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BHB介导CaMKIIδ的β-羟基丁酰化修饰调控衰老相关分泌表型抑制肝细胞癌发生发展的机制研究

申报人：许宇萌 申报日期：2025-03-24

基本情况

2025创新项目
BHB介导CaMKIIδ的β-羟基丁酰化修饰调控衰老相关分泌表型抑制肝细胞癌发生发展的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
肝细胞癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其治疗手段有限，预后较差。近年来，β-羟基丁酰化（Kbhb）作为一种新型翻译后修饰在多种肿瘤中的作用逐步被揭示，但其在HCC中的作用尚不明确。我们预实验结果显示，HCC患者肝癌组织中Kbhb修饰水平显著下降，且与临床不良预后密切相关。体外实验证实，β-羟基丁酸（BHB）干预可浓度依赖性上调Kbhb修饰水平，并显著抑制肝癌类器官生长，提示Kbhb修饰可能是抑制HCC发生发展的重要因素。基于修饰组学筛选发现，Kbhb可靶向修饰CaMKIIδ第K33位点，GO、KEGG分析显著富集于衰老相关通路。CaN-NFAT2是CaMKIIδ的主要下游效应通路，我们前期研究显示，敲低NFAT2能显著抑制肝细胞衰老及SASP分泌。因此，我们提出“BHB促使CaMKIIδ发生Kbhb修饰并通过CaN-NFAT2通路抑制肝细胞衰老及SASP分泌，进而负性调控HCC的发生发展”的假说。本项目拟采用点突变小鼠、类器官及细胞衰老模型，并结合免疫共沉淀、Kbhb修饰检测等技术手段，深入探索Kbhb修饰抑制HCC发生发展的分子机制，为HCC靶向治疗提供新的理论基础。
目前已跟随指导老师团队开展相关实验一年余，在学习与探索中，逐渐培养了良好的科研思维，并熟练掌握了包括RT-qPCR、Western blot、免疫组化、细胞培养、细胞转染、细胞功能学实验以及免疫共沉淀等在内的多项实验技术。参与课题情况如下：
1. 作为核心团队成员参与“BHB介导CaMKIIδ的β-羟基丁酰化修饰调控衰老相关分泌表型抑制肝细胞癌发生发展的机制研究”的课题研究；
2. 参与“钙调磷酸酶β-羟基丁酰化修饰调控衰老分泌表型抑制MASH向HCC演进的机制研究”的课题研究；
3. 作为创新训练计划“趣解剖”公众平台的设计与构建项目成员并获得校级立项。 
1. 主持山东省自然科学基金项目“钙调磷酸酶β-羟基丁酰化修饰调控衰老分泌表型抑制MASH向HCC演进的机制研究”（ZR2024QH076）1项。
2. 主持并结题山东省医药卫生科技发展计划项目“长链非编码RNA NR_136400调控原发性肝癌肺转移的机制研究”（2019WS366）1项。
3. 主持济宁市重点研发计划“β-羟基丁酸预防MASH相关肝癌发生的作用及机制研究”（2024YXNS108）1项。
4. 主持并结题济宁医学院教师科研扶持基金“细胞衰老在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用及相关机制探讨”（JYFC2018FKJ147）1项。 
1. 学术指导与资源保障
定期指导：课题组采取例会制（每周六下午），围绕课题设计、实验操作及数据分析等环节展开深度指导。
经费管理：将提供部分经费支持，并协助合理规划经费使用。
学术交流：依托科研课题，推荐参加学术会议，为学生搭建学术交流平台。
2. 过程管理与能力培养
分阶段目标：制定研究计划表（开题、中期、结题），明确阶段性任务。
技能培训：针对实验技术、绘图、统计等开展专题培训。
3. 成果转化支持
论文与专利：指导学生撰写论文并推荐投稿，协助申请专利。
竞赛与展示：指导参加创新创业赛事，支持成果转化。 
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
许宇萌 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2023 统筹项目规划，设计并开展实验，撰写报告
刘子豪 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2023 构建类器官模型，实施相关细胞实验
陈立庚 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 负责动物学相关实验操作
欧佳琦 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 执行动物实验并进行数据分析
刘琼兰 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2023 开展分子生物学与细胞实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张晶 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

