因乳腺癌具有早期症状隐匿、发展迅速、复发率高并且缺乏针对性治疗等特点，已成为女性目前发病率和死亡率最高的癌症。miR-155作为一种在多种肿瘤中异常表达的微小RNA，在乳腺癌肿瘤微环境的调控中发挥重要作用。miR-155能直接调控乳腺癌细胞的增殖、凋亡、周期及自噬等关键生物学行为，也能调节肿瘤微环境中免疫细胞（如NK细胞、巨噬细胞、MDSC）的功能进而影响肿瘤的发生发展、侵袭和转移。

本研究拟通过构建miR-155高表达和低表达细胞系，并通过CCK8、流式细胞术、电镜扫描、Western blot等对miR-155转染后的细胞系进行生物学鉴定。miR-155高表达和低表达乳腺癌细胞系分别进行体外与免疫细胞共培养，以及构建体内荷瘤小鼠模型，以此分析miR-155调控免疫细胞和肿瘤微环境的分子机制。深入研究miR-155对乳腺癌细胞增殖、凋亡、自噬和肿瘤微环境的影响及作用机制，以期为开发一种更有效的乳腺癌治疗方法提供理论依据。 

1. 构建miR-155高表达、低表达的瞬转和稳转细胞系

通过转染将miR-155mimic（高表达）和inhibitor（低表达）导入乳腺癌细胞构建瞬转细胞系。使用慢病毒载体构建miR-155稳定过表达或敲低乳腺癌细胞系，通过嘌呤霉素筛选获得稳转乳腺癌MDA-MB-231/MCF7细胞株。使用颈环法qPCR检测miR-155的表达水平，验证过表达和干扰效果。

2. miR-155对乳腺癌细胞的生物学功能的调控作用

通过CCK8检测miR-155的表达对乳腺癌细胞增殖的影响，通过TUNEL、流式细胞术检测对乳腺癌细胞凋亡、周期的影响，通过电镜、CIF检测miR-155的表达对乳腺癌细胞自噬的影响。并通过转录组学分析结合qPCR、WB等技术验证揭示其分子机制。

3. 乳腺癌细胞和免疫细胞的体外共培养实验

将miR-155过表达或干扰的MDA-MB-231/MCF-7乳腺癌细胞株分别与NK细胞和THP-1细胞进行共培养24h，通过流式细胞术检测NK细胞活性和M1/M2型巨噬细胞的极化比例并进行数据分析，比较不同组别之间的差异；使用ELISA试剂盒检测促炎因子（IFN-γ、TNF-α）和抑炎因子（IL-10、TGF-β）的表达水平；使用荧光显微镜检测免疫细胞对不同miR-155的表达水平的乳腺癌细胞的杀伤作用。使用qPCR、WB等技术检测乳腺癌细胞免疫检查点的变化。

4. miR-155在小鼠乳腺癌动物模型中的调控作用

将miR-155过表达或干扰及阴性对照的对数生长期的MDA-MB-231/MCF-7细胞接种至雌性裸鼠腋下构建小鼠乳腺癌荷瘤模型，接种后每隔两天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积，待肿瘤生长至一定体积后，处死小鼠，取肿瘤组织，拍摄肿瘤的状态，测量肿瘤重量，大小；采集小鼠的外周血、脾脏和肿瘤（研磨小鼠肿瘤并酶解后过筛）单个核细胞，使用流式细胞术检测NK细胞、MDSC细胞和M1/M2巨噬细胞的比例。

5. miR-155调控乳腺癌凋亡、自噬和肿瘤微环境的分子机制

在miR-155高表达稳筛乳腺癌细胞系中过表达基因IKBKE，通过拯救实验观察其细胞凋亡和自噬是否发生逆转；miR-155高表达稳筛乳腺癌细胞系中过表达基因RELA，观察其对免疫细胞的影响是否发生逆转。通过Western blot检测IKBKE、RELA过表达对相关信号通路（NF-κB通路）的影响。 

miR-155最初是在B细胞淋巴瘤中发现的，其编码基因BIC位于人类染色体21q21[1]。随后，研究发现miR-155在多种癌症中均呈现上调表达[2-4]。随着研究的深入，人们认识到miR-155是一类具有多种功能的microRNA[5]。

miR-155在正常生理过程中发挥着多方面的重要作用。早期研究已经表明，miR-155水平在激活的成熟T细胞和B细胞中迅速上调，也可以在生发中心B细胞、巨噬细胞和树突状细胞中上调[6]。其他研究也证实，缺乏bic/miR-155基因的小鼠的B细胞和T细胞反应减弱。免疫后的小鼠产生的IgM和转换后的抗原特异性抗体显著降低，而T细胞反应在bic/miR-155缺陷小鼠中也表现出缺陷[7]。miR-155的过表达则可增强抗原特异性CD8+ T细胞的反应，而缺乏miR-155的CD4+ T、CD8+ T细胞产生IFN-γ的细胞效率也较低[8, 9]。miR-155在酒精诱导的肝脏脂肪积累和炎症反应中起着关键作用，可能通过调节过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、C/EBPβ等靶基因的表达以及影响巨噬细胞和库普弗细胞的极化状态来发挥作用[10]。总之在免疫反应中，miR-155缺失会产生多种免疫功能障碍，如T细胞依赖的抗体应答受损和细胞因子分泌障碍等，严重影响其免疫功能和多种生命活动。并且在活化的巨噬细胞、T 细胞、B细胞中miR-155表达显著增强[11]。

