction modes of human orexin 2 receptor with selective and nonselective antagonists studied by NMR spectroscopy[J]. Structure (London, England : 1993). 2024;32(3):352-61.e5.
8. Tsuneoka Y, Funato H. Whole brain mapping of orexin receptor mRNA expression visualized by branched in situ hybridization chain reaction[J]. eNeuro. 2024.
9. Kayo M, Haruhide K. Orexin 2 receptor (OX2R) protein distribution measured by autoradiography using radiolabeled OX2R-selective antagonist EMPA in rodent brain and peripheral tissues[J]. Scientific Reports. 2022;12(1):8473.
10. Konstantina V, Dimitrios M, P KA, Anastasios S, Stavros B, Stefanos B, et al. Cellular Localization of Orexin 1 Receptor in Human Hypothalamus and Morphological Analysis of Neurons Expressing the Receptor[J]. Biomolecules. 2023;13(4):592.
11. Haimei L, Jing L, Shangda L, Bochao H, Gongde S, Tingting M, et al. Increased Hypocretin (Orexin) Plasma Level in Depression, Bipolar Disorder Patients [J]. Frontiers in Psychiatry. 2021;12:676336.
12. Batoul M, Behrooz K-T, Mohammad R, Adele J, Kambiz R. Enhanced low-gamma band power in the hippocampus and prefrontal cortex in a rat model of depression is reversed by orexin-1 receptor antagonism[J]. IBRO Neuroscience Reports. 2023;15:386-94.
13. Batoul M, Kambiz R, Mohammad R, Adele J, Khakpour TB. Chronic orexin-1 receptor blockage attenuates depressive behaviors and provokes PSD-95 expression in a rat model of depression[J]. Behavioural brain research. 2022;437:114123.
14. Alijanpour S, Khakpai F, Ebrahimi-Ghiri M, Zarrindast M-R. Co-administration of the low dose of orexin and nitrergic antagonists induces an antidepressant-like effect in mice[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2019;109:589-94.
15. Deats SP, Adidharma W, Lonstein JS, Yan L. Attenuated orexinergic signaling underlies depression-like responses induced by daytime light deficiency[J]. Neuroscience. 2014;272:252-60.
16. Department of Pharmacology SoMoRP, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil, Department of Biomolecular Sciences SoPSoRP, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil, Department of Biomolecular Sciences SoPSoRP, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil, Center for Interdisciplinary Research on Applied Neurosciences UoSP, Brazil. Orexin A injection into the ventral medial prefrontal cortex induces antidepressant-like effects: Possible involvement of local Orexin-1 and Trk receptors[J]. Behavioural Brain Research. 2020;395:112866.
17. C P, J F, W R, B R, S O, Y C, et al. A mutation in a case of early onset narcolepsy and a generalized absence of hypocretin peptides in human narcoleptic brains[J]. Nature medicine. 2000;6(9):991-7.
18. Marc T, África F, Luigia C, Inmaculada P, Fernando B. Targeting the orexin/hypocretin system for the treatment of neuropsychiatric and neurodegenerative diseases: from animal to clinical studies[J]. Frontiers in neuroendocrinology. 2023;69:101066.
19. Willie JT, Chemelli RM, Sinton CM, Tokita S, Williams SC, Kisanuki YY, et al. Distinct Narcolepsy Syndromes in Orexin Receptor-2 and Orexin Null Mice[J]. Neuron. 2003;38(5):715-30.
20. Sokrates S, Stephan W, M MC. Brain-derived neurotrophic factor Val66Met polymorphism in depression and thrombosis: SIRT1 as a possible mediator[J]. European heart journal. 2017;38(18):1436-8.
21. S DR, Satoshi D, Viar FM. Role of BDNF in the pathophysiology and treatment of depression: Activity-dependent effects distinguish rapid-acting antidepressants[J]. The European journal of neuroscience. 2019;53(1):126-39.
22. Nafiseh S, Mina D, Hossein RM, Maryam Y, A FB, Sahar S. Effects of melatonin supplementation on BDNF concentrations and depression: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Behavioural brain research. 2022;436:114083.
23. Lucas PdCA, Neusa SdR. Lower levels of brain-derived neurotrophic factor are associated with melancholic psychomotor retardation among depressed inpatients[J]. Bipolar disorders. 2018;20(8):746-52.
24. MinKyung J, Xiaoyang M, JongWook Y, YoonJung S, HyoJong K, DongHyun K. Patient-derived Enterococcus mundtii and its capsular polysaccharides cause depression through the downregulation of NF-κB-involved serotonin and BDNF expression[J]. Microbes and infection. 2023;25(6):105116.
25. Shakila M, Yazen A, Youshay JM, Joshua DDV, Nelson BR, Felicia C, et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) as a biomarker of treatment response in patients with Treatment Resistant Depression (TRD): A systematic review & meta-analysis[J]. Psychiatry Research. 2022;317:114857.