    本研究聚焦β-羟基丁酰化（lysinep-hydroxybutyrylation, Kbhb）修饰在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）发生发展中的调控作用，系统解析钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（Ca/calmodulin-dependent protein kinases, CaMKII）δ Kbhb修饰通过钙调磷酸酶（calcineurin, CaN）-活化T细胞核因子2（nuclear factor of activated T cells 2, NFAT2）信号通路抑制细胞衰老及衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）的分子机制，为开展 HCC 靶向治疗提供一个新的思路。
    具体研究目的如下：
   1.1 证实β-羟基丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHB）介导Kbhb修饰抑制HCC发生发展的作用，并明确其修饰位点。
   1.2 阐明CaMKIIδK33 Kbhb修饰通过调控CaN-NFAT2介导的衰老相关分泌表型抑制HCC发生发展的机制。
   1.3 明确CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点作为HCC治疗的新靶点，为临床HCC靶向治疗提供新的理论与实践依据。 
2.1 明确BHB介导Kbhb修饰抑制HCC发生发展的功能
  2.1.1 临床样本证实Kbhb修饰参与HCC进展的作用
 （1）HCC临床样本收集
    课题组前期通过济宁医学院附属医院医学科学研究伦理委员会批准，按照严格的纳入和排除标准，回顾性收集了 2017.01-2023.12在我院首次就诊、诊断明确并行HCC切除术治疗的HCC患者肝癌及癌旁组织样本。入选标准：①病理诊断明确；②临床预后资料完整；③未接受过系统性抗肿瘤治疗；④年龄18-75岁。排除标准：①合并胆管细胞癌等混合型肝癌；②合并其他恶性肿瘤病史；③合并严重的心脏、肾脏、肺部等其他器官疾病。
 （2）患者临床资料收集
    收集患者以下HCC临床病理学参数：年龄、性别、AFP（ng/mL）、肝硬化、Child-Pugh分级、肿块大小/数目、肿瘤细胞分化、坏死、血管侵犯、TNM分级、BCLC分级等；并统计患者的总生存时间（OS）和疾病进展时间（TTP）。
 （3）分析Kbhb修饰水平与临床病理特征的相关性
    采用Kbhb泛抗体结合Western blot技术检测肝癌及癌旁组织Kbhb修饰水平，以有序Logistic回归分析Kbhb修饰与肝癌临床病理特征的相关性，以Kaplan-Meier生存曲线及Cox比例风险回归分析Kbhb修饰与患者OS、TTP的关系。
  2.1.2 体外研究BHB介导Kbhb修饰对HCC增长、迁移、侵袭的影响
  （1）基于肝癌类器官模型评价BHB介导Kbhb修饰对HCC生长的抑制作用
    经医学伦理委员会批准，收集HCC患者术后新鲜肝癌组织标本进行类器官培养。实验组采用BHB（1、3、5、8、10、15mM）干预，对照组PBS干预，培养14天，每2天换液，14天后采用Kbhb泛抗体联合Western blot技术检测Kbhb修饰水平，证实BHB与Kbhb水平剂量依赖性关系，同时显微镜下观察类器官的大小、形状、出芽情况，BrdU技术检测类器官增殖情况。
  （2）基于肝癌细胞系评价BHB介导Kbhb修饰对HCC细胞恶性表型的影响
    体外培养HepG2、Huh-7等肝癌细胞系，实验组采用BHB（1、3、5、8、10、15mM，24小时）干预，对照组PBS干预，检测Kbhb修饰水平证实BHB与Kbhb水平剂量依赖性关系，并采用CCK-8、平板克隆、细胞划痕、Transwell等实验评价肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化。
  2.1.3 动物实验明确BHB介导Kbhb修饰抑制HCC发生发展的作用
    经医学伦理委员会批准，购买C57BL/6 J雄性小鼠（50 只，SPF级，3周龄），设置对照组、模型组和实验组：对照组（n=10），每周腹腔注射二甲基亚砜（DMSO），隔日生理盐水灌胃；模型组（n=10），每周腹腔注射25mg/kg二乙基亚硝胺（DEN）及隔日生理盐水灌胃；实验组（n=30），每周腹腔注射25mg/kg DEN及不同浓度60mg/kg、80mg/kg、100mg/kg BHB隔日灌胃。14周后处死。比较不同组别间肝组织Kbhb修饰水平及HCC发生率、肿瘤大小、数目等情况。
2.2 阐明Kbhb修饰抑制HCC发生发展的分子机制
  2.2.1 定量修饰组学预测Kbhb的修饰位点
    课题组前期对6例HCC患者肝癌组织及其中3例对应的癌旁组织进行了定量Kbhb修饰组学测定，筛选出CaMKIIδ的K33位点 Kbhb修饰在肝癌组织中显著下调，且GO和KEGG分析显著富集于细胞衰老相关通路。
  2.2.2 CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点的验证
    特异性修饰抗体验证：采用K33位点特异性修饰抗体联合Western blot技术检测HCC患者肝癌及癌旁组织中CaMKIIδK33 Kbhb的修饰水平。
    点突变验证：构建CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变肝癌类器官及HepG2、Huh-7肝癌细胞系，采用特异性修饰抗体检测CaMKIIδK33 Kbhb的修饰水平。
  2.2.3 明确CaMKIIδK33 Kbhb修饰抑制HCC细胞恶性表型的功能
  （1）构建CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变肝癌类器官模型，采用显微镜观察结合BrdU技术评价CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变对肝癌类器官生长、增殖的影响。
  （2）构建CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变HepG2、Huh-7肝癌细胞系，采用CCK-8、平板克隆、细胞划痕、Transwell等实验评价CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变后肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化。
  2.2.4 体外探明CaMKIIδK33 Kbhb修饰通过CaN-NFAT2调控SASP的机制
  （1）明确CaMKIIδK33 Kbhb修饰对CaN-NFAT2信号轴的调控
   ①证实CaMKIIδK33 Kbhb修饰对CaN活性的影响
