SRSF1 介导可变剪接调控胰岛β细胞功能障碍的机制研究

申报人：王子云申报日期：2025-03-25

基本情况

所属批次:

2025创新项目

项目名称:

SRSF1 介导可变剪接调控胰岛β细胞功能障碍的机制研究学生申报

项目类型:

创新训练项目

所属学科门类:

医学

所属专业类:

基础医学类

项目来源名称:

学生来源于教师科研项目选题

项目归属学院:

项目期限:

二年期

项目简介:

SF1是重要的可变剪接因子，其在胰岛β细胞功能中的作用尚不明确。我们前期构建β细胞特异性敲除SF1小鼠，发现其胰岛素分泌下降并出现糖尿病表型。本项目拟通过小鼠自然衰老及高糖高脂干预模型，评估SF1缺失对胰岛功能的年龄依赖性影响；构建tamoxifen诱导的β细胞特异性过表达模型，验证SF1回补的功能挽救作用；结合钙成像、电生理与电子显微镜等手段，解析其对钙信号及分泌颗粒的调控机制；并通过转录组测序与剪接调控实验明确其关键靶点及机制。研究有望揭示SF1在糖尿病的新机制，拓展其作为潜在干预靶点的理论基础。

负责人曾经参与科研的情况:

已跟随指导老师做过相关分子生物学、细胞生物学及动物实验，对相关实验技能了解和熟悉。

指导教师承担科研课题情况:

主持山东省自然基金青年项目和山东省医药卫生科技发展计划面上项目各一项。

指导教师对本项目的支持情况:

对本项目提供平台和技术支持，监督课题的实施情况及方案设计，促进课题的顺利实施。

项目级别:

省级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	王子云	医学影像与检验学院	医学影像学（本科）	2023	体外实验验证 SRSF1 对β细胞功能的影响、数据分析、文章撰写。	第一主持人
2	叶靖冉	临床医学院（附属医院）	临床医学（超声医学方向）	2022	解析 SRSF1 介导的可变剪接调控机制。	成员
3	王彦淇	中西医结合学院	临床医学（全科医学方向）	2022	小鼠模型构建及表型验证。	成员
4	曹瑜嘉	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2024	总结梳理 SRSF1 对胰岛β细胞功能变化的调控机制。	成员
5	盖亦阔	临床医学院（附属医院）	临床医学（超声医学方向）	2022	进行 SRSF1 过表达对糖代谢紊乱的作用验证。	成员

指导教师

序号	教师姓名	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	尤雪	科研处	否	第一指导教师

立项依据

研究目的:

糖尿病是一种全球范围内严重威胁人类健康的代谢性疾病，其核心病理机制是胰岛β细胞功能障碍及胰岛素分泌缺陷。近年研究表明，RNA剪接调控在代谢性疾病中扮演关键角色，SRSF1作为一种关键的RNA剪接因子，在多种生理和病理过程中均具有重要功能，尤其在肿瘤中主要通过促进细胞增殖和抑制凋亡发挥原癌基因的作用。然而，SRSF1在胰岛β细胞中的具体生物学功能及其在糖尿病发生与发展中的作用机制尚未明确。因此SRSF1 是否能通过调控β细胞增殖影响糖尿病的发生与发展呢？其潜在的作用机制是什么？

项目前期研究发现，胰岛β细胞特异性敲除 SRSF1（KO）的小鼠随年龄增长出现糖耐量受损及胰岛素分泌功能下降的现象，结合组织学分析发现β细胞占比减少，伴随α细胞占比增加。转录组测序结合分析验证进一步表明，SRSF1缺失使β细胞增殖相关基因表达显著下调，提示其可能通过调控β细胞增殖影响糖稳态。但SRSF1如何通过可变剪接调控β细胞功能的具体机制仍待深入研究。基于此，本研究拟围绕“SRSF1-可变剪接-β细胞增殖”这一核心轴线，系统解析SRSF1在β细胞功能维持中的关键作用，深入探讨其通过可变剪接调控β细胞增殖和胰岛素分泌的具体分子机制。同时，本研究还将阐明 SRSF1缺失在不同年龄阶段加剧糖代谢紊乱的动态规律，为糖尿病的发生发展提供新的机制解释。因此，本研究旨在系统解析SRSF1在β细胞功能调控中的作用，揭示SRSF1在糖尿病发生发展中的作用及潜在干预价值，为开发基于RNA剪接调控的精准治疗策略奠定理论基础。

