济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

济宁医学院 创新创业管理系统

详情

基于金属/槲皮素纳米复合物的多模式抗菌涂层的制备与性能研究

申报人：刘艳婷 申报日期：2025-03-24

基本情况

2025创新项目
基于金属/槲皮素纳米复合物的多模式抗菌涂层的制备与性能研究 学生申报
创新训练项目
工学
材料类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
医疗器械表面细菌生物被膜感染严重危害人类健康。与浮游细菌相比，生物被膜内的细菌被自产的胞外聚合物基质所保护，对多种化学杀菌剂和抗生素有顽强的抗性。与杀灭已形成的生物被膜相比，延缓甚至防止生物被膜在表面的形成在解决细菌感染问题上更具策略上的优势。申请人前期研究发现超小Fe3+/槲皮素纳米复合物（QF NCs）展现出优异的光热和类过氧化物酶活性。然而，如何将QF NCs修饰到材料表面从而赋予表面原位抗菌活性还有待进一步研究。本项目旨在将透明质酸包裹的QF NCs修饰到表面上。一方面，透明质酸修饰的表面能够抵御细菌黏附；另一方面，在细菌微环境下，透明质酸被降解，从而暴露出具有杀菌活性的QF NCs，进而在抗细菌黏附和杀菌的双重作用下抵御生物被膜的形成。同时，项目拟在深层次上研究此抗菌表面在光热、类过氧化物酶作用和抑制群体感应多重作用下的杀菌机制，为此抗菌表面的研究应用提供科学依据和理论支撑。
参与2024年大学生创新创业训练项目:cx2024025z

1. 2024年立项山东省自然科学基金面上项目，主持，10万，2025-01至2027-12，在研。

2. 2021年立项山东省自然科学基金青年基金，主持，15万，2022-01至2024-12，在研。

3. 2023年立项济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金，主持，10万，2023-01至2025-12，在研。

4. 2023年获横向课题经费，《双层抗蛋白吸附/抗菌薄膜的工艺开发》，主持，50万。 

给予课题指导、实验指导以及论文撰写指导
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
刘艳婷 医药工程学院 制药工程（本科） 2023 构建抗菌涂层PTB - PF@MFNCs
王茂国 医药工程学院 制药工程（本科） 2023 构建抗菌涂层PTB - PF@MFNCs
张梦琪 医药工程学院 生物制药（本科） 2024 整理文献，收集并处理数据，论文写作
李德堂 医药工程学院 制药工程（本科） 2023 细菌培养与接种
李玉洁 医药工程学院 生物制药（本科） 2024 抗菌性能测试
牟志昊 医药工程学院 生物制药（本科） 2024 抗生物被膜性能测试

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
渠阳翠 医药工程学院 否

立项依据

        近年来，植/介入医疗器械（包括心脏、骨科和软组织植入物、内窥镜、医用导管、介入治疗仪探头等）取得了巨大的增长。尽管植介入医疗器械极大地改善了患者的生活，但与此同时，其随之带来的医疗器械表面微生物感染的风险又成为了一个极受关注的问题。例如，内窥镜的交叉感染在医疗器械感染中位居首位；放置三天或三天以上的医用导管和部件细菌感染的风险极高，尤其是在切口部位，细菌会随着血液流入人体，造成更大的人体感染；此外治疗疝气所使用的补片在植入手术部位后经常也会因发生感染而带来一系列的副作用。植介入医疗器械一旦发生感染，细菌会在材料和生物组织之间形成一层生物被膜，此生物被膜不仅为会为后续细菌的黏附提供有力的生存环境，还会阻止免疫细胞或其它抗菌药物的进入，并可直接导致植入体组织周围坏死，使病人残疾甚至死亡。临床上多采用口服或注射抗生素的方法来预防/治疗细菌感染，但是抗生素会产生耐药性且靶向性不足。因此，构建表面具有抗菌功能的医疗器械成为预防医疗器械细菌感染的有效方法。 