    构建CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变肝癌类器官及HepG2、Huh-7细胞系，BHB干预，观察CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变对CaN活性的影响。
   ②验证CaN对NFAT2活性的调控
    基于过氧化氢（H2O2）诱导的细胞衰老模型，采用免疫共沉淀（Co-IP）联合Western blot技术确认CaN与NFAT2的互作；采用RNA干扰技术进一步敲低CaN表达，观察敲低CaN后对NFAT2活性的影响。
   ③证实CaMKIIδK33 Kbhb通过CaN调控NFAT2的活性
    构建CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变肝癌类器官及HepG2、Huh-7细胞系，BHB干预，观察CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变对NFAT2活性的影响，进一步敲低CaN表达进行阻断实验，观察CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变对NFAT2活性的影响是否被逆转。
  （2）明确CaMKIIδK33 Kbhb修饰通过CaN-NFAT2通路对SASP的调控
    构建CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变肝癌类器官及HepG2、Huh-7细胞系，BHB干预，观察CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变对细胞衰老、SASP因子的影响；进一步敲低CaN及NFAT2的表达进行阻断实验，观察CaMKIIδK33 Kbhb修饰突变对细胞衰老及SASP的影响是否被逆转。
  2.2.5 动物实验证实CaMKIIδK33 Kbhb修饰调控CaN-NFAT2-SASP抑制HCC发生发展的机制
    经医学伦理委员会批准，构建CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变型小鼠，实验分CaMKIIδK33 Kbhb修饰突变组（n=10）及野生型组（n=10）。每周腹腔注射25mg/kg DEN，同时隔日给予 BHB灌胃，14周后处死。观察不同组间的HCC发生率和肿瘤大小、数目等情况，并比较各组CaMKIIδK33 Kbhb修饰水平、CaN活性、NFAT2活性、细胞衰老相关指标及SASP因子的表达等情况。
  2.2.6 临床样本验证CaMKIIδK33 Kbhb参与HCC发生发展的作用及机制
    采用免疫组化、Western blot等技术，检测HCC患者肝癌及相应的癌旁组织中CaMKIIδK33 Kbhb修饰水平、CaN活化、NFAT2活化、细胞衰老指标及SASP表达等情况，验证细胞及动物实验的结果；并采用Logistic回归、多元线性回归分析其与临床病理参数的相关性，通过Kaplan-Meier及Cox比例风险回归分析与患者OS、TTP的关系。 
3.1 探索HCC靶向治疗新策略的临床意义
    原发性肝癌是全球第六大常见的癌症类型和第三大致死原因，其中HCC是其主要类型，约占90%，据统计，中国每年的肝癌新发病例约占世界水平的一半，已成为危害我国人民健康的重要疾病之一[1,2]。早期 HCC可通过外科手术进行治疗，但由于HCC起病隐匿，70%~80%的患者在初诊时已处于中晚期，而HCC切除术后患者5年复发转移率仍高达50%~70%。晚期HCC目前主要采取药物、介入和放射等治疗手段，但其疗效有限，预后较差[3]。因此，寻找新的治疗靶点仍是目前和未来研究的重要方向。
3.2 β-羟基丁酰化修饰可能是抑制HCC发生发展的关键因素
    蛋白质翻译后修饰（Post-translational modifications, PTMs）是调控蛋白功能的关键机制，广泛参与代谢调节、信号传导等生物过程。近年来，PTMs在肿瘤发生发展的作用日益受到关注[4,5]。其中，Kbhb修饰是一种新型翻译后修饰，由酮体代谢的关键产物BHB介导发生。研究证实，BHB不仅是重要的能量来源，还在多种生物学过程及肿瘤发生发展中起关键调控作用。长期以来，研究者们普遍认为BHB通过直接激活相关基因的表达发挥其生物学调控功能；直到2016年赵英明教授团队发现，BHB能以浓度依赖的方式驱动蛋白质赖氨酸发生Kbhb修饰，从而实现其代谢调控作用[6]。随着研究的进展，Kbhb修饰还被发现与肿瘤的发生发展密切相关[7]。北京大学赵文会教授团队发现，BHB可促进p53发生Kbhb修饰进而竞争性抑制p53乙酰化修饰水平参与结肠癌的发生发展[8]。Paolo Sassone-Corsi教授团队研究发现，BHB通过调节AHCY Kbhb修饰，抑制甲硫氨酸循环代谢，进而抑制肿瘤的增殖[9]。由此可见，Kbhb修饰在肿瘤发生发展中的重要性已得到初步证实，但其在HCC病理进程的作用目前尚不明确。鉴于此，我们基于临床途径回顾性收集了274例HCC患者的肝癌及癌旁组织样本，并检测了其Kbhb修饰水平。结果显示，HCC肿瘤组织中Kbhb修饰水平显著下调，且其水平越低患者预后越差（研究基础1）。此外，课题组前期构建了人肝癌类器官，BHB干预后可浓度依赖性上调Kbhb修饰水平，并显著抑制肝癌类器官生长（研究基础2）。结合以上信息，我们推测BHB可能通过介导Kbhb修饰调控HCC的发生发展，但其机制需进一步阐明。
3.3 Kbhb修饰可能通过调控SASP抑制HCC发生发展
    为探明Kbhb修饰调控HCC发生发展的机制及作用靶点，课题组前期收集了6例HCC患者肝癌和其中对应的3例癌旁组织进行了定量Kbhb修饰组学测定，GO和KEGG分析显示差异修饰基因主要集中在细胞衰老等相关通路（研究基础3）。细胞衰老是细胞接受多种应激刺激而脱离正常细胞周期并不可逆地进入生长停滞的状态。衰老的细胞可分泌一系列与炎症和组织损伤相关的蛋白质，包括促炎因子、生长因子、趋化因子、基质重塑酶等，即SASP。SASP已被证实直接参与了HCC炎症微环境的形成，并在HCC的发生中起着至关重要的作用[10-12]。课题组前期研究也显示，人肝癌组织中细胞衰老相关指标、SASP及SASP重要调控基因NF-κB表达明显上调（研究基础4）。进一步体外实验证实，BHB处理HepG2、Huh-7等肝癌细胞后，Kbhb修饰水平明显升高，并显著抑制细胞衰老、SASP及NF-κB的表达（研究基础5）。结合以上信息，我们推测BHB介导Kbhb修饰可能通过抑制SASP参与HCC的发生发展（机制假说图1）。
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                                                                 机制假说图1

