1. T2DM中DNA甲基化状态动态调控的研究进展
在多个单基因研究中，与非糖尿病人群相比，T2DM患者的胰岛中，许多与胰岛素分泌相关的关键基因如INS（编码胰岛素）、PDX1、PPARGC1A（编码PGC1α）以及GLP1R（编码GLP-1受体），其DNA甲基化程度升高同时表达水平降低，这与胰岛素分泌损伤密切相关[3-6]。此外，高葡萄糖和糖化血红蛋白（HbA1c）可能直接导致这些基因DNA甲基化水平的升高[1, 4, 6]。
Volkmar等人首次使用DNA甲基化芯片技术对11个正常人和5个T2DM患者胰岛组织中27,578个CpG位点的甲基化状态进行了检测，共鉴定到276个差异甲基化CpG位点，分别位于254个基因的启动子区域[7]。功能富集分析和RNAi实验结果表明这些差异甲基化基因与β细胞的生存和功能失调密切相关，还有一些基因参与到了胁迫响应过程中。Dayeh等人也利用DNA甲基化芯片对15个T2DM患者和34个正常人胰岛组织的479,927个CpG位点同时进行比较分析，共发现1,649个差异CpG位点，注释到843个基因中，其中102个基因呈现差异表达[8]。在T2DM患者中，CDKN1A、PDE7B和SEPT9基因启动子区域DNA甲基化程度的降低导致其表达量升高，细胞实验表明这些基因的过表达会导致β细胞葡萄糖应激胰岛素分泌减少，并抑制β细胞的增殖。此外，该研究还鉴定到多个与T2DM和肥胖相关的基因，比如ADCY5、FTO、HHEX、IRS1、KCNQ1、PPARG和TCF7L2等。
由于基于芯片技术的DNA甲基化分析方法仅覆盖了人类基因组中大约1.5%的CpG位点，为了从全基因范围内探究T2DM相关的表观遗传标记，Volkov等人利用亚硫酸盐全基因组测序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）对T2DM患者和正常人胰岛中大约2.4×107个CpG位点的甲基化状态进行了分析，共鉴定到25,820个差异甲基化区域（Differentially Methylation Regions, DMRs），其中变化最显著的两个DMRs注释到了调控胰岛素表达的关键转录因子PDX1[9]。此外，该研究结果与之前DIAGRAM[10]的研究结果有很好的重合，都鉴定到了包括ADCY5、TCF7L2和KCNQ1在内的43个T2DM基因。NR4A3、PARK2、PID1和SOCS2在内的457个基因在T2DM胰岛中同时呈现差异甲基化和差异表达，细胞实验结果发现这些基因的过表达或沉默都会导致β细胞胰岛素分泌功能受损，说明表观调控机制在胰岛功能紊乱过程中发挥重要功能。另外，Yuan等人[11]使用甲基化DNA免疫沉淀测序（Methylated DNA Immunoprecipitation, MeDIP-seq）技术对患有T2DM的同卵双生双胞胎血液甲基化状态进行了探究，最强的可重复信号注释到了MALT1，该基因参与到胰岛素和血糖通路中，并与血液中牛磺胆酸盐的水平相关。
在DNA甲基化和T2DM因果关系研究方面，Diana等人利用双向双样本孟德尔随机化方法探究了T2DM相关meta-EWAS中鉴定到的58个CpG位点与T2DM的因果关系，结果显示cg25536676位点是T2DM的危险因素，该位点与DHCR24基因相关[12]。Chen等人研究显示，高血糖会使卵母细胞中的去甲基化酶TET3表达降低，从而抑制它在受精时对精子来源DNA的去甲基化修饰，进而导致后代成年后葡萄糖耐受不良[13]。以上结果证实了DNA甲基化是T2DM的重要致病因素。
最近研究表明，在β细胞再生过程中，NGN3和SOX1基因甲基化程度降低，DNA甲基化会导致体内祖细胞基因沉默进而使胰腺产生β细胞的能力降低，而脱甲基作用可以唤醒祖细胞，增强分化为β细胞的能力，说明DNA甲基化是β细胞再生过程的关键调控因素[14]。另一项研究表明，不同亚型的T2DM患者间存在明显的DNA甲基化表观遗传差异，鉴定到的DNA甲基化标记也与T2DM常见并发症（如心脏病、中风和肾病等）的不同风险相关，可用于预测T2DM相关并发症[15]。此外，DNA甲基化与机体的慢性变化（如血糖波动）有关，可以在血糖升高90天前出现大幅波动，暗示DNA甲基化或许可以用于T2DM的早期检测[16]。Liu等人基于血液的EWAS（Epigenome-Wide Association Study）结果发现，与快速血糖和胰岛素代谢相关的差异DNA甲基化可以作为糖尿病早期诊断的标志物[17]。Ouni等人利用肥胖小鼠模型探究了糖尿病发生前胰岛的表观遗传变化，与糖尿病抵抗小鼠相比，糖尿病倾向小鼠共鉴定到497个表达水平和甲基化水平均显著差异的基因，这些基因富集在胰岛素分泌等通路中，其中，AKAP13、TENM2、CTDSPL、PTPRN2和PTPRS基因能够预测血糖和肝脂肪含量[18]。
2. DNA甲基化单体方法的研究进展
DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在生长发育、疾病发生以及细胞组织类型维持过程中发挥重要作用。近年来，WGBS等基于测序的技术可以以单碱基分辨率测量单条read上的DNA甲基化状态。一条DNA链上单个CpG位点或者被甲基化或者未被甲基化，传统的DNA甲基化水平是指甲基化分子所占的比例，即DNA平均甲基化。Schultz等人发现由于传统DNA甲基化定量方法过于简单，使分析结果易受到技术噪声和单个CpG位点甲基化测定敏感度的影响，在一定程度上导致我们观察到启动子区域甲基化水平和基因表达的相关性较低[33]。传统方法的另一个关键缺陷在于没有考虑测序组织的细胞异质性，把不同细胞中的每个CpG位点同等看待，然而，在组织样本中，人类基因组中2%的CpG位点呈现中间甲基化水平，这在一定程度上归因于样本内细胞的异质性[34]。为了弥补平均甲基化方法的缺陷，研究者提出了CHALM[19]、MCR[20]等多种基于单体水平的DNA甲基化衡量指标，来衡量甲基化异质性从而比平均甲基化解释更多的基因表达变化[21]。
除了上述局部DNA甲基化的异质性，多项研究发现在DNA甲基化单体层面，DNA甲基化酶和去甲基化酶的活性存在局部协同性，导致同一个DNA分子上邻近的CpG甲基化位点呈现相似的甲基化状态，即共甲基化[22-24]。这些共甲基化的CpG位点进一步形成DNA甲基化单体区域（Methylation haplotype blocks, MHBs），共甲基化模式可以通过DNA甲基化单体水平的连锁不平衡（Linkage Disequilibrium, LD）分析获得[25]。Guo等人发现MHBs富集在增强子等功能结构域中，有潜在的基因表达调控作用[22]；基于MHBs开发的分子标记在无创早期癌症检测和癌种分型中的效果受到技术噪声干扰影响较小，优于传统DNA平均甲基化的方法[26]。
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