      从细菌生物被膜形成的机制出发，以解决医疗器械表面细菌生物被膜感染问题为主要目标，本研究课题的整体设计思路如下：在牛血清白蛋白（BSA）上预先修饰上含氟聚合物（PF），而后在BSA发生相转变形成相转变牛血清白蛋白薄膜（PTB）的过程中添加金属/槲皮素纳米复合物（MFNCs），一步法构建具有“双重抗细菌黏附-多重杀菌性能”的抗菌涂层PTB-PF@MFNCs（图1），并抑制生物被膜的形成。本研究课题拟以革兰氏阴性菌-铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌（S. aureus）为模型细菌，借助PTB 的抗污性能、MFNCs的光热性能和类过氧化物酶性能以及黄酮类化合物抑制群体感应性能，研究涂层对两种细菌的抗菌和抗生物被膜性能。同时，本课题拟在深层次上通过计算化学等手段研究抗菌涂层的抗菌机理。本项目的实施不仅能够为抗菌表面的构建提供新的思路和方法，提供重要的基础理论价值，推动抗菌材料的发展；还将为生物材料表面功能化及抗菌性医疗器械创新提供理论依据和技术支撑。
            summernote-img
图1. （a）医疗器械表面PTB-PF@MFNCs抗菌涂层的应用和构建示意图，（b）作用机制及其（c）杀菌机理示意图。
       细菌感染已经成为一个严重威胁人类健康的全球性问题。据世界卫生组织统计，全球每年有近百万人因细菌感染而发病甚至死亡，用于治疗的费用高达数千亿美元，而且这两项数值仍在逐年激增。预计到2050年，细菌感染将成为危害人类生命的“第一大杀手”[1,2]。这其中，65%以上的临床感染疾病（如导管相关性血流感染和导尿管相关性尿路感染）与医疗器械或植入物表面由细菌形成的生物被膜有关[3]。生物被膜是细菌黏附于接触表面后，分泌的多种胞外聚合物（EPS）将其自身包裹其中而形成的大量细菌聚集膜样物[4]。这种结构复杂的聚集体能够为其内部的细菌提供良好的保护作用。相比于单个的浮游细菌，生物被膜内的细菌对抗生素等药物和宿主免疫系统的抗性显著增强，导致其引起的感染慢性化和反复化，给后期治疗带来很大的困难。针对已经形成的生物被膜，目前临床上的主要方法是持续使用大剂量的抗生素将其杀灭和清除。然而这一方法造成的严重后果是加速了细菌耐药性的形成，导致了以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）为代表的一系列传统抗生素无法杀灭的“超级细菌”的出现[5]。然而，生物被膜的复杂性和顽固性使其很难被彻底清除，而且现有疗法在杀灭细菌的同时往往会伴随着对正常细胞和组织的伤害。与杀灭已形成的生物被膜相比，延缓甚至防止生物被膜在表面的形成在解决细菌感染问题上更具策略上的优势，也成为了研究的一个重点方向。
       生物被膜的形成到成熟的过程主要分为三个阶段，即细菌在表面初始黏附，黏附的细菌聚集并分泌EPS，最后发展成为成熟的生物被膜。针对细菌在材料表面形成生物被膜的第一阶段，主要有两种方法来阻碍生物被膜的形成：一是赋予材料表面抗细菌黏附性能，在初期阻止细菌在材料表面的黏附[6]。近年来，陕西师范大学杨鹏教授利用相转变蛋白质构建了一系列功能涂层，将其应用到了抗菌材料、组织工程和分子分离等多种领域[7-9]。本创新团队也利用此类薄膜构筑了用于抗菌和伤口敷料的材料[10]。杨鹏教授发现在还原剂-三（2-羧乙基）磷（Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride, TCEP）的作用下，牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）的二硫键被打断，蛋白质由α-螺旋结构变为β-折叠结构，并在溶液中发生快速的相转变。在此相转变过程中，部分未折叠的单体聚集形成类淀粉样蛋白质纳米粒子，进一步在气液界面或固液界面中聚集成二维相转变BSA（phase-transited BSA, PTB）薄膜[11]。其能够稳定黏附在几乎具有任何形状的多种基材上，沉积过程简单友好快速。此外，PTB 表面带正电荷和带负电荷的氨基酸残基分布接近平衡，从而赋予了其优异的抗污性能，因此其可作为抗细菌黏附涂层用于构筑抗菌表面，且其表面含有许多二次反应基团，可用于下一步修饰。但是，目前还没有发现一种物质能够100%的抵抗细菌黏附，一旦少数细菌附着于材料表面，抗细菌粘附体系很难再阻止细菌的增殖。
       二是赋予材料表面杀菌活性，用于杀灭黏附在表面的细菌[12]。迄今为止，研究人员已经通过生物、化学和物理等多种方法在材料表面引入了具有杀菌活性的抗菌物质（例如：抗生素、抗菌肽、季铵盐、壳聚糖、银纳米粒子等)[13]，但是，细菌容易对抗生素等物质产生耐药性。此外，此类抗菌物质很难进入生物被膜内部清除材料表面的生物被膜。近十年来，国内外研究者们提出了一大类新型的具有杀菌活性的表面—光热杀菌表面。此类光介导的杀菌表面利用光热转换在光照下将光能转变为热能对材料表面的细菌或生物被膜进行杀灭[14]。不同于传统的化学杀菌表面，光热杀菌表面使得细菌很难产生耐药性，因此被认为是杀灭耐药性细菌和生物被膜的有效途径。迄今为止，常用于构筑光热杀菌表面的材料主要有小分子有机材料（吲哚菁绿和IR780等）、有机纳米材料（聚多巴胺和聚苯胺等）和无机纳米材料（金纳米材料、碳纳米材料和过渡金属硫化物纳米材料等）等三大类。值得一提的是，我国科学家天津大学吴水林教授、浙江大学计剑教授、北京化工大学徐福建教授、苏州大学陈红教授和于谦教授以及澳大利亚蒙纳士大学的Boon Mian Teo 等人在构筑光热杀菌表面领域做出了一系列贡献并取得了一系列创新性成果[15-19]。
       考虑到上述两种抗菌表面各自不同的抗菌机理，同时具有抗细菌黏附和光热杀菌活性的抗菌表面比单一功能的抗菌表面在实际应用中更具吸引力，两者的结合能够在多模式抗菌的作用下更有效地抑制生物被膜的形成。目前，已有部分研究将表面抗细菌黏附和表面杀菌集合在一起，实现了对细菌的有效杀灭[20]。