3.4 CaMKIIδK33的Kbhb修饰可能通过CaN-NFAT2抑制SASP途径负性调控HCC的发生发展
    课题组进一步通过对比HCC患者肝癌和癌旁组织定量Kbhb修饰组学测定结果发现，CaMKII δ的K33位点Kbhb修饰水平在HCC患者肝癌组织中显著下调（研究基础3）。CaMKIIδ是一种钙和钙调蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，激活后通过磷酸化底物调节其活性[13]。多项研究显示，CaMKIIδ可激活CaN，进而催化NFAT2的核转位，并激活其转录功能[14-16]。NFAT2已被证实在多种肿瘤中过表达/激活，并对肿瘤的发生与发展起重要调控作用[17, 18]。课题组前期研究也显示NFAT2在肝癌组织中被激活，且与预后密切相关（研究基础6）；体外BHB干预可显著抑制NFAT2的激活（研究基础5）。这提示，CaMKIIδK33 Kbhb可能通过抑制CaN-NFAT2通路抑制HCC发生发展。
    已有研究证明，NFAT2在皮肤及毛囊干细胞衰老的过程中发挥重要调控作用[19, 20]。另有文献报道，NFAT2能与NF-κB协调作用共同调控炎症因子的表达[21]。NF-κB是一种在炎症、基因毒性和氧化应激反应等多过程中被激活的转录因子，激活的NF-κB在衰老细胞的染色质部分被富集，直接调控SASP的转录[22]。我们课题组前期研究也显示在H2O2诱导肝细胞衰老模型中NFAT2的表达明显升高，敲低NFAT2 可显著抑制H2O2诱导的细胞衰老及SASP的分泌，并明显抑制SASP调控基因NF-κB的表达（研究基础7）。结合以上信息，我们推测BHB可能靶向修饰CaMKIIδK33并通过NFAT2调控SASP的分泌抑制 HCC的发生发展。
3.5 提出假说
    综上，我们提出“BHB介导CaMKIIδK33 Kbhb修饰，通过调控CaN-NFAT2通路，抑制SASP分泌，最终负性调控HCC的发生发展”的科学假说（机制假说图2）。本项目拟在前期工作的基础上，通过类器官、Co-IP、修饰位突变小鼠、组织芯片等技术手段，在细胞学、活体动物模型、临床样本三个层次，深入探索本项目假说的具体内容。该课题不仅拓展了人们对于HCC发生发展机制的认识，并有可能确立 CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点作为新的靶点，为开展HCC靶向治疗研究提供一个新思路。 
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                                                                   机制假说图2