研究内容:

本项目前期通过将胰岛β细胞特异性表达 Cre 重组酶的 Ins2-Cre 小鼠与 SRSF1 floxed 小鼠杂交，成功构建了β细胞特异性敲除SRSF1的小鼠模型（C57BL/6J-Srsf1f/f:Ins2-Cre，简称KO）。前期研究表明，3月龄的KO小鼠具有明显的胰岛素分泌减少及Ⅰ型糖尿病的特征，转录组分析揭示，SRSF1缺失显著影响β细胞的增殖能力，结合组织学实验证明β细胞占比减少，伴随α细胞占比增加。此外，随年龄增长KO小鼠糖尿病的症状加剧，并伴随胰岛功能明显下降。然而，SRSF1缺失调控胰岛β细胞功能障碍的具体机制仍不清晰。因此，本项目拟围绕以下四个方面展开深入探究：

1）SRSF1 缺失对葡萄糖耐受和胰岛素分泌的年龄依赖性调控。

① 扩大样本量验证：在正常饮食条件下，系统评估不同年龄（3月龄、6月龄和10月龄）的WT（C57BL/6J-Srsf1f/f）和KO小鼠在体重、空腹血糖、糖耐量、胰岛素分泌及β细胞功能指数等糖尿病关键指标上的变化；

② 胰岛功能动态评估：采用组织学及分子生物学技术，检测SRSF1敲除对小鼠胰岛中胰岛细胞的分布与数量、glucagon 与insulin等关键功能蛋白表达变化，并检测对β细胞增殖能力的影响；

③ 高糖/高脂干预模型：对3月龄、6月龄和10月龄的KO小鼠高脂/高糖饮食干预12周，模拟代谢应激状态，比较其与自然衰老进程中胰岛素分泌能力和葡萄糖耐受的差异，明确SRSF1缺失是否在代谢负荷条件下加剧糖尿病表型。

2）SRSF1 过表达的挽救实验对胰岛素分泌和糖稳态的影响。

① 诱导过表达模型构建与验证：采用 Ins2-CreERT2 系统构建胰岛β细胞特异性诱导过表达 SRSF1（OE）的小鼠。6周龄小鼠连续注射 tamoxifen 5 日，诱导后2周内采集胰岛组织，通过 SRSF1 和 insulin 的免疫荧光双染、qPCR 及 Western blot 多层次验证诱导效率与β细胞特异性表达情况；

② 糖代谢功能验证：结合高脂饮食干预12周诱导小鼠糖代谢异常，动态监测小鼠体重、空腹血糖、糖耐量及胰岛素分泌能力等代谢指标，评估 SRSF1 回补对代谢紊乱的改善效果。结合胰岛组织学和分子生物学分析，系统评估 SRSF1 在维持糖代谢稳态中的作用。

3）体外实验验证 SRSF1 对β细胞功能的调控作用。

① 胰岛素分泌功能测定：分离 KO 及 OE 小鼠胰岛，通过葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验，比较分泌功能差异；

② 钙信号通路机制解析：结合钙离子成像技术、膜片钳电生理记录及钙敏染料标记，定量分析 SRSF1 缺失或过表达对β细胞内钙通道活性及刺激响应性的影响，并进一步检测钙通道关键亚型（Cav1.2/1.3）的 mRNA 及蛋白表达变化，探讨其是否为潜在调控靶点。

③ 分泌颗粒超微结构分析：利用透射电子显微镜（TEM）解析胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒的数量、分布和成熟度，揭示 SRSF1 在分泌颗粒形成与释放中的精细调控作用；

④ 细胞系验证： 在 Min6 与 beta-TC-6 两种经典 β 细胞系中构建 SRSF1 敲低与过表达模型，验证胰岛素分泌、钙信号、颗粒结构等相关表型的可重复性和普适性。

4）SRSF1介导的可变剪接调控机制解析。

① 转录组测序：分离 KO 和 WT 小鼠胰岛细胞，抽提总 RNA 进行转录组测序，系统分析 SRSF1 缺失引起的差异可变剪接事件和差异基因表达变化，初步预测潜在下游靶点；