       我们系统梳理了目前光热抗菌表面的研究现状，发现其抗菌机理比较单一、光热杀菌材料只具有光热性质及基材普适性弱。这对于抗菌表面的应用性而言都是亟需解决的问题，因此，如何从这三个方面着手来构筑新型抗菌表面，对于医疗器械抗菌涂层的应用性而言极具意义。 
 首先，在当前的抗菌表面中，研究者只考虑到在生物被膜形成第一阶段进行阻断，然而，微生物学在生物被膜形成过程中的作用是不容忽视的。因此，从微生物学角度出发来控制生物被膜的形成和成熟是一种有前景的策略。研究表明，多数生物被膜的形成与一种被称作细菌群体感应（quorum sensing，QS）的生理行为密切相关[21]。QS是一种细菌间的信息交流方式，是指细菌通过自身产生的一类统称为自体诱导物的信号分子感知周围同类细菌数量或密度的变化，进而调控特定基因表达和细菌集体行为（如激活细菌聚集、合成胞外多糖、形成生物被膜等)[22]。微生物学研究表明干扰细菌的QS过程可以有效减缓甚至抑制生物被膜的形成。群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitor，QSI）是一类QS信号干扰物，能够钝化QS介导的细菌行为[23]。因此，在生物被膜形成第一阶段和第二三阶段共同发力阻止将会具有更加优异的抗生物被膜性能。
 其次，构筑光热涂层所采用的光热材料一般都仅具有光热性能，如果能开发一种既具有光热性能又具有其它生物功能的光热材料将极大地丰富抗菌涂层的功能性。近来本团队发现金属离子和黄酮类化合物（例如：槲皮素和木犀草素等）自组装所形成的纳米材料（MFNCs）具有优异的光热性能和类过氧化物酶性能，且这些黄酮类化合物能够抑制细菌间的群体感应。因此，采用MFNCs构筑抗菌涂层对提高医疗器械的抗生物被膜性能将会有极大帮助。
 再者，当前构筑光热杀菌表面的方法大都适用于特定基材。而不同的植介入医疗器械的材质大都不尽相同。例如，内窥镜的材质主要是医用金属和有机材料，医用导管的材料主要是硅橡胶、聚氯乙烯、聚氨酯和聚二甲基硅氧烷等。考虑到抗菌涂层的实际应用性，开发一种不影响材料本体性质且具有基材普适性的抗菌表面极具意义。
      基于上述对抗菌表面的发展总结和分析，并针对当前抗菌表面存在的挑战，从细菌生物被膜形成的机制出发，以解决医疗器械表面细菌/生物被膜感染问题为主要目标，本研究课题的整体设计思路如下：在BSA上预先修饰上含氟聚合物（PF），而后在BSA发生相转变形成PTB的过程中添加MFNCs，一步法构建具有“双重抗细菌黏附-多重杀菌性能”的抗菌涂层PTB-PF@MFNCs（图1），并抑制生物被膜的形成。本研究课题拟以革兰氏阴性菌—铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和革兰氏阳性菌—金黄色葡萄球菌（S. aureus）为模型细菌，借助PTB 的抗污性能、MFNCs的光热性能和类过氧化物酶性能以及黄酮类化合物抑制群体感应性能，研究涂层对两种细菌的抗菌和抗生物被膜性能。同时，本课题拟在深层次上通过计算化学等手段研究抗菌涂层的抗菌机理。本项目的实施不仅能够为抗菌表面的构建提供新思路和方法，提供重要的基础理论价值，推动抗菌材料的发展；还将为生物材料表面功能化及抗菌性医疗器械创新提供理论依据和技术支撑。
参考文献：
[1] Abat, C.; Fournier, P. E.; Jimeno, M. T.; Rolain, J. M.; Raoult, D. Extremely and Pandrug-Resistant Bacteria Extra-Deaths: Myth or Reality? Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2018, 37, 1687-1697.
[2] Collaborators, G. B. D. A. R. Global Mortality Associated with 33 Bacterial Pathogens in 2019: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet 2022, 400, 2221-2248.
[3] Wei, T.; Qu, Y.; Zou, Y.; Zhang, Y.; Yu, Q. Exploration of Smart Antibacterial Coatings for Practical Applications. Curr. Opin. Chem. Eng. 2021, 34, 100727.
[4] Sauer, K.; Stoodley, P.; Goeres, D. M.; Hall-Stoodley, L.; Burmølle, M.; Stewart, P. S.; Bjarnsholt, T. The Biofilm Life Cycle: Expanding the Conceptual Model of Biofilm Formation. Nat. Rev. Microbiol. 2022, 20, 608-620.
[5] Stewart, P. S.; Costerton, J. W. Antibiotic Resistance of Bacteria in Biofilms. Lancet 2001, 358, 135-138.
[6] Graham, M. V.; Mosier, A. P.; Kiehl, T. R.; Kaloyeros, A. E.; Cady, N. C. Development of Antifouling Surfaces to Reduce Bacterial Attachment. Soft Matter 2013, 9, 6235-6244.
[7] Gu, J.; Su, Y.; Liu, P.; Li, P.; Yang, P. An Environmentally Benign Antimicrobial Coating Based on a Protein Supramolecular Assembly. ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 198-210.