                                                                                  参考文献
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4.1 生物学现象独特：Kbhb修饰是一种新近发现的蛋白质翻译后修饰形式，目前关于Kbhb修饰的研究较少，其在HCC发生发展中的作用目前尚不清楚。
4.2 机制解析创新：由于CaMKIIδ是我们前期通过定量Kbhb修饰组学筛选获得的靶分子，有关其Kbhb修饰与HCC发生发展的调控及具体机制尚无报道，因此本研究具有源头的创新性。
4.3 临床转化明晰：研究成果不仅拓展了人们对于HCC发病机制的认识，并有可能确立CaMKIIδK33Kbhb修饰位点作为新的靶点，为开展HCC靶向药物研究及实现精准医疗提供一个新思路。
4.4 研究技术先进：本项目拟采用的CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变小鼠、定量Kbhb修饰组学测定、肝癌类器官模型的构建、Co-IP及CRISPR-Cas9等技术，均体现了实验技术手段的先进性与前沿性。 
5.1 技术路线
总技术路线：

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技术路线一：明确BHB介导Kbhb修饰抑制HCC发生发展的功能

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技术路线二：阐明Kbhb修饰抑制HCC发生发展的分子机制。


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5.2 拟解决的问题
  5.2.1 BHB介导Kbhb修饰对HCC发生发展的调控作用。
    近年研究表明，BHB可介导蛋白质发生Kbhb修饰，在多种肿瘤中的作用逐步被揭示，然而，其在HCC发生发展中的作用尚不明确。结合我们课题组预实验结果，Kbhb修饰可能具有抑制HCC发生发展的作用。本课题拟进一步通过临床样本、体外细胞学实验及在体动物等研究，结合组织芯片、类器官以及经典的细胞学与分子生物学技术，明确其在HCC发生发展中的调控作用。
  5.2.2 Kbhb修饰是如何参与对 HCC 发生发展的调控？
    Kbhb修饰与HCC的发生发展密切相关，本项目的研究重点和难点在于揭示Kbhb修饰调控HCC发生发展的分子机制，即Kbhb修饰通过哪些靶蛋白及细胞信号通路，实现对HCC生物学功能的调控。为探索Kbhb修饰对HCC发生发展的调控机制，课题组前期通过定量Kbhb修饰组学筛选出CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点，结合GO和KEGG生物信息学分析、相关文献及前期预实验结果，其调控机制可能与CaN-NFAT2介导的细胞衰老途径有关。本课题拟进一步对CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点进行验证，并通过细胞学、修饰位点突变动物模型及临床样本探对其相关机制进行探讨。
5.3 预期成果
  5.3.1 明确BHB介导Kbhb修饰对HCC发生发展的调控功能。
  5.3.2 证实Kbhb靶向修饰CaMKIIδK33位点，并通过调控CaN-NFAT2抑制SASP进而负性调控HCC发生发展的机制。
  5.3.3 明确CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点作为HCC治疗的新靶点，为开发阻断HCC发生发展的药物研究提供实验依据。
  5.3.4 本项目预期发表高水平论文1-2篇；授权发明专利1项；在国内外学术会议报告研究成果1次以上。