② 生物信息学分析与验证：使用 RT-PCR 和 RT-qPCR 验证关键差异基因的表达水平和剪接模式，并通过 GO/KEGG富集分析明确其涉及的代谢与信号通路；

③ 剪接调控机制解析：通过 CLIP 实验确定 SRSF1 与 pre-mRNA 结合的位置，结合剪接因子识别位点预测，构建 minigene 报告系统，验证其对靶基因剪接的调控作用。

④ 功能回复实验：在 KO 细胞中回补剪接亚型，评估其对β细胞增殖与分泌功能的挽救效应，以进一步确定功能性剪接靶点。

本研究旨在系统解析 SRSF1 在胰岛β细胞功能调控及糖尿病进程中的作用机制，为糖尿病的发病机制研究及潜在干预策略提供新的理论依据。

国、内外研究现状和发展动态:

1）糖尿病与胰岛β细胞

糖尿病是一种全球性重大公共卫生挑战，其核心病理机制主要涉及胰岛β细胞功能衰竭及胰岛素分泌障碍。近年来，糖尿病的发病率持续上升，我国糖尿病患者已接近全球总数的30%，其影响已逐渐上升到了流行病的级别，严重威胁人类健康和生活质量。长期高血糖状态会对多个器官系统造成损害，包括眼睛、肾脏、神经系统及心脑血管系统，最终可能导致糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变、冠心病等并发症，严重影响患者的生活质量和预期寿命[1]。此外，糖尿病作为微血管和大血管疾病的主要诱因，若未能得到及时干预与妥善处理，便会引发一系列严重的健康问题，如失明、肾衰竭、中风等各种并发症，甚至危及生命。

糖尿病主要分为Ⅰ型和Ⅱ型（图1），妊娠期等其他特殊类型的糖尿病相对较少见。其中Ⅰ型糖尿病是一种自身免疫性疾病，也称胰岛素依赖型糖尿病，通常起病于儿童和青少年阶段，因机体免疫系统错误攻击并破坏胰岛β细胞，导致胰岛素分泌严重不足，患者需终身依赖外源性胰岛素维持血糖稳态。而Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者中的大多数[2]，其发病机制涉及胰岛素抵抗和β细胞功能衰退的协同作用。在糖尿病早期，β细胞可通过增强胰岛素分泌来代偿胰岛素抵抗，但随着病程进展，β细胞逐渐衰竭，胰岛素分泌能力下降，导致血糖持续升高。肥胖、年龄增长及不健康的生活方式均是Ⅱ型糖尿病的重要诱因。目前的治疗手段，如口服降糖药和外源性胰岛素补充，仅能短期内改善血糖水平，却无法阻止β细胞功能的进一步衰退或逆转病程。因此，深入解析β细胞功能调控机制，有望为糖尿病的精准治疗提供科学依据。 summernote-img

图 1. I(A)型和 II(B)型糖尿病的发病机理。

研究表明，β细胞功能衰退及有限的再生能力是糖尿病发生发展的关键驱动因素[3]，主要表现为胰岛素合成能力下降、胰岛素分泌异常、β细胞凋亡增加以及增殖能力受损。在糖尿病进程中，β细胞功能障碍始终占据核心地位，因此，如何有效保护β细胞功能、促进β细胞增殖与再生，已成为糖尿病治疗领域的重要研究方向，也为开发更精准、高效的干预策略提供了新的可能性。

2）SRSF1 与细胞增殖

SR 蛋白家族是一类富含丝氨酸/精氨酸的 RNA 结合蛋白，能够调控前体 mRNA 的可变剪接，在多种细胞过程中发挥关键作用（图2A）。SRSF1（丝氨酸/精氨酸富集剪接因子 1）作为最早被鉴定出来的 SR 蛋白家族的一员，参与调控许多细胞代谢、细胞周期、凋亡和分化等基本生物学过程，并在 mRNA 剪接及稳定性调控中发挥重要作用[4]。近年来，RNA 结合蛋白在细胞功能调控中的作用备受关注。已有研究表明 SRSF1 的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。例如，它可通过调控 Neat1 稳定性驱动胶质瘤细胞增殖[5]，并通过 AKT/Myc 、Trim37 等信号通路加速乳腺癌等恶性肿瘤进展[6]。在翻译调控层面，SRSF1 通过 S6K1 异构体激活 mTOR/4EBP1 磷酸化轴，协同增强促增殖蛋白翻译并抑制凋亡（图2B）。尽管 SRSF1 在癌症领域的作用机制已较为明确，主要通过促进细胞增殖并抑制凋亡发挥作用，但其在胰岛β细胞增殖调控及糖代谢稳态中的作用尚不清晰。