[8] Wang, D.; Ha, Y.; Gu, J.; Li, Q.; Zhang, L.; Yang, P. 2d Protein Supramolecular Nanofilm with Exceptionally Large Area and Emergent Functions. Adv. Mater. 2016, 28, 7414-7423.
[9] Wang, D.; Wu, Z.; Gao, A.; Zhang, W.; Kang, C.; Tao, Q.; Yang, P. Soft Landing of Cell-Sized Vesicles on Solid Surfaces for Robust Vehicle Capture/Release. Soft Matter 2015, 11, 3094-3099.
[10] Qu, Y.; Zhu, X.; Kong, R.; Lu, K.; Fan, T.; Yu, Q.; Wang, G. Dual-Functional Antibacterial Hybrid Film with Antifouling and Nir-Activated Bactericidal Properties. Compos. Part B Eng. 2022, 244, 110143.
[11] Hu, X.; Tian, J.; Li, C.; Su, H.; Qin, R.; Wang, Y.; Cao, X.; Yang, P. Amyloid-Like Protein Aggregates: A New Class of Bioinspired Materials Merging an Interfacial Anchor with Antifouling. Adv. Mater. 2020, 32, 2000128.
[12] He, X.; Wu, H.; Wang, Y.; Xiang, Y.; Zhang, K.; Rao, X.; Kang, E. T.; Xu, L. Bimodal Antimicrobial Surfaces of Phytic Acid-Prussian Blue Nanoparticles-Cationic Polymer Networks. Adv. Sci. 2023, 10, 2300354.
[13] Kaur, R.; Liu, S. Antibacterial Surface Design-Contact Kill. Prog. Surf. Sci. 2016, 91, 136-153.
[14] Zou, Y.; Zhang, Y.; Yu, Q.; Chen, H. Photothermal Bactericidal Surfaces: Killing Bacteria Using Light Instead of Biocides. Biomater. Sci. 2021, 9, 10-22.
[15] Ren, Y.; Liu, H.; Liu, X.; Zheng, Y.; Li, Z.; Li, C.; Yeung, K. W. K.; Zhu, S.; Liang, Y.; Cui, Z.; Wu, S. Photoresponsive Materials for Antibacterial Applications. Cell Rep. Phys. Sci. 2020, 1, 100245.
[16] Lei, W.; Ren, K.; Chen, T.; Chen, X.; Li, B.; Chang, H.; Ji, J. Polydopamine Nanocoating for Effective Photothermal Killing of Bacteria and Fungus Upon near-Infrared Irradiation. Adv. Mater. Interfaces 2016, 3, 1600767.
[17] Zhao, Y. Q.; Sun, Y.; Zhang, Y.; Ding, X.; Zhao, N.; Yu, B.; Zhao, H.; Duan, S.; Xu, F. J. Well-Defined Gold Nanorod/Polymer Hybrid Coating with Inherent Antifouling and Photothermal Bactericidal Properties for Treating an Infected Hernia. ACS Nano 2020, 14, 2265-2275.
[18] Wang, Y.; Zou, Y.; Wu, Y.; Wei, T.; Lu, K.; Li, L.; Lin, Y.; Wu, Y.; Huang, C.; Zhang, Y.; Chen, H.; Yu, Q. Universal Antifouling and Photothermal Antibacterial Surfaces Based on Multifunctional Metal-Phenolic Networks for Prevention of Biofilm Formation. ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 48403-48413.
[19] Lu, Z.; Quek, A. J.; Meaney, S. P.; Tabor, R. F.; Follink, B.; Teo, B. M. Polynorepinephrine as an Efficient Antifouling-Coating Material and Its Application as a Bacterial Killing Photothermal Agent. ACS Appl. Bio Mater. 2020, 3, 5880-5886.