2025/06 -2025/12
（1）完成人肝癌类器官模型的建立，证实BHB干预与Kbhb修饰水平的剂量依赖性关系及其对肝癌类器官生长能力的影响。
（2）基于体外肝癌细胞系证实BHB干预与Kbhb修饰的剂量依赖性关系，并完成CCK-8、平板克隆、细胞划痕、Transwell等实验，证实其对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。
2026/01 -2026/06
（1）通过腹腔注射DEN完成HCC动物模型的构建，并给予不同浓度BHB干预，检测BHB与Kbhb修饰水平的剂量依赖性关系，并评价其对肝癌发生率、肿瘤大小、数目等情况的影响。
（2）通过特异性修饰抗体及点突变技术完成CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点的验证，并完成CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变肝癌类器官及细胞系的构建，评估CaMKIIδK33 Kbhb修饰对HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，明确CaMKIIδK33 Kbhb修饰抑制肝癌细胞恶性生物学特征的功能。
2026/07-2026/12
（1）体外基于CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变型肝癌类器官、细胞系及细胞衰老模型，探明 CaMKIIδK33 Kbhb修饰通过CaN-NFAT2调控SASP的机制。
（2）完成CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点突变型小鼠的构建，动物实验证实CaMKIIδK33 Kbhb修饰调控CaN-NFAT2活性抑制SASP，最终负性调控HCC发生发展的机制。
2027/01-2027/06
（1）完成HCC患者肝癌及相应的癌旁组织中CaMKIIδK33 Kbhb修饰水平、CaN活性、NFAT2活性、细胞衰老及SASP因子水平等的检测，临床样本验证CaMKIIδK33 Kbhb修饰参与HCC发生发展作用及机制。
（2）参加国内外研究领域的学术交流会议，实验补遗，分析整理数据。
（3）撰写论文，临床应用推广，并完成课题鉴定。 
研究基础1：Kbhb修饰水平在HCC中显著降低且与临床不良预后密切相关
    经医学伦理委员会批准，课题组前期回顾性收集了在我院首次就诊、诊断明确并行HCC切除术治疗的HCC患者的肝癌及癌旁组织石蜡样本和新鲜组织样本，并采用Kbhb泛抗体联合Western blot及免疫组化技术检测了其Kbhb修饰水平。结果显示，Kbhb修饰水平在HCC患者肝癌组织显著下调，且Kaplan-Meier法分析显示Kbhb修饰水平越低患者预后越差。
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                      图 1. HCC 患者肝癌及癌旁组织中 Kbhb 修饰水平及预后分析
A. Western blot 检测 HCC 患者肝癌及对应癌旁组织中 Kbhb 修饰水平；B. 免疫组化（IHC）检测肝癌及癌旁组织芯片 Kbhb修饰水平；C. 定量比较肝癌及癌旁组织芯片 Kbhb修饰水平；D和E. Kaplan-Meier法分析比较两组患者的进展（D）及生存（E）情况。**p < 0.01, ****p < 0.0001。

研究基础2：体内外实验证实BHB对HCC恶性表型的抑制作用
    课题组前期通过建立荷瘤裸鼠移植瘤模型、人肝癌类器官，并结合多种肝癌细胞系，采用CCK8、平板克隆、Transwell等体外功能实验，进一步探究了BHB对HCC恶性表型的影响。结果显示，外源性BHB干预可显著抑制荷瘤裸鼠肿瘤及人肝癌类器官的生长，并显著抑制HCC细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学特征。
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                                     图2. BHB对HCC恶性生物学特征的影响
A. BHB干预对HCC荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响；B. BHB对人肝癌类器官生长的影响；C. CCK8技术检测BHB对HCC细胞增殖能力的影响；D. 平板克隆技术检测BHB对HCC细胞增殖能力的影响；E. Transwell技术检测BHB对HCC细胞迁移、侵袭能力的影响。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。

研究基础3：Kbhb修饰组学分析发现CaMKIIδK33 Kbhb修饰参与HCC进程
    课题组前期进一步对6例HCC患者肝癌和其对应的3例癌旁新鲜组织进行了定量Kbhb修饰组学测定，筛选出CaMKIIδ的K33位点Kbhb修饰水平在肝癌组织较癌旁组织中显著下调，且KEGG分析显示差异修饰基因主要富集于细胞衰老等相关通路。
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                     图3. Kbhb修饰组学测定及CaMKIIδK33 Kbhb修饰位点验证
A. 热图显示肝癌和癌旁中Kbhb修饰蛋白的差异；B. PCA 图谱显示肝癌和癌旁组织中的 Kbhb 修饰；C. 火山图可视化对比Kbhb差异修饰的蛋白；D. KEGG分析显示Kbhb修饰差异蛋白显著富集在衰老等相关通路。