图 2. 多功能 SR 蛋白 SRSF1（A）和 SRSF1 在乳腺上皮细胞转换中的调控（B）。

A 引自 Shipra Das. et al. Mol Cancer Res.2014 。 B 引自 Olga Anczuków et al. Nat Struct Mol Biol.2012。

3）SRSF1 与糖尿病

RNA 剪接在维持胰岛β细胞功能和存活中发挥重要作用，越来越多的研究表明，剪接因子的异常调控可能与糖尿病的发生发展密切相关[7]。其中，SRSF 家族成员（如 SRSF6、SRSF2）已被证实在β细胞的功能维持、去分化及凋亡调控中起关键作用。研究表明，剪接因子 SRSF6 通过调控特定的剪接事件，影响胰岛β细胞的功能与存活，其异常表达可能导致β细胞功能障碍和凋亡。此外，SRSF6 的 RNA 结合图谱分析显示，其能够调控多个糖代谢相关基因，进一步支持其在β细胞存活与功能调控中的重要性[8]。同样，SRSF2 在维持β细胞特性及调控葡萄糖稳态方面至关重要。SRSF2 缺失的小鼠表现葡萄糖不耐受及胰岛素分泌功能下降，最终导致糖尿病样表型[9]。此外，胰岛素受体（INSR）的可变剪接受胰岛素信号调控，并在β细胞存活过程中发挥关键作用[10]，而 SRSF1 可能在这一过程中发挥调控作用，但具体分子机制并未阐明，缺乏动物模型验证，相关生物学效应仍不清晰，因此仍需进一步探索其潜在调控机制及生理意义。

基于此，项目前期研究发现，在胰岛β细胞中特异性敲除 SRSF1（KO）的小鼠，随着年龄增长逐渐表现出糖耐量受损及胰岛素分泌功能下降的症状。转录组测序分析显示，SRSF1 缺失导致β细胞增殖相关的基因表达显著下调，并伴随胰岛β细胞比例减少，同时α细胞比例显著增加，提示SRSF1可能通过调控β细胞增殖影响葡萄糖稳态。然而，SRSF1 如何通过可变剪接介导β细胞增殖及胰岛细胞类群改变的机制，仍有待深入研究。因此，深入解析SRSF1在β细胞中的可变剪接事件，有望为糖尿病的精准治疗提供新思路。

图 3. 本项目关键科学问题。

参考文献：

[1].黄涛. 《关爱糖尿病患者，关注血糖，远离并发症》创作介绍. in 广州市第十四届健康教育与健康促进学术交流活动. 2024. 中国广东广州.

[2].赵一帆, 不同类型的糖尿病患者如何科学运动？. 家庭生活指南, 2024. 40(06): 第129-130页.

[3].朱元媛, 不同病程2型糖尿病患者胰岛β细胞功能变化及相关因素研究, 2017, 南京中医药大学.

[4].Gonçalves, V. and P. Jordan, Posttranscriptional regulation of splicing factor SRSF1 and its role in cancer cell biology. BioMed Research International, 2015. 2015(1): p. 287048.

[5].Zhou, X., et al., The RNA-binding protein SRSF1 is a key cell cycle regulator via stabilizing NEAT1 in glioma. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2019. 113: p. 75-86.

[6].Li, C., et al., Circ_0058106 promotes proliferation, metastasis and EMT process by regulating Wnt2b/β-catenin/c-Myc pathway through miR-185-3p in hypopharyngeal squamous cell carcinoma. Cell Death & Disease, 2021. 12(11): p. 1063.

[7].Juan-Mateu, J., et al., SRp55 Regulates a Splicing Network That Controls Human Pancreatic β-Cell Function and Survival. Diabetes, 2017. 67(3): p. 423-436.

[8].Alvelos, M.I., et al., The RNA-binding profile of the splicing factor SRSF6 in immortalized human pancreatic β-cells. Life Science Alliance, 2021. 4(3): p. e202000825.