[20] Zou, Y.; Zhang, Y.; Yu, Q.; Chen, H. Dual-Function Antibacterial Surfaces to Resist and Kill Bacteria: Painting a Picture with Two Brushes Simultaneously. J. Mater. Sci. Technol. 2021, 70, 24-38.
[21] Mukherjee, S.; Bassler, B. L. Bacterial Quorum Sensing in Complex and Dynamically Changing Environments. Nat. Rev. Microbiol. 2019, 17, 371-382.
[22] Dickschat, J. S. Quorum Sensing and Bacterial Biofilms. Nat. Prod. Rep. 2010, 27, 343-369.
[23] Qu, Y.; Zou, Y.; Wang, G.; Zhang, Y.; Yu, Q. Disruption of Communication: Recent Advances in Antibiofilm Materials with Anti-Quorum Sensing Properties. ACS Appl. Mater. Interfaces 2024, 16, 13353-13383.
项目的创新点具体如下：
① 研究手段新颖：利用单一抗菌活性材料的多功能性杀灭细菌
赋予抗菌涂层多模式抗菌是实现医疗器械表面抗菌的重要举措，因此，抗菌涂层中通常包含多种类的抗菌活性材料，这增加了材料的制造步骤及潜在的生物毒性。本项目中拟制备PTB-PF@MFNCs抗菌涂层中所采用的杀菌材料MFNCs具有光热、类过氧化物酶和抑制群体感应多种性能，此类通过单一的抗菌活性材料来多模式协同杀灭细菌的模式是本课题的一大创新之处。
② 机制新颖：针对生物被膜形成的不同阶段通过多模式调控来抑制其形成
生物被膜的形成一般经历三个阶段。本课题采用针对第一阶段的抗细菌黏附和杀菌方法携手针对第二三阶段的抑制群体感应措施，共同阻抗生物被膜的形成，这种化学现象结合微生物学现象来抗菌的机制和理念是本课题的一大特色。
1. 拟采取的研究方案
       本项目的研究方案分为以下四大部分。首先进行PTB-PF@MFNCs的制备和表征，然后从体外/体内水平分别研究PTB-PF@MFNCs抗粘附性能、抗菌/抗生物被膜能力，最后研究PTB-PF@MFNCs涂层的抗菌机制。具体技术路线、研究方法和实验手段如下：
第一部分：PTB-PF@MFNCs抗菌涂层的制备和表征
（1）含氟聚合物修饰BSA（BSA-PF）的合成与表征：首先合成含氟聚合物（图2）：通过原子转移自由基聚合将甲基丙烯酸六氟丁酯（HFBMA）与甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）共聚，形成含氟二嵌段共聚物PF。通过核磁共振氢谱（1H-NMR）、傅里叶红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）、凝胶渗透色谱（GPC）等表征手段证明PF的聚合成功以及确定其分子量及分子量分布。紧接着通过醇解反应采用琥珀酰亚胺（DSC）活化含氟聚合物中聚HEMA链段上的羟基，得到DCS活化的PF（DSC-PF）。通过氨解反应将DSC-PF修饰到BSA上，得到含氟聚合物修饰的BSA（Lyso-PF）（图3）。通过飞行时间质谱（MALDI-TOF）和XPS表征手段证明BSA上含氟聚合物的成功修饰。
                      summernote-img
                                                   图2. 代表性的PHFBMA-b-PHEMA嵌段共聚物（PF）的合成路线图
                     summernote-img
                                                     图3. PF接枝BSA（BSA-PF）的合成路线图
（2）MFNCs的合成与表征：按照图4方法合成MFNCs，将聚乙烯吡咯烷酮PVP（100 mg, 6 mL）逐滴加入到黄酮类化合物（此处采用的是槲皮素Qe）溶液（8 mg, 1.5 mL）中，超声至溶液澄清透明，然后逐滴加入无水FeCl3，持续搅拌3 h，透析冷冻干燥后备用。上述所用溶剂为无水甲醇。采用TEM、纳米粒度和Zeta电位仪、傅里叶红外光谱、紫外-可见光谱分别表征 MFNCs的形貌、粒径、电位和特征峰，并测试其光热效应、类过氧化物酶功能以及杀菌性能。（此部分工作已完成）
                    summernote-img
                                             图4. MFNCs的合成示意图（此部分工作已完成）
（3）PTB-PF@MFNCs的制备与表征：按照图1a的方法一步法制备PTB-PF@MFNCs涂层，具体的，选用半导体硅基材和更具应用意义的聚氨酯（PU）基材为模型基材进行如下修饰：在BSA-PF的相转变过程中加入不同浓度的MFNCs，制备包裹有MFNCs的薄膜。利用水接触角仪、椭圆偏振仪、SEM、AFM和XPS考察表面的浸润性、厚度、表面拓扑结构和化学组成。利用红外热像仪考察表面的光热性能。
（4） 第一部分技术路线图
              summernote-img
第二部分：PTB-PF@MFNCs抗菌涂层的体外抗菌/抗生物被膜性能
（1）抗细菌黏附性能研究：本研究选用P. aeruginosa和S. aureus作为模型细菌通过激光共聚焦和SEM研究其在未改性的表面、PTB-PF和PTB-PF@MFNCs表面的黏附。
（2）杀菌性能及清除生物被膜研究