26. Perosa CB, Sica dRN. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and inflammatory markers: Perspectives for the management of depression[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 2020;108:110151.
27. Ya-hui X, Xin-xing W, Ming-jing W, Yue-yun L, Zhe X, Jia-xu C. Influence of progestational stress on BDNF and NMDARs in the hippocampus of male offspring and amelioration by Chaihu Shugan San[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2021;135:111204.
28. 窦姝慧, 张博, 黄树明, 王睿. BDNF信号失调在中枢神经系统疾病发病中的作用[J]. 神经损伤与功能重建. 2022;17(11):640-4.
29. Osamu N, Rong LJ, Takayo O, Kohei T, Wataru N, Shigeki M, et al. Scabronine G Methyl Ester Improves Memory-Related Behavior and Enhances Hippocampal Cell Proliferation and Long-Term Potentiation via the BDNF-CREB Pathway in Olfactory Bulbectomized Mice[J]. Frontiers in Pharmacology. 2020;11.
30. Yuanyuan J, Yuan L, Feng Y, Wanhua S, Tze-Tsang TT, Linyin F, et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons[J]. Nature neuroscience. 2010;13(3):302-9.
31. 王丹辉, 刘永辉, 何乾超, 高玉广, 莫穷泽, 刘琦琦. ERK/CREB/BDNF信号通路在抑郁症中的作用及中药干预研究进展[J]. 浙江中西医结合杂志. 2023;33(12):1161-4.
32. Liang Y, Yuanyuan R, Zhenzhen Q, Ran W, Qinghu Y, Qiutian J, et al. Pterostilbene, an active component of the dragon's blood extract, acts as an antidepressantinadultrats[J]. Psychopharmacology. 2019;236(4):1323-33.
33. Xuhui Z, Yingzhou S, Tuya B, Miao Y, Mingmin X, Yu G, et al. Antidepressant-like effects of acupuncture involved the ERK signaling pathway in rats[J]. BMC complementary and alternative medicine. 2016;16(1):380.
34. Soares LB, Silva STTd, Medeiros AJAd, I TE, A TB, Timm S, et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development[J]. Cerebral cortex (New York, NY : 1991). 2018;28(2):538-48.
35. Pharmacology, Toxicology Laboratory C-IoHBT, Palampur-176061, Himachal Pradesh, India., Scientific Ao, Innovative Research C-IoHBT, Palampur-176061, Himachal Pradesh, India., Scientific Ao, Innovative Research C-IoHBT, Palampur-176061, Himachal Pradesh, India., et al. Dietary Flavonoids Interaction with CREB-BDNF Pathway: An Unconventional Approach for Comprehensive Management of Epilepsy[J]. Current neuropharmacology. 2019;17(12):1158-75.
36. Castrén E, Kojima M. Brain-derived neurotrophic factor in mood disorders and antidepressant treatments. Neurobiology of Disease[J]. 2017;97(PB):119-26.
37. Department of Pharmacology SoP, Nantong University, Nantong, Jiangsu, China., Inflammation Pklo, Molecular Drug Target N, Jiangsu, China., Department of Pharmacy UH, Tongji Medical College, Huazhong University of Science, Technology W, Hubei, China., Department of Pharmacology SoP, Nantong University, Nantong, Jiangsu, China., et al. Antidepressant-like effects of tetrahydroxystilbene glucoside in mice: Involvement of BDNF signaling cascade in the hippocampus[J]. CNS neuroscience & therapeutics. 2017;23(7):627-36.
38. Gómez-Pinilla F, Huie JR, Ying Z, Ferguson AR, Crown ED, Baumbauer KM, et al. BDNF and learning: Evidence that instrumental training promotes learning within the spinal cord by up-regulating BDNF expression[J]. Neuroscience. 2007;148(4):893-906.
39. Atif F, Yousuf S, Sayeed I, Ishrat T, Hua F, Stein DG. Combination treatment with progesterone and vitamin D hormone is more effective than monotherapy in ischemic stroke: The role of BDNF/TrkB/Erk1/2 signaling in neuroprotection[J]. Neuropharmacology. 2013;67:78-87.
40. Ting W, Xiangting L, Tingting L, Min C, Zhonghai Y, Jingsi Z, et al. Apocynum venetum Leaf Extract Exerts Antidepressant-Like Effects and Inhibits Hippocampal and Cortical Apoptosis of Rats Exposed to Chronic Unpredictable Mild Stress[J]. Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM. 2018;2018:5916451.
41. rong WA, fang ML, lei ZZ, zhe HM, yu ZZ, Bin L, et al. Saikosaponin A improved depression-like behavior and inhibited hippocampal neuronal apoptosis after cerebral ischemia through p-CREB/BDNF pathway[J]. Behavioural Brain Research. 2021;403(prepublish):113138.
42. Min C, Guoping H, Qiang L. Maternal deprivation promotes hippocampal neuronal apoptosis via ERK1/2 signaling[J]. Frontiers in bioscience (Landmark edition). 2018;23:1923-32.
       1. GPCRs的二聚体以及二聚体对GPCRs生理功能的调控，是分子生物学和分子药理学研究中的一个新兴领域，我们通过BRET和FRET技术检测活细胞中OX1R同源二聚体形成，以及对下游信号通路的影响。利用HIV TAT蛋白转导肽和受体跨膜肽合成的穿膜肽，MALDI-TOF等方法对OX1R二聚体交界面进行测定，探索同源二聚体的交界面和构象。
       2. 阐明OX1R同源二聚体在抑郁症中的分子作用机制，应用阻碍同源二聚体形成的穿膜肽，检测OX1R同源二聚体对动物抑郁样行为的影响，为研发以二聚体为靶点的高选择性药物提供研究基础。
1.技术路线
summernote-img
图4 细胞实验技术路线示意图