[9].You, X., et al., SRSF2 is essential for maintaining pancreatic beta-cell identity and regulating glucose homeostasis in mice. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 2024. 1871(8): p. 119845.

[10].Malakar, P., et al., Insulin receptor alternative splicing is regulated by insulin signaling and modulates beta cell survival. Scientific Reports, 2016. 6(1): p. 31222.

创新点与项目特色:

1）靶点机制创新

胰岛β细胞功能的稳定维持依赖于一系列基因及细胞信号通路的精确调控，转录调控因子在胰岛β细胞功能的维持，胰岛素合成与分泌的过程中发挥关键作用。然而，剪接蛋白及其调控的可变剪接事件在β细胞功能调控及胰岛素分泌中的具体作用机制尚不清晰。本研究利用胰岛β细胞特异性敲除 SRSF1 小鼠模型，结合高通量测序技术，系统解析 SRSF1 在β细胞中调控的特有可变剪接事件，并深入探讨这些异常剪接事件导致胰岛β细胞功能异常的作用机理。因此，本项目首次揭示 SRSF1 在糖尿病发生发展中的关键作用，并系统解析其通过可变剪接调控胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌的分子机制。研究成果不仅加深了对可变剪接事件在胰岛素正常与异常分泌中的功能认识，还为 RNA 剪接调控在糖尿病中的作用提供了新的理论依据。

2）临床导向特色

本研究聚焦于RNA剪接调控在β细胞功能维持中的关键作用，旨在揭示剪接因子 SRSF1通过可变剪接事件调控β细胞功能的分子机制，并解析其在糖尿病病理进程中的动态变化。基于SRSF1介导的异常剪接事件，研究将进一步筛选 RNA 剪接调控的潜在干预靶点，并采用SRSF1过表达及剪接亚型补偿策略，评估其在改善β细胞功能和维持糖代谢稳态中的作用。因此，本研究的特色在于从 RNA 剪接层面探索糖尿病发生发展的新机制，并结合基因编辑、RNA干预及过表达策略，系统验证 SRSF1 及其调控的可变剪接事件是否可作为糖尿病治疗的新靶点。通过多层次的体内外实验，本研究为 RNA 剪接调控策略在糖尿病精准治疗中的应用奠定了科学基础，并为未来开发 RNA 靶向干预的新型糖尿病治疗手段提供理论依据。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

1）技术路线

图 4. 技术路线图

2）拟解决的问题

① 利用胰岛β细胞特异性敲除 SRSF1 小鼠模型，结合高通量测序和生物信息学分析，系统筛选 SRSF1 调控的特定可变剪接事件，深入解析其在β细胞增殖及胰岛素分泌中的作用，明确 SRSF1 在维持β细胞功能中的生理意义，从而系统阐明 SRSF1 介导的可变剪接在β细胞功能调控中的分子机制。

② 研究 SRSF1 介导的异常剪接事件在糖尿病进程中的动态变化，揭示其在β细胞功能失调及糖代谢紊乱中的关键作用，评估其作为潜在治疗靶点或分子标志物的临床应用价值，为糖尿病的精准干预提供理论依据。

3）预期成果

① 本项目预期在前期研究的基础上，深入解析 SRSF1 的调控作用靶点，揭示其通过可变剪接调控胰岛β细胞增殖的分子机制，为深入理解 RNA 剪接在β细胞功能维持及糖尿病发生发展中的作用提供新的理论依据。

② 在国内外杂志发表研究论文1-2篇。

项目研究进度安排:

项目计划实施年限是2年，时间是2025.06-2027.06

1)2025.06-2025.12:

按年龄分组长期监测 KO/WT 小鼠体重、空腹血糖、糖耐量、胰岛素分泌及β细胞功能指数等糖尿病关键指标上的变化；检测 SRSF1 敲除对胰岛细胞的分布、数量及glucagon、insulin 等关键功能蛋白表达水平的影响，并评估β细胞增殖能力的变化。

2)2025.12-2026.06:

高脂饮食诱导糖尿病模型后，tamoxifen 诱导 SRSF1 过表达，连续监测小鼠体重、空腹血糖、胰岛素分泌等代谢指标，并结合组织学和分子生物学分析，系统评估 SRSF1在糖代谢稳态中的功能。分离胰岛进行体外实验，通过 GSIS 、钙信号通路分析、分泌颗粒成熟度分析及细胞系验证进而明确 SRSF1 过表达对β细胞功能的影响。

