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基于天然药物的结直肠癌PD-1抑制剂耐药性逆转机制研究

申报人：卢旭航 申报日期：2025-03-24

基本情况

2025创新项目
基于天然药物的结直肠癌PD-1抑制剂耐药性逆转机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
近年来，免疫检查点抑制剂在癌症治疗中越来越重要。程序性死亡受体1(Programmed Cell Death Protein 1, PD-1)及其配体(Programmed Death - Ligand 1, PD-L1)作为第二代免疫检查点抑制剂的重要临床靶点，已成为新药研发的热点之一。然而，临床数据显示，约60-70%的患者存在原发性或获得性耐药现象，表现为肿瘤微环境中免疫抑制性细胞因子过度分泌、T细胞耗竭标志物上调、抗原呈递机制异常等复杂机制，导致PD-1单抗治疗效果受限。天然药物具有多靶点调控特性，可通过调节肿瘤免疫微环境逆转PD-1免疫治疗耐药。因此，本项目拟首先构建结直肠癌耐药细胞模型，筛选能够逆转PD-1单抗耐药的天然药物；然后，构建动物模型分析天然药物的药效及对主要器官的影响。本研究将为开发新的PD-1单抗联合用药方案提供新选择，对完善结直肠癌精准治疗体系具有重要临床意义。
无
主持山东省自然科学基金1项、校级基金3项，参与国家自然科学基金面上项目 2 项。
该生对本课题相关知识与理论研究比较透彻，参考了许多文献资料。本课题结构合理，内容完整，具有创新性。
同意该课题开展。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
卢旭航 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 天然药物筛选
赵海妍 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 药物筛选相关实验
吴祥鑫 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 动物模型
刘子涵 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 动物模型评估天然药物疗效
王景阳 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 评估天然药物存在的潜在风险
董润霖 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 构建耐药细胞株