以S. aureus为模型细菌，将不同的样品在107 CFU/mL的细菌溶液中37℃恒温培养3 h后，采用近红外光（NIR）照射合适的时间，分别进行如下细菌活性测试：① 细菌死活染色：将NIR照射前后的样品用死活染料染色10 min，在倒置荧光显微镜下观察并采集图片，计算不同样品的杀菌效率。② 平板涂布法：将 NIR 照射前后的样品上的细菌超声下来，涂覆到固体培养基上，然后37℃恒温培养12-18 h，观察并计算固体培养基上细菌的数目。
将PTB-PF@MFNCs及对照组分别在107 CFU/mL的细菌溶液中37℃恒温培养1天、3天、5天、7天、14天，培养溶液采用细菌培养基，并在相应的节点更换新鲜细菌培养基，而后采用荧光染色法、平板涂布法、结晶紫染色和SEM评估目标PTB-PF@MFNCs表面是否能抑制生物被膜的形成。
（3）第二部分技术路线图
            summernote-img
第三部分：PTB-PF@MFNCs抗菌涂层的抗菌机理研究
（1）实验手段研究抗菌机理
①表面黏附细菌的形貌观察：利用SEM观察各表面黏附的P. aeruginosa和MRSA的形态；② P. aeruginosa细菌外膜渗透性检测：细菌外膜仅存在于革兰氏阴性细菌中，本课题采用ANS来检测P. aeruginosa的外膜渗透性。本研究将样品处理过的P. aeruginosa与ANS共培养后检测其荧光强度；③细菌内膜渗透性检测：本研究拟采用ONPG水解测定来研究细菌内膜渗透性。将不同样品处理过的P. aeruginosa和S. aureus与ONPG共培养后检测其在420 nm处的吸光度，吸光度越大，表明其内膜渗透性越大；④细菌蛋白质泄露检测：本研究检测不同样品处理过的P. aeruginosa和S. aureus在562 nm的吸光度，吸光度越大，表明其蛋白质泄露越多。
（2）计算机模拟研究抗菌机理
①细菌膜模型的构建：借助膜构建器CHARMM-GUI构建革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的细菌膜模型。其中革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌细菌膜中棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)的比例分别为3:1和1:3。②PTB-PF@MFNCs与细菌膜的相互作用：借助分子动力学模拟软件包GROMACS2018计算PTB-PF@MFNCs与细菌膜的相互作用。通过计算PTB-PF@MFNCs对细菌膜磷脂双分子层厚度、序参数、膜组分横向分布、结合能等的影响，分析PTB-PF@MFNCs造成细菌膜扰动的重要机制，进而阐明PTB-PF@MFNCs的抗菌作用机制。
（3）第三部分技术路线图
             summernote-img
第四部分：PTB-PF@MFNCs抗菌涂层的体内抗菌性能
（1）Ti基材模型以及伤口敷料模型研究PTB-PF@MFNCs抗菌涂层的体内抗菌性能
本项目所有动物实验均经济宁医学院实验动物伦理委员会批准，并符合中国实验动物事务管理条例的要求。本研究主要采取以下两种动物模型：一种是将经过PTB-PF@MFNCs改性的Ti基材感染S. aureus后经下皮植入到SD大鼠的背部，将小鼠随机分组进行不同的处理后检测基材和基材周围组织的细菌量和组织相容性；另一种是将PTB-PF@MFNCs修饰到细菌纤维素薄膜上，SD大鼠被麻醉并剃掉背毛。使用穿孔活检在每只小鼠上创建一个直径为8毫米的全层皮肤伤口。将10 µl S. aureus溶液（108 CFU/ml）注入伤口并用PTB-PF@MFNCs改性前后的细菌纤维素薄膜覆盖，并进行不同处理，而后对以上的小鼠进行如下的处理：
①观察伤口闭合：在预定的时间点处死小鼠并收集伤口组织。同时，使用ImageJ软件对0/3/7/11/14/18天的小鼠的伤口面积进行拍照和测量。
②体内抗菌性能研究：在第3天，收集一半组织匀浆并用PBS稀释，并在 Luria-Bertani琼脂板上接种18小时。通过计算每毫升菌落形成单位（CFU/ml）来观察和测量活菌数量。
③伤口处血管再生、胶原蛋白沉积性能研究：在第18天切除并收集再生皮肤样品，创面组织用4%多聚甲醛固定，包埋在石蜡中，并切成5 μm厚的切片，并对所有切片进行拍照，分析组织中炎症细胞、肉芽组织和胶原蛋白的沉积。此外，对收集的组织进行CD31的免疫荧光染色，分析血管的生成。在第40天收获主要器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺，并用HE染色，考察其长期细胞毒性。
（2）第四部分技术路线图
          summernote-img
2. 拟解决的问题
本课题拟解决的关键科学问题主要分为以下三方面：
（1）如何将生物被膜形成过程中的微生物学现象和化学现象相结合来共同抵抗医疗器械表面细菌生物被膜的形成
本项目拟将黄酮类化合物“老药新用”，使其与金属离子自组装形成具有多重功能的MFNCs，进而利用其光热、类过氧化物酶以及微生物学现象—抑制群体感应实现协同杀菌性能，以期解决目前抗菌材料清除生物被膜能力差这一关键科学问题。
（2）如何实现抗菌涂层的基材普适性和制备简单性，从而促进抗菌涂层的应用转化
本项目拟在氟化的BSA相转变过程中嵌入多重杀菌功能的MFNCs，利用PTB的粘附性一步法实现抗菌涂层在多种医疗器械表面的修饰，以期解决抗菌涂层应用转化所需的基材普适性和制备简单性这另一关键科学问题。
（3）阐明PTB-PF@MFNCs涂层抗菌的机制
实现优异的抗菌/抗生物被膜性能一般需要多种材料协同工作，通过多种机理达到抗菌目的。但是材料之间如何进行协作，如何杀灭细菌对于开发新的抗菌涂层至关重要。因此，阐明PTB-PF@MFNCs涂层抗菌的机制，是本项目拟解决的第三个关键科学问题。这能够为此类抗菌涂层提供重要的实验依据和理论基础。
3. 预期成果
（1）拟发展一种制备抵抗耐药性细菌、基材普适性的抗菌表面的新方法；
（2）拟结合含氟聚合物、光热材料和刺激响应性聚合物改性材料表面，得到具有优异抗污性能、光热杀菌性能和清除死细菌性能的表面；
（3）拟发表高质量期刊论文1-2篇。