3)2026.06-2026.12:

通过转录组测序和 CLIP 实验解析 SRSF1 调控可变剪接的分子机制，发现其结合位点及靶基因；基于剪接亚型回补实验证实 SRSF1 缺失导致的剪接异常直接损害β细胞增殖与分泌功能，建立“RNA结合－剪接调控-表型效应”的因果轴，验证钙通道及 SRSF1 下游互作网络。

4)2026.12-2027.06:

整理数据，撰写并发表论文。

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

（1）与本项目相关的研究工作基础

课题组部分成员作为参与作者在 oncology letters 发表题为《Advances in the study of the mechanism of action of miR-22 in liver lesions》的文章。该研究主要涉及 miR-22 与肝脏病变的关系，其中包括探讨糖尿病与非酒精性脂肪肝之间的紧密联系，揭示 miRNAs 在胰岛素信号转导、糖代谢调节及肝脂代谢中的重要作用，为糖尿病相关机制研究奠定了坚实的基础。

其次，在导师的科研指导下，课题组致力于 RNA 结合蛋白 SR 家族在代谢调控中的分子机制研究，并在该领域取得一系列重要成果，导师以第一作者或通讯作者身份在 SCI 期刊发表了多篇标志性论文：

1）SRSF2 is essential for maintaining pancreatic beta-cell identity and regulating glucose homeostasis in mice,该研究发表于《BBA-Molecular Cell Research》,首次揭示 SRSF2 通过调控胰岛β细胞命运决定，参与糖尿病发生发展的分子机制，为理解β细胞稳态的维持提供了新视角。

2）SRSF1 Is Required for Mitochondrial Homeostasis and Thermogenic Function in Brown Adipocytes Through its Control of Ndufs3 Splicing，该研究发表于《Advanced Science》，阐明 SRSF1 通过调控线粒体复合物I亚基的可变剪接，影响棕色脂肪细胞的线粒体稳态和产热功能，揭示了一条新的脂肪代谢调控通路，为肥胖和糖尿病相关代谢性疾病的研究奠定了理论基础。

3）SRSF2 is a key player in orchestrating the directional migration and differentiation of MyoD progenitors during skeletal muscle development，该研究发表于《eLife》，该研究系统解析了 SRSF2 在骨骼肌发育中的动态调控网络，揭示了其在肌肉祖细胞迁移和分化中的关键作用。

因此基于课题组在 SR 蛋白家族研究中的深厚积累，特别是 SRSF2 在维持胰岛β细胞稳态中的核心调控作用，同时结合 SRSF1 与 SRSF2 在结构及功能上的高度同源性，本课题组已熟练掌握本项目所需的实验技术、研究方法及科学思路，具备独立设计与实施课题的能力，同时具备良好的团队协作精神，为本项目的顺利推进奠定了坚实的基础。

（2）已取得的研究工作成绩

1） 3月龄 KO 小鼠的糖耐量受损及胰岛素分泌减少。

为研究 SRSF1 在β细胞中的作用，我们将 SRSF1f/f 小鼠与由 Ins2 启动子驱动的Cre（RIP-Cre）小鼠杂交，成功构建了β细胞特异性敲除 SRSF1 小鼠模型（KO）。Western blot 结果显示，2月龄（2M）和8月龄（8M）KO 小鼠胰岛中 SRSF1 蛋白水平显著降低（图5A）。3月龄（3M）KO 小鼠的体重与对照组相比无显著差异（图5B），在禁食及复食状态下的血糖和胰岛素水平亦相近（图5C）。然而，葡萄糖耐量试验（GTT）显示，KO 小鼠的葡萄糖耐量受损，曲线下面积（AUC）较对照组显著增加（图5D）。为探究 KO 小鼠的高血糖是否与胰岛素分泌缺陷相关，我们检测了血浆胰岛素水平。结果显示，葡萄糖刺激后30min和60min，3M KO 小鼠的血浆胰岛素水平均低于对照组（图5E）。此外，精氨酸刺激的胰岛素分泌实验显示，KO 小鼠经精氨酸刺激后，诱导的胰岛素分泌量减少（图5F）。上述结果表明，SRSF1 的缺失会导致葡萄糖耐量受损及胰岛素分泌功能下降。进一步对小鼠胰岛形态进行分析，HE 染色结果显示，各组胰岛大小和数量无显著差异（图5G），但胰岛素与胰高血糖素的免疫组化染色表明，KO 小鼠胰岛中α细胞占比高于对照组，而β细胞占比降低（图5H），因此 KO 小鼠胰岛可能出现了β细胞功能损伤。