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
李海滨 精准医学研究院 否

立项依据

1. 筛选能够逆转结直肠癌细胞PD-1单抗耐药的天然药物。
2. 为开发新的PD-1单抗联合用药方案提供新选择。
1.查阅文献筛选潜在逆转耐药的天然药物：
通过查阅文献，从已有抗肿瘤或免疫调节胃肠道细胞活性的传统植物出发，初步确定几种有可能逆转PD-1单抗耐药性的天然药物，如筛选《本草纲目》中有调节免疫活性的青蒿、黄芪等，或是传统的抗肿瘤药物如猫爪草、莪术等。
文献筛选标准：优先纳入原创性研究 (体外/体内实验)、转化医学研究，排除仅含计算机模拟而无实验验证的文献，时间范围以近3年 (2022–2025) 为主；采纳文献中，体外模型以已证实耐药细胞系为主，动物模型以移植瘤耐药模型为主，临床研究采纳Ⅰ/Ⅱ期临床试验；优先采纳靶向与通路研究明确的研究。
2.浓度递增法构建结直肠癌耐药细胞株：
取处于对数生长期的肿瘤细胞 (汇合度60%~80%)，加入起始浓度为低浓度 (IC50的1/10-1/5) 的药物处理，并置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养；待细胞密度达到50%时，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物培养基继续培养；细胞生长密度再次恢复至80%-90%时，重复上述药物处理6-8次；待细胞在此浓度稳定生长后，提高药物浓度继续培养，药物依次递增浓度加药。药物诱导6-8个月，直到细胞能够在浓度的药物中稳定生长。
3.耐药天然药物筛选：
① 采用 CCK8实验测定不同浓度药物对亲本细胞、耐药细胞株增殖的抑制作用
将对数生长期的细胞悬液 (5×104 /mL) 按 100 μL 接种于 96 孔培养板，每孔分别加入待选药物 (终浓度 0、3、10、30、100μmol/L)，各浓度设 6 复孔，于 37 °C、5% CO2 孵育 24 h 或 48 h，每孔加入 CCK-8 溶液孵育 2 h，采用酶标仪检测波长450 nm 处的OD值，计算细胞抑制率 (inhibition rate, IR) 及半数抑制浓度 (IC50)。
② CCK-8 实验测定药物对细胞耐药的逆转作用
将对数生长期的耐药细胞以 5×104 / mL 按 100 μL 接种于96 孔培养板，加入天然药物 (终浓度 0、3、10、30μmol/L) 和PD-1抑制剂，每个浓度设 6 个复孔。各组细胞于37℃、5% CO2 孵育48 h后，每孔添加 CCK-8 溶液孵育2 h，用酶标仪测定波长 450 nm 处的OD值，计算药物作用下PD-1抑制剂对耐药细胞增殖的 IR、IC50 和细胞耐药逆转指数 (RI) 。
4.构建小鼠模型检验天然药物疗效：
将人源结直肠癌PD-1耐药细胞株接种于小鼠右侧腋下皮下，每只小鼠注射含5×10⁶个活细胞的PBS悬浮液 (细胞活性经台盼蓝染色确认＞95%)。待移植瘤体积生长至150-200mm³，对小鼠腹腔注射PD-1单抗 (10mg/kg，每周2次) 进行耐药验证：若治疗组相比生理盐水对照组肿瘤抑制率＜40%，则确认模型建立成功。随后将符合条件的小鼠随机分为四组：对照组 (生理盐水灌胃+同型抗体注射)、PD-1单抗耐药组 (生理盐水灌胃+PD-1单抗治疗)、天然药物低剂量联合组 (50mg/kg灌胃+PD-1单抗)、天然药物高剂量联合组(100mg/kg灌胃+PD-1单抗)，每组6-8只小鼠。
实验持续21天，期间每3天用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，按公式体积=0.5×长径×短径²计算肿瘤大小并绘制生长曲线；每日记录体重变化，当体重下降＞15%时启动营养支持，＞20%则实施安乐死。同时监测生命体征：体表温度维持于36.5-38.5℃ (红外测温)、呼吸频率控制在80-140次/分 (观察胸廓起伏)、心率保持在450-650bpm (便携式心电图仪)，异常值持续24小时需紧急处理。行为学状态每日评估，出现活动力显著下降 (如持续蜷缩、拒食) 或呼吸困难时立即干预。实验终点取肿瘤组织计算抑瘤率，并检测结直肠癌特异性标志物 (如CEA表达水平) 及PD-L1表达变化，肿瘤体积超过2000mm³或实验达28天自动终止。
5.评估天然药物存在的潜在风险：
六周后，处死小鼠，取胃肠道组织、肝脏、肾脏、心脏、胸腺进行病理切片，观察各器官的病理情况，与正常组织进行对照，从而评估选出药物对不同细胞的毒性并进一步评估药物对小鼠各器官的影响。
PD-1/PD-L1抑制剂能够通过阻断该通路恢复T细胞抗肿瘤活性，因此成为了多种实体瘤和血液肿瘤治疗的核心手段，但约30%-70%患者因耐药导致疗效受限。这一现象源于T细胞表面关键免疫检查点分子PD-1与其配体PD-L1的相互作用——当肿瘤细胞异常高表达的PD-L1与PD-1结合时，会抑制T细胞功能，形成免疫抑制微环境，而药物耐药可能使该抑制机制未能被有效解除。
研究表明，耐药涉及代谢调控、基因异常及免疫微环境重塑等多重机制。例如，抑制三羧酸 (TCA) 循环通过激活ATF3信号上调PD-L1并增强糖酵解，削弱黑色素瘤对PD-1抑制剂的敏感性[1]；KRAS突变则通过降低肿瘤免疫原性及减少T细胞浸润介导非小细胞肺癌原发耐药[2]。李森等强调[3]，PD-L1异质性表达、抗原呈递缺陷及调节性T细胞(Treg) 富集共同驱动耐药。为逆转耐药，近红外光免疫疗法 (NIR-PIT) 等新技术逐步被应用：其通过靶向光敏技术诱导免疫原性死亡，联合PD-1抑制剂可重塑微环境并增强头颈癌疗效[4]。临床优化方面，肝癌分层治疗可提升PD-1抑制剂有效率[5, 6]，而霍奇金淋巴瘤耐药与JAK-STAT通路异常相[7, 8]。此外，PD-L1表达及错配修复缺陷 (deficient mismatch repair, dMMR) 被用于指导子宫内膜癌免疫治疗[9]，胃癌中PD-L1水平与预后的关联亦通过荟萃分析明确[10, 11]。