summernote-img
图5 动物实验技术路线示意图
2.拟解决的问题及预期成果
     （1）探究OX1R的二聚化结合区域。
     （2）探究OX1R二聚体对下游信号通路的作用进而分析对于抑郁症的影响。
3. 预期成果
     （1）理论成果：在前期论证OX1R同源二聚体确实存在的基础上，通过质谱检测与BRET检测等方法确定该二聚体的结合关键区域，在细胞水平和动物水平分析，通过体内体外实验探究OX1R二聚化对抑郁症的影响，为抑郁症的发病机制的研究提供更多的理论基础。
     （2）国内外期刊发表论文（或综述)1~2篇。
     （3）参加学术会议（学术讲座）1~2次。
       2025.06-2025.12：通过Co-IP、BRET、BIFC和PLA等技术检测OX1R和OX1R的同源二聚化（已完成）。检测OX1R/OX1R二聚化对细胞内环磷酸腺苷cAMP浓度的影响、cAMP信号分子的变化、Ca2+浓度的影响以及HEK293T-OX1R/OX1R细胞与G蛋白（Gαq、Gαi、Gαs或Gα12）的结合情况，鉴定OX1R/OX1R在G蛋白信号通路上的偏好性。
       2026.01-2026.06：合成OX1R的7个跨膜肽段，通过MALDI-TOF质谱与 BRET在细胞水平检测OX1R/OX1R二聚体的关键TM区；构建小鼠抑郁症模型，在动物水平检测OX1R/OX1R二聚体的关键TM区多肽对小鼠抑郁样行为的改善作用。
       2026.07-2026.12：基于ERK-CREB-BDNF信号通路，分别从细胞水平和动物水平研究OX1R-OX1R在神经炎症和细胞焦亡中发挥的作用以及改善CUMS小鼠抑郁样行为的作用机制。
       2027.01-2027.06：汇总所有细胞和动物水平实验的数据，整理分析数据，撰写结题报告、论文，发表论文。 
       1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
       基于前期工作，本课题已开展如下实验研究：
     （1） 分别构建OX1R-3Flag和OX1R-Myc质粒，在HEK293T细胞中过表达这两个质粒，通过免疫共沉淀实验验证OX1R同源二聚体的形成。见图6。