图5. 3M KO 小鼠表现出糖耐量受损及胰岛素分泌减少。

（A）评估2M和8M WT和 KO 小鼠的胰岛中 SRSF1 蛋白表达水平，并对 WT 组和 KO 组之间 SRSF1 蛋白水平进行定量分析。（B） 3M WT 与 KO 小鼠体重比较。（C）比较3M WT 和 KO 小鼠的空腹血糖水平（左图）和空腹胰岛素水平（右图）。（D） 3M WT 和 KO 小鼠葡萄糖耐量试验（GTT），右图为 GTT 的曲线下面积（AUC）定量分析结果。（E） 3M WT 和 KO 小鼠的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验结果。（F）3M WT 和 KO 小鼠的精氨酸刺激胰岛素分泌实验结果。（G） 3M WT 和 KO 小鼠胰腺组织切片 HE 染色的代表性图像（比例尺，100μm）。（H） 3M WT 和 KO 小鼠胰腺切片的免疫荧光染色，胰高血糖素（红色）和胰岛素（绿色）标记的代表性图像（比例尺，50μm）。图片左下方为胰岛α细胞和β细胞的定量分析。所用小鼠均为3M雄性，每组n = 4只。

2）RNA-seq 分析揭示 SRSF1 缺失对β细胞增殖的抑制作用。

为探究 SRSF1 缺失的分子机制，我们分离3月龄 KO 小鼠与对照小鼠的胰岛进行RNA 测序（RNA-seq）。结果显示，KO 小鼠胰岛中：α细胞标志物胰高血糖素（Gcg）及其关键调控因子（Arx、Etv1、Fev、IRx1、Irx2、Kcnj3、Mafb、Pou6f2和Tspan12）的mRNA 水平显著上调，同时祖细胞标志物 Gata6、Neurog3 和 Rbp4 的表达量也显著升高（图6A），上述变化与 KO 小鼠胰岛α细胞数量增加的表型一致（图5H）。此外，胰岛素相关基因（Ins1、Ins2）及下游胰岛素原加工酶（Cpe、Pcsk2）的 mRNA 水平也显著上调（图6A），提示可能存在代偿性应答机制。

在 KO 小鼠胰岛中，显著下调的差异表达基因包括多个与细胞增殖密切相关的关键基因。如图所示，尽管细胞周期相关基因（Cdk1、Cdc20、Ndc80、Ccnb1、Ccnb2等）在胰岛中基础表达水平较低，但 KO 组中其表达量仍显著降低（图6A）。此外，增殖相关基因（Msln、Stmn1、Nupr1、Anxa3、Defb1）的表达也呈现下降趋势。值得注意的是，KO胰岛中核糖体基因整体表达量降低约50%（图6B），表明β细胞的蛋白质合成能力可能受损。进一步的 GO 分析表明，差异基因显著富集于细胞质翻译、细胞周期正向调控、蛋白质折叠、胰腺内分泌发育和胰岛素代谢等生物学过程，这些通路均与β细胞增殖及功能维持密切相关（图6C）。通过 Ki67 染色评估β细胞增殖水平，发现3M 及1M KO 小鼠胰岛β细胞增殖能力显著下降（图6D）。上述结果证实，SRSF1 的缺失对出生后β细胞增殖具有显著抑制作用。

图6. RNA-seq 分析揭示3M KO 小鼠胰岛的增殖缺陷。

（A） 3M KO 小鼠胰岛中筛选出的差异表达基因。所有显示的基因均为人工筛选，经 FDR 校正 P 值<0.05。（B）火山图显示了3M KO 小鼠胰岛中核糖体相关基因的表达变化，下调基因在顶部突出显示。（C）通过 RNA-seq 鉴定的差异表达基因分析揭示的重要信号通路。（D）对3M 和 1M WT 和 KO 小鼠胰腺切片进行胰岛素（绿色）、Ki67（红色）和 DAPI（蓝色）的免疫荧光染色（比例尺：50 μm）。右图显示了β细胞内 Ki67+细胞的定量分析结果。