研究基础4：细胞衰老相关指标及SASP在HCC患者肿瘤组织中的表达
    课题组前期采用Western blot及RT-qPCR技术检测了HCC患者肝癌及癌旁组织中细胞衰老指标及SASP因子的表达。结果显示，衰老相关指标（P53、P21、P16）及SASP因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）在肝癌组织中显著上调，且SASP调控基因NF-κB的表达亦显著升高，提示细胞衰老及SASP可能在HCC的发生发展中起重要调控作用。
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                    图 4. 细胞衰老及 SASP 相关指标在 HCC 患者肿瘤组织中的表达
A. Western blot 检测HCC 患者肿瘤及对应癌旁组织中衰老相关指标及 SASP调控因子NF-κB的表达水平；B. RT-qPCR检测 HCC 患者肿瘤及对应癌旁组织中衰老相关指标及 SASP 的表达水平。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。

研究基础5：BHB介导Kbhb修饰抑制细胞衰老、SASP及NFAT2的表达
    课题组前期成功构建了H2O2诱导的细胞衰老模型，在此基础上进一步BHB干预，探讨BHB介导的Kbhb修饰对NFAT2活性、细胞衰老及SASP的影响。结果显示，BHB干预后Kbhb修饰水平明显升高，并显著抑制NFAT2的表达，同时衰老相关标志物、SASP因子的表达均显著下调。
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         图5. 体外实验证实 BHB 介导 Kbhb 修饰对 NFAT2 及细胞衰老、SASP 的影响
A. Western blot检测BHB干预后Huh-7和HepG2细胞的Kbhb修饰水平；B.Western blot检测BHB干预后Huh-7和HepG2细胞中的NFAT2、细胞衰老指标（P53）及SASP主要调控因子NF-κB的表达水平变化；C. RT-qPCR检测BHB干预后Huh-7和HepG2细胞中NFAT2、衰老标志物及SASP因子的表达变化。*p < 0.05, **p < 0.01, ns: 无统计学差异。

研究基础6：HCC患者肝癌组织中NFAT2激活且表达升高
    课题组进一步检测了HCC患者肝癌及癌旁组织中NFAT2的表达。结果显示，NFAT2在HCC患者肿瘤组织中被明显激活，核表达升高， 且NFAT2 的核表达越高其预后越差。相关分析显示，NFAT2表达水平与Kbhb修饰水平显著负相关。
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                               图 6. 检测HCC 患者肝癌组织中 NFAT2 的表达
A和B. RT-qPCR（A）及Western blot（B） 检测 HCC 患者肝癌及对应癌旁组织中 NFAT2 的表达水平；C. 免疫组化（IHC）检测肝癌组织芯片NFAT2的表达水平；D. 定量比较 NFAT2 在组织芯片中肝癌及癌旁组织中的表达；E和F. Kaplan-Meier法分析比较两组患者的进展（E）及生存（F）情况。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001。