时间
研究计划
2025.06-2025.12
制备优化并表征氟化聚合物改性的BSA和金属/黄酮类化合物纳米复合物；完成PTB-PF@MFNCs的制备、优化和表面性质表征。
2026.01-2026.06
分析PTB-PF@MFNCs抗菌涂层的抗细菌黏附性能、杀菌性能和细胞相容性和抗生物被膜性能；研究PTB-PF@MFNCs的抗菌机理。
2026.07-2026.12
分析PTB-PF@MFNCs改性的Ti片和细菌纤维素薄膜在体内的抗菌应用情况，分析细菌存活、炎症细胞、胶原蛋白及肉芽组织等生长情况。
2027.01-2027.06
全面总结取得的研究成果，撰写结题报告。


1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
      项目指导教师一直致力于抗菌/抗生物被膜生物材料表面改性及其与细菌/细胞之间的 相互作用等研究，在光热杀菌、基于光热材料的基因转染等方面积累了大量的研究经验。目前已参与1项国自然面上项目和主持2项山东省自然科学基金抗菌/抗生物被膜研究领域相关课题。至今，在Advanced Functional Materials、Bioactive Materials、Composites Part B: Engineering、ACS Applied Materials & Interfaces等国内外知名期刊共发表论文28篇，其中作为第一/共同第一作者/通讯作者发表11篇（包Advanced Functional Materials 1篇，Bioactive Materials 1篇，Composites Part B: Engineering 1篇，Aquaculture Reports 1篇，ACS Applied Materials & Interfaces 3篇，Current Opinion in Chemical Engineering 1篇，Journal of Materials Chemistry B 3篇）。
      项目指导教师主要研究群体感应抑制剂/光热试剂协同抗生物被膜研究以及纳米酶在杀菌和消灭肿瘤方面的研究。在博士就读及工作期间主要从事：（1）光热杀菌表面的构建及性能研究。项目指导教师在光热杀菌、细菌培养及抗菌性能表征上积累了丰富的经验。在近期发表的工作中，申请人通过向材料表面引入光热材料（金纳米粒子、聚多巴胺），有效杀灭了表面黏附的细菌（包括MRSA）并能够抑制生物被膜的形成（Composites Part B: Engineering 2022, 244, 110143; Journal of Materials Chemistry B 2018, 6, 3946-3955; ACS Applied Materials & Interfaces 2020, 12, 21283-21291）。
2.基于光热材料的光热效应向细胞内传递外源大分子的研究。
      在细胞培养及其表征上有着丰富的经验。项目指导教师利用光热材料（硅纳米线阵列、聚多巴胺等）的光热效应来增加细胞膜的通透性，促进了外源性分子进入细胞内部（Advanced Functional Materials 2020, 30, 1906362; ACS Applied Materials & Interfaces 2020, 12, 7905- 7914; ACS Applied Materials & Interfaces 2019, 11, 12357-12366）。（3）伤口敷料的研究。项目指导教师通过在医用纱布表面修饰相转变溶菌酶膜，能够无损地实现纱布从伤口部位的剥离（Journal of Materials Chemistry B 2018, 6, 4645-4655）。因此，项目指导教师对光热杀菌、材料学表征、细菌细胞培养、生物学功能测试和动物模型建立等方面均积累了丰富的研究经验。此外，最近项目指导教师就具有抑制群体感应性能的抗生物被膜材料进行了综述，相关总结已发表于论文ACS Applied Materials & Interfaces, 2024,16, 13353-13383。且本项目负责人及参与人已对此项目进行了预研实验，成功合成了QF NCs并对其光热、多重纳米酶及抗菌和促伤口愈合性能进行了测试。
【与本项目相关的预实验结果】
      申请人就本项目开展了一些预实验工作。我们已成功合成了QF NCs并对其进行了形貌、粒径、电位和光热效应等的表征。TEM结果显示，QF NCs呈现无定形状态且大致呈均匀分布的小于10纳米的超小颗粒形式，且经过测试此超小纳米颗粒含有丰富的C、O、Fe元素（图5a），说明两者形成了此超小纳米颗粒（图5b）。在合成过程中，溶液的颜色由浅黄色变为深棕色，紫外光谱和红外光谱检测到的吸收峰进一步证实了 QF NCs的形成（图 5c）。
                       summernote-img