summernote-img


图6 Co-IP验证OX1R同源二聚体形成

    （2）分别构建Venus1-155aa::OX1R和Venus156-239aa::OX1R质粒，在HEK293T细胞中过表达这两个质粒，通过双分子荧光实验验证OX1R同源二聚体的形成。见图7。

summernote-img

图7 双分子荧光验证OX1R同源二聚体形成

   （3）本实验中，我们为了更好的研究OX1R同源二聚体对抑郁症的影响，构建了CUMS小鼠抑郁症模型，见图8。
summernote-img
图8 小鼠慢性不可预知应激模型（CUMS）制作示意图

   （4）公司合成OX1R的7个TM穿膜肽，TM穿膜肽序列如表1所示。
表 1. 来源于 OX1R 跨膜结构域的合成肽的氨基酸序列。

summernote-img
   
   （5）本项目构建了小鼠CUMS抑郁症模型（图9a），通过小鼠行为学实验验证CUMS模型是否构建成功，根据开放旷场实验，悬尾实验，强迫游泳实验，糖水偏好实验以及体重测试证明其模型构建成功（图9b-f）。为了进一步验证TAT-靶向肽段的干扰作用，将OX1R-TM4和OX1R-TM5通过脑立体定位注射至小鼠侧脑室，提取小鼠海马蛋白，通过Western Blot结果显示，OX1R-TM4和OX1R-TM5肽能挽救由抑郁症引起的BDNF和p-CREB表达量下降这一表型（图9g）。将小鼠海马组织进行冰冻切片，通过PLA实验验证小鼠体内OX1R/OX1R同源二聚体的存在，另外，证实了通过OX1R-TM4和OX1R-TM5肽的挽救治疗，相比CUMS组，CUMS+OX1R-TM4和CUMS+OX1R-TM5组同源二聚体明显减少（图9h，红点）。综上所述，OX1R-TM4和OX1R-TM5肽对小鼠的抑郁样行为有显著改善作用。

    summernote-img
图9 OX1R-TM4和OX1R-TM5干扰OX1R二聚化改善小鼠抑郁样行为
       通过上述实验基本确定OX1R蛋白能够结合形成同源二聚体且与抑郁症发病密切相关，这为本课题的顺利开展奠定了一定的前期实验基础。
已具备的条件：
       团队成员情况：本课题组负责人曾参与《童年创伤与父亲在位对成人依恋的影响调查》的研究，承担此项目中报告撰写，数据归纳分析工作。目前对食欲素受体以及二聚化机制有一定了解，并跟随实验室老师学习小鼠抑郁症造模，为本课题的实验材料、动物模型准备，实验开展与数据分析等打下坚实基础。其他团队成员也均为济宁医学院本科学生，均已提前加入实验室，对G蛋白偶联受体、二聚化及抑郁症背景知识有一定的了解，学习并掌握了基本的分子生物学技术、数据分析处理方法及软件的使用，具备整合、分析、处理实验数据的能力。团队成员学习态度端正、认真刻苦、做事踏实。若本项目得到资助，团队成员将保证认真推动项目实施。
       团队指导老师情况：刘航博士担任山东省医学会行为医学分会青年学组秘书。近年来一直从事病原真菌分子致病机制的研究工作。主要研究成果以第一作者发表在国际顶级学术期刊Nature Communications上。目前，主要从事人类病原真菌分子致病机理研究，和G蛋白偶联受体二聚化在抑郁症中的作用及其机制研究。作为项目成员参与国家自然科学基金重点项目1项和面上项目1项。主持校级项目2项，指导大学生创新创业重点项目数项，挑战杯3项。在国内外学术期刊上发表论文数篇，其中英文论文2篇。
       本项目将依托济宁医学院“泰山学者”实验室完成。实验室有专门的分子生物学实验室、免疫学实验室、细胞生物学实验室、SPF动物房等，为该项目的实施提供了保障。实实验室拥有与该项目相关的实验仪器，包括激光共聚焦显微镜、凝胶成像分析系统、蛋白电泳及转印系统、成像分析系统、超高分辨率显微镜、各种容量的离心机、无菌层流室和超净台及活细胞工作站等设施。可为项目的顺利实施提供保障。
尚缺少的条件：
     （1）还有小部分的相关文献没有查阅到，需要进行进一步的查找和研读。
     （2）由于某些资料的使用权限有限，使得搜集到的数据不够充分，关于OX1R-OX1R同源二聚体特定领域的数据搜集比较困难。
     （3）对于相关领域是理论知识掌握还不够，需要提高理论素养。
解决方法：
     （1）利用好图书馆的文献查阅功能，以及向其他高校图书馆求助，同时向老师和同学寻求帮助。
    （2）对OX1R同源二聚体以及ERK-CREB-BDNF信号通路方面的文献和著作进行深入的阅读，提高自己的理论水平和素养，努力加深论文的理论深度。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 载体构建引物合成、质粒测序；实验所需小鼠、菌株、试剂、耗材的购置 14500.00 5500.00
1. 业务费 8000.00 质粒设计测序及论文出版 5500.00 2500.00
（1）计算、分析、测试费 4500.00 引物设计合成及质粒测序 4500.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3500.00 专家外审费、 版面费 1000.00 2500.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 12000.00 实验所需小鼠、菌株、试剂（包含但不限于限制性内切酶、试剂盒等）、耗材的购置 9000.00 3000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

版权所有： 南京先极科技有限公司        

访问量：0001170046