研究基础7：NFAT2对细胞衰老及SASP的调控
    申请人课题组在前期H2O2诱导细胞衰老模型的基础上，进一步证实NFAT2对细胞衰老及SASP的调控。结果显示，H2O2处理后NFAT2明显升高，敲低NFAT2可抑制 H2O2诱导的细胞衰老、SASP及SASP调控基因NF-κB的表达，而过表达NFAT2后，细胞衰老及SASP、NF-κB的表达明显升高。
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                                      图 7. NFAT2 对细胞衰老及 SASP 的调控
A. H2O2诱导 Huh-7 后 NFAT2 的表达；B. Western blot 验证 NFAT2 在 Huh-7、HepG2 细胞系中过表达及敲除效率；C. RT-qPCR 验证 NFAT2 在Huh-7、HepG2 细胞系中过表达及敲除效率；D. 检测Huh-7 中过表达 NFAT2 后衰老相关指标及SASP 的表达水平；E. 检测Huh-7 中敲低 NFAT2 后衰老相关指标及 SASP 的表达水平。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。 
7.2.1 理论依据充分
    国内外最新研究表明，BHB能以浓度依赖的方式驱动蛋白质赖氨酸发生Kbhb修饰，并与多种肿瘤的发生发展密切相关。课题组前期基于临床样本发现，HCC患者肝癌组织中Kbhb修饰水平明显下降，并与临床不良预后密切相关；体外实验证实，BHB干预可浓度依赖性上调Kbhb修饰水平，并显著抑制肝癌类器官生长，提示Kbhb修饰可能是抑制HCC发生发展的重要因素。修饰组学进一步分析发现Kbhb可靶向修饰CaMKIIδ的K33位点，且GO、KEGG分析显著富集于衰老相关信号通路。CaN-NFAT是CaMKIIδ的主要下游通路，我们进一步研究显示，敲低NFAT2可显著抑制肝细胞衰老及SASP分泌，并显著抑制肝癌细胞生长。因此，我们提出“BHB促使CaMKIIδK33发生Kbhb修饰并通过抑制CaN-NFAT2通路抑制肝细胞衰老及SASP分泌，进而负性调控HCC的发生发展”的假说。项目所涉及的科学问题均基于已发表文献和前期的预实验基础，因此本课题在“理论上”是可行的。
7.2.2 技术方法成熟
    本项目研究团队长期致力于HCC发生发展机制的研究，积累了丰富的技术经验和样本资源。课题组前期已熟练掌握肝癌小鼠模型及细胞衰老模型的构建，并建立了肝癌类器官生物样本库，熟练掌握了类器官培养的相关技术，相关文章均已发表。此外，课题组前期收集了大量肝癌石蜡及新鲜组织样本，并进行了转录组、修饰组学、蛋白组学的测定。另外，本项目大创团队成员均为在校大二生，目前跟随指导老师已开展一年余的实验，熟练掌握如RT-qPCR、Western blot、免疫组化、流式细胞术、Co-IP、细胞培养、细胞转染、细胞功能学实验、肝癌动物模型的建立等相关实验技术，保障了项目的顺利开展。
7.2.3 团队实力雄厚
    本项目指导老师一直围绕肝癌的衰老微环境及代谢调控机制开展研究工作，目前已发表论文20余篇，其中以第一作者发表SCI论文7篇（中科院2区及以上SCI论文3篇）、亚太肝病学会(APASL)会议论文1篇，以第一/通讯作者发表核心论文4篇，主持及参与省部级课题4项，厅局级课题3项。项目指导老师为济宁医学院硕士研究生导师，目前指导6名硕士研究生，确保了充足的人力支持。另外，本项目研究团队是由泰山学者专家、专职科研人员、临床医师、在站博士后、研究生及实验助理人员组成的稳健研发团队，专业涵盖临床医学、生物信息学、细胞生物学、分子生物学、药物化学等多个学科，团队结构合理，技术力量雄厚。团队于2020年获批山东省教育厅优秀青年创新团队，2021年获批济宁市肿瘤基础与转化研究重点实验室。团队成员已完成多个国家级和省级科研项目，并发表多篇具有影响力的论文，具备扎实的学术背景和较深的科研积累，为本项目的顺利实施提供了有力的技术支持。
7.2.4 平台支撑完备
    项目依托单位拥有省重点实验室，目前实验室配备美国ABI Q5和BioRad荧光定量qPCR仪、BGI-100和BGI-500基因测序仪、质谱仪、德国美天旎密闭式流式细胞分选仪（MACSQuant Tyto）和美国贝克曼分析型流式细胞仪（DxFLEX）、德国蔡司LSM810激光共聚焦显微镜（带Airyscan模块）、激光片层扫描显微镜、激光显微切割系统、德国蔡司Cell Discover 7活细胞自动化显微成像监控平台、蔡司Axio Imager Z2正置荧光显微镜、蔡司Axio Observer A1倒置荧光显微镜、多色荧光成像仪、小动物超声、小动物活体成像、microCT、体视显微镜、病理图像成像和分析系统等一系列高、精、尖的仪器设备以及电泳仪、凝胶成像仪、超净工作台、冰冻切片机、石蜡切片机、恒温摇床、超声破碎仪、低速冷冻离心机、紫外-可见NSFC 2018分光光度计、蛋白质纯化层析系统、蛋白质纯化柱、离子交换柱等常规设备。济宁医学院实验动物中心拥有SPF级动物房（SYXK（鲁）20180002），为科研所需实验动物的饲养、繁殖提供了保障。此外，本项目工作量大及经费需求高，指导老师团队将给予相应的经费支持，为本项目的实施提供了有力的保障。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 试剂耗材、会议差旅、论文发表等 8000.00 12000.00
1. 业务费 6000.00 - 0.00 6000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 1000.00 参加学术交流、交通、住宿等 0.00 1000.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 5000.00 论文润色、版面费 0.00 5000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 14000.00 细胞实验所需试剂、分子生物学实验所需试剂、相关抗体、动物购置及其他相关实验试剂、耗材。 8000.00 6000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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