图5. LF NCs的（a）典型TEM图片以及元素分析数据；（b）LF NCs的粒径分布图；（c）不同样品的紫外-可见吸收光谱和（d）红外吸收光谱。
      随后，在1.4 W/cm2的808 nm的NIR下照射10 ，QF NCs溶液（0.1 mg/mL）温度上升到45℃，具有明显的光热效应，并且在循环的激光照射/关闭下，其光热性能依旧保持稳定（图6a-6c）。我们还发现了QF NCs具有一定的类过氧化物酶（POD）性能，随着QF NCs的浓度增加，其POD效应逐渐增加，并且其酶活性受温度和pH的影响（图6d-6f）。

                       summernote-img
图6. QF NCs的光热性能和类过氧化物酶活性表征。不同样品在NIR光（1.4 W/cm2）照射下温度的（a）变化图片和（b）相关曲线图；（c）QF NCs的循环光热性能；（d）不同浓度的QF NCs的POD活性，（e）不同pH和（f）不同温度下QF NCs的POD活性。
      而后，申请人研究了LF NCs的杀菌性能和抗生物被膜性能。在LF NCs优异的光热性能和POD活性下，LF NCs对于S. aureus具有明显的杀菌能力。且通过平板涂布法、细菌死活染色、结晶紫染色法和SEM观察到LF NCs能够在一定程度上抑制生物被膜的形成（图7）。由于LF NCs具有优异的光热性能和类过氧化物酶活性，在过高热和活性羟基自由基的共同作用下，LF NCs能够破坏细菌细胞壁并使蛋白质发生变性，造成内容物流出（图8a）；同时，Lut作为一种QSI，降低了细菌体内QS相关基因的表达（图8b）。此外，经过死活染色和CCK-8以及溶血实验，申请人证明LF NCs的细胞毒性可忽略不计（图9），这对于其作为伤口敷料的功能性分子是十分有益的。最后，申请人将此LF NCs应用于细菌感染的伤口，发现其能够促进伤口的愈合（图10）。
                          summernote-img
图7. LF NCs抗S. aureus生物被膜形成能力。（a）细菌死活染色典型图片，（b）SEM典型图片，（c）平板涂布法典型图片及相应的定量数据（d），结晶紫染色法典型图片及相应的吸光度（e）。（*代表0.01 < p < 0.05，**代表0.001 < p < 0.01,***代表p < 0.001；###代表相比较于NIR照射的Lut组p < 0.001）
                        summernote-img
图8. （a）样品组处理S. aureus后的典型TEM图片；（b）RT-qPCR测试S. aureus经过样品处理前后相关QS基因的表达。
                     summernote-img
图9. LF NCs的细胞毒性和溶血性能研究。（a-b）不同浓度的LF NCs和NIH-3T3细胞及Raw 264.7细胞共培养后典型的死活染色图片；（c-d）不同浓度的LF NCs和NIH-3T3细胞及Raw 264.7细胞共培养后CCK-8结果；（e）不同浓度的LF NCs的溶血性能。
                      summernote-img
                                     图10. LF NCs处理前后细菌感染的大鼠伤口愈合典型图片
总之，项目指导教师在与本课题相关的研究领域已有着一定的工作积累。同时，我们已做了大量的文献调研。这都为该项目的顺利进行提供了良好的研究基础。
       实验设备齐全，拥有包括AFM、SEM、水接触角仪、椭圆偏振仪、Zeta电位仪、红外光谱仪、倒置荧光显微镜、红外热像仪、808 nm激光发射器、酶标仪和qPCR仪等精良仪器。这些仪器设备为本项目的实施提供了必要的硬件基础条件。实验中预期用到的试剂均可购得或自行合成，而且细菌、动物细胞等来源丰富。因此，我们预期在本项目进行过程中不存在任何试剂和动物细胞来源等方面的制约，在分析测试方面也有设备和技术的良好保障。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 实验试剂耗材 12000.00 8000.00
1. 业务费 7000.00 无 3000.00 4000.00
（1）计算、分析、测试费 4000.00 TEM,XPS,HE等测试 3000.00 1000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 论文出版费用 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 13000.00 试剂细菌细胞小鼠 9000.00 4000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

版权所有： 南京先极科技有限公司        

访问量：0001170047