3）SRSF1 缺失引发10月龄 KO 小鼠的胰岛扩张障碍。

为揭示年龄因素对 KO 小鼠血糖调控能力的影响机制，研究显示，10月龄 KO 小鼠的空腹血糖水平显著升高（图7A），糖耐量严重受损（图7B），且葡萄糖及精氨酸刺激后的胰岛素分泌不足情况进一步恶化（图7C-7D）。这些发现共同揭示，KO 小鼠的血糖控制能力随年龄增长呈进行性衰退。通过对10月龄小鼠胰腺切片进行 HE 染色分析发现，KO组小鼠胰岛大小及数量均显著低于对照组（图7F）。因此，SRSF1 缺乏导致10M小鼠的胰岛质量无法扩大，这与小鼠在衰老过程中血糖控制能力加剧恶化的现象一致。

图7. 10M KO 小鼠胰岛扩张受限。

（A）10M WT 和 KO 小鼠空腹和复食状态下胰岛素水平的比较。（B） 10M WT 和 KO 小鼠葡萄糖耐量试验（GTT），右图显示 GTT 的曲线下面积（AUC）定量分析。（C） 10M WT 和 KO 小鼠葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验结果。（D）精氨酸刺激小鼠胰岛素分泌的实验结果。（E）10M WT 和 KO 小鼠胰腺组织切片 HE 染色代表性图像（比例尺，400μm）。（F） 3M 和10M WT 与 KO 小鼠胰岛总数目统计分析。（G） 3M 和 10M WT 与 KO 小鼠胰岛总面积的比较分析。（H）10M WT 与 KO 小鼠不同大小胰岛的分布评估。（I）10M WT 与 KO 小鼠胰岛质量的比较分析。所用小鼠均为雄性，每组n = 4只。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

（1）已具备的条件

本研究得益于学校对科研创新的高度重视和良好环境。校内建有10个省级重点实验室，并设有贺林院士新医学临床转化工作站和生物信息研究中心。同时，本研究得到了济宁医学院实验动物中心、公共科研平台及附属医院的大力支持。中心配备了先进的实验仪器设备，包括细胞培养室、激光扫描共聚焦显微镜、真核细胞电穿孔仪、ABI3500基因测序仪、质谱仪、荧光倒置显微镜、多功能酶标仪、普通 PCR 仪、实时荧光定量 PCR 仪、体视显微镜、小动物成像系统（IVIS）、流式细胞分析仪、高通量组织研磨仪、核磁共振仪等，为项目研究提供了坚实的硬件保障。

济宁医学院实验动物中心拥有符合国家标准的 SPF 级动物房（SYXK（鲁）2018 0002），配备完善的实验设备，能够满足 SPF 级实验动物的饲养需求。国家基因库—济宁临床样本分库已通过中国人类遗传资源管理办公室备案（国科遗办审字〔2017〕1300号），可提供高质量的生物样本及基因数据资源支持。此外，研究所需实验试剂均有稳定的商品化供货渠道，获取便捷。本项目组已具备开展细胞培养、基因转染、稳定细胞株构建、核酸与蛋白提取、免疫印迹、实时荧光定量 PCR 、免疫组化等实验操作的能力，并在分子、细胞及动物水平实验方面积累了丰富经验，为项目的顺利实施提供了有力保障。

（2）尚缺少的条件及解决方法

动物实验中心的笼位相对紧张，已与相关负责人取得联系，待动物房整理后将继续扩大样本量并开展实验。

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	20000.00	购买材料、测序及论文出版	17000.00	3000.00
1. 业务费	9000.00	测序及文章润色	6000.00	3000.00
（1）计算、分析、测试费	6000.00	RNA-seq	6000.00	0.00
（2）能源动力费	0.00	无	0.00	0.00
（3）会议、差旅费	0.00	无	0.00	0.00
（4）文献检索费	0.00	无	0.00	0.00
（5）论文出版费	3000.00	润色	0.00	3000.00
2. 仪器设备购置费	0.00	无	0.00	0.00
3. 实验装置试制费	0.00	无	0.00	0.00
4. 材料费	11000.00	耗材、试剂及小鼠购买	11000.00	0.00

结束

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