近年来，PD-1单抗耐药性机制的研究逐步深入，主要聚焦于肿瘤微环境 (TME) 的免疫抑制重编程，包括代谢异常 (如乳酸堆积、腺苷累积)、免疫检查点代偿性上调 (TIM-3、LAG-3) 以及免疫抑制细胞 (Treg、MDSC) 的扩增[12]。为克服这些障碍，天然药物因其多靶点调控特性成为研究热点。例如，槐耳提取物剂量依赖诱导结直肠癌细胞SW620铁死亡[13]，海洋来源的生物活性天然产物metachromin V作为结直肠癌的新型潜在治疗药物[14]，姜黄素通过抑制STAT3磷酸化下调肿瘤细胞PD-L1表达[15]，而小檗碱通过调节肠道菌群和降低腺苷水平增强PD-1疗效[16]。此外，天然化合物如雷公藤甲素 (triptolide)可靶向TGF-β/Smad3通路抑制Treg分化[17]，而白藜芦醇通过SIRT1介导的代谢重编程重塑TME[19]。值得注意的是，部分天然药物 (如青蒿素衍生物) 可通过抑制NF-κB/COX-2通路与PD-1单抗产生协同作用[18]，而紫草素通过诱导免疫原性细胞死亡激活STING通路逆转耐药[20]。尽管这些研究揭示了天然药物的潜力，但其临床转化仍面临挑战，包括生物利用度低、剂量依赖性毒性及机制复杂性[20]。未来研究需结合多组学技术和人工智能模型，优化天然药物的靶向递送系统，并探索其与现有免疫疗法的联合应用策略。
近年来，天然药物在逆转结直肠癌 (CRC) 患者PD-1耐药领域的研究取得显著进展，主要聚焦于肠道菌群调控、代谢干预及信号通路靶向等机制。例如，Zhang等人[21]的研究表明，黄连活性成分小檗碱 (Berberine) 可通过调节肠道菌群组成，降低产尿毒症毒素菌群 (如clostridium sensu stricto ) 的丰度，抑制酪氨酸-甲酚代谢途径，减少硫酸对甲酚和三甲胺N-氧化物的积累，从而改善肠道微环境，间接增强PD-1抑制剂的免疫应答。此外，Fang等人[22]发现具核梭杆菌 (fusobacterium nucleatum) 及其代谢产物琥珀酸通过激活肿瘤细胞SUCNR1-HIF-1α-EZH2轴抑制cGAS-STING通路，导致CD8+T细胞功能受损；通过抗生素或天然化合物抑制具核梭杆菌定植或中和琥珀酸，可逆转免疫治疗耐药1。Xu等人[23]则从代谢重编程角度揭示了半胱氨酸脱硫酶在铂类耐药中的作用，提示靶向铁硫簇代谢可能通过增强氧化应激压力，诱导肿瘤细胞死亡，为联合PD-1抑制剂提供潜在策略。这些研究为天然药物通过多靶点干预克服PD-1耐药提供了理论支持。以上研究表明，天然药物可用于逆转结直肠癌细胞的PD-1耐药性，但现已发现的可用于临床治疗的天然药物太少，不能满足患者治疗的需求，因此本课题希望可以发现更多的天然药物用于治疗结直肠癌。
本项目针对胃肠道肿瘤PD-1/PD-L1抑制剂耐药难题，开展天然药物联合治疗研究。通过构建耐药细胞模型筛选逆转耐药的关键天然药物，解析其对肿瘤免疫微环境的调控机制；利用动物实验验证药物与PD-1单抗联用的协同疗效及安全性。旨在通过天然药物多靶点作用重塑免疫微环境，为开发新型联合治疗方案提供理论依据与候选药物，推动肿瘤免疫精准治疗及天然药物创新应用。
参考文献：
[1]Wang, X., et al.Inhibition of TCA cycle improves the anti-PD-1 immunotherapy efficacy in melanoma cells via ATF3-mediated PD-L1 expression and glycolysis. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2023, 11(9), e007146.
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[3]李森,尹静, 林碧蓉. PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫逃逸中的机制研究进展. 《细胞与分子免疫学》, 2023, 39(4), 456-462.
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[13]贾一帆,邓文宏,邱振东,等.槐耳提取物剂量依赖诱导结直肠癌细胞SW620铁死亡及抑制其生物学行为[J].中国普外基础与临床杂志,2023,30(02):185-191.
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[20]Zhang, Y., et al. Astragalus polysaccharide potentiates PD-1 blockade by promoting dendritic cell maturation and CD8+ T cell infiltration. Frontiers in Immunology, 2023, 14, 1123456. 
[21]Zhang, X., Li, Y., & Wang, H. Berberine improves chronic kidney disease by modulating gut microbiota-derived uremic toxins. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2024,14(3), 456-467.
[22]Fang, J., Chen, L., & Liu, M. Fusobacterium nucleatum promotes colorectal cancer immunotherapy resistance via succinate-mediated metabolic reprogramming. Cell Host & Microbe,2023,31(5), 789-801.
[23]Xu, R., Zheng, Y., & Huang, J. (2022). Targeting cysteine desulfurase sensitizes colorectal cancer to oxaliplatin by inducing multiple cell death pathways. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2022, 7(1), 1-12.
1. 创新点：
研究基于天然药物逆转PD-1耐药的新策略，开发天然药物与PD-1单抗联合治疗的潜力。
2.项目特色：
开发PD-1单抗联合用药的新思路，结合天然药物尝试开发PD-1单抗治疗结直肠癌的新策略新方案，研究天然药物提高患者治疗时的安全性与耐受性。
技术路线：
summernote-img拟解决的关键问题：
本课题拟通过筛选天然药物，开发天然药物与PD-1单抗联合用药的新思路。
预期成果：
1.找到1-2种可逆转PD-1耐药性的天然药物；
2.本项研究预期发表北大核心论文1篇。
本项目计划2年完成：
2025.06-2026.05
1.查阅文献筛选潜在逆转耐药的天然药物
2.构建耐药细胞株
3.药物筛选
2026.06-2027.05
1.构建动物模型进行体内药效评估
2.进行安全性评价
3.整理研究结果，撰写论文，完成课题资料的结题工作。
卢旭航：2024级临床医学院6班学生，自2025年1月起跟随老师学习肿瘤学相关知识，对肿瘤学有浓厚兴趣，学习掌握了细胞培养，动物模型构建等基础实验技术，熟悉肿瘤生物学发展动态。具有自主学习能力、论文查阅能力，并有较好的组织能力，可以很好的领导团队成员。
刘子涵：2024级临床医学院临床医学6班学生。自2024年9月入学以来，积极参与学校所安排的基础医学实验课程，对课题研究所需的基础实验手段具有初步了解。此外通过学习，对肿瘤生物学的当前研究进展、研究手段有了一定的认识。具有自主学习能力、论文查阅能力，对待事情有耐心，充分利用课余时间自行学习实验操作。对生物学相关知识有一定接触，掌握相关文献资料的查阅方法，并从中学习到更多学术知识以及实验原理及方法。
吴祥鑫：2024级临床医学院6班学生。自2024年9月入学以来，积极参与学校医学基础实验课程，对课题研究所需要的基础实验手段具有初步了解。具备自主学习能力，充分利用课余时间自行学习实验操作，并掌握了相关文献资料的查阅方法，并从中学习到更多学术知识实验原理和方法。
董润霖：2024级临床医学院临床医学6班学生。自2024年9月入学以来，积极参与学校所安排的基础医学实验课程，对研究PD-1耐药逆转所需的实验手段具有初步了解，并认真研究学习。有一定的自主学习能力，掌握相关文献的查阅方法，在课余时间积极查阅学习实验操作手段，主动与老师交流学习。
王景阳：2024级临床医学院临床医学专业6班学生。自2024年11月跟随精准医学院老师学习肿瘤生物学相关方面的知识，并在假期期间自学肿瘤相关知识。在此期间，对肿瘤生物学的研究方法有了一定的认知，掌握PD-1单抗耐药机制以及其逆转策略的相关知识，具有自学能力，动手能力，论文查阅能力，并有较强的组织能力。在执行力方面较强，为本课题的开展奠定了基础。
赵海妍：2024级临床医学院6班学生。自2024年8月入学以来系统学习了专业相关的课程如生物学等，积极参加学校开展的实验课，掌握了基本医学实验操作，对课题研究所需的基础实验手段具有初步了解。通过学习，对肿瘤生物学的当前研究进展、研究手段有了一定的认识，具有较强的自主学习能力和文献查阅能力，积极参与和老师同学的讨论，对待事情有耐心，积极参加学校组织的学术讲座和学术交流活动，对科研怀有热情。
本课题依托济宁医学院精准医学研究院省级重点实验室。精准医学研究院主要致力于精准医学的基础和临床研究，特别是肿瘤的精确诊断、精准治疗、个性化预防以及风险 预测等方面的研究。
研究院现有专职科研人员 20余人，包括从国内外高校引进的优秀博士和博士后 18 人。形成了人才梯队合理、科研实力雄厚、具有较强国际竞争力的科研团队。研究院拥有分子生物学实验室、标准化细胞培养室、病理室、SPF级动物房等。实验仪器上有激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、小动物活体成像仪、荧光显微镜、液相色谱仪等实验所需仪器设施，在研究设施上保证了本项目的顺利进行。生物样本库现有上万例病人组织和血液样本以及独特的消化道肿瘤方面的基因敲除和转基因小鼠模型。
本课题指导教师为精准医学研究院教师李海滨博士，主要研究各种理化因素及其耦合对肿瘤(干)细胞生物学行为的调控及分子基础。主持山东省自然科学基金项目 1 项，校级项目3项，参与国家自然科学基金面上项目 2 项。曾指导本科生参加第十三届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛获二等奖。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 11500.00 8500.00
1. 业务费 3500.00 无 0.00 3500.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3500.00 发表文章版面费 0.00 3500.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 16500.00 购买与实验相关的材料，培育动物模型 11500.00 5000.00
结束

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