Hanahan等人于2010年在之前肿瘤六大标志的基础上进一步阐述了肿瘤的两个特征，即能量代谢的重新编程和逃避免疫破坏。除了癌细胞外，肿瘤还表现出另一个维度的复杂性：它们包含一系列被招募的、看似正常的细胞，这些细胞通过创造“肿瘤微环境”来帮助癌细胞获得标志特征[12]。在肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中，miR-155起着重要的调节作用。肿瘤微环境（TME）由浸润免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和血管及淋巴管网络组成[13]，这些细胞通过miR-155与不同类型的癌细胞进行多重交流[11]。不同类型的浸润免疫细胞参与TME并有助于调节抗肿瘤信号与促肿瘤信号之间的微妙平衡。其中，淋巴细胞（特别是T细胞）、自然杀伤细胞（NKs）和树突状细胞（DCs）对肿瘤抑制至关重要，而调节性T细胞（Tregs）、髓系来源的抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）被认为发挥免疫抑制作用。研究人员发现，当miR-155在CD8+ T细胞中过表达时，接受肿瘤挑战的小鼠的生存时间显著延长[14]。DCs中miR-155的缺陷会损害它们的成熟、迁移能力、细胞因子产生和激活T细胞的能力[15]，在小鼠结直肠癌模型内，富含miR-155的外泌体可以激活DCs，促进其分泌干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子加快辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的分化、增殖进程，增强其细胞毒性功能[16]。miR-155可以负向调控SHIP-1的表达，引起NK细胞中AKT和ERK磷酸化增强，进而促进NK细胞存活、扩展、激活和肿瘤控制的增强[17]。在治疗卵巢癌（OvCa）方面，miR-155-5p在抗肿瘤TAMs内显著上调，并使TAMs的免疫抑制活性得以逆转[18]。人类转移性黑色素瘤细胞的分泌物通过miR-155在转录后水平下调Treg细胞CTLA4 mRNA，同时上调Treg细胞中FOXP3的表达促进其免疫抑制功能[19]。在胰腺癌（PC）中，miR-155通过负转录调节SHIP-1促进免疫抑制性髓系源抑制细胞（MDSC）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的扩增，使免疫疗法无效[20]。在肝癌[21]、肾细胞癌[22]、非小细胞肺癌[23]和胶质瘤[24]等大部分肿瘤中，miR-155促进TAMs向M2型细胞转换，只有少数肿瘤比如在卵巢癌[18]中miR-155促进TAMs抗肿瘤活性。miR-155也可作为TAMs外泌体携带的免疫抑制分子，可以调节免疫微环境通过对程序性细胞死亡配体1（PD-L1）表达的调控，导致CD8+T细胞功能耗竭和细胞毒性活性降低[25]。

自噬是一种细胞内的分解代谢途径，通过隔离泡（自噬体）与溶酶体（提供水解酶）的融合，导致蛋白质和细胞器的降解与回收[26]。自噬在癌症中有两种作用：在肿瘤早期阶段具有预防作用，但在后期阶段则促进肿瘤生长[27, 28]。

自噬可以在肿瘤微环境（TME）中由不同因素在不同细胞中诱导，其诱导和激活既可以促进肿瘤进展，也可以抑制肿瘤进展[29]。最近的一些研究发现，自噬在免疫逃逸和调控肿瘤微环境中的趋化因子与细胞因子中发挥了作用[30]。在一项针对胰腺导管腺癌（PDAC）的研究中，研究者发现自噬通过涉及NBR1的选择性机制靶向癌细胞中的MHC-I进行自噬降解，从而促进了肿瘤的免疫逃逸[31]。此外，有报道称，肝脏中的自噬通过刺激调节性T细胞来抑制抗肿瘤T细胞反应[32]。在肺部，由于LKB1缺失导致的自噬增强与抗原处理和呈递的减少相关，从而削弱了免疫检查点阻断治疗的效果[33]。除了影响抗原呈递外，自噬抑制可以导致免疫细胞浸润增加。在PyMT乳腺肿瘤中敲除FIP200，这导致CXCL9和CXCL10的产生增加，这两种趋化因子能够促进抗肿瘤CD8+细胞毒性T细胞进入肿瘤[34]。类似地，通过遗传或药理手段在B16-F10黑色素瘤细胞中消除自噬会导致CCL5的表达和分泌增加，从而增强NK细胞进入肿瘤[35]。

鉴于miR-155在肿瘤的增殖、转移和肿瘤微环境中的多重调控作用，miR-155可以为乳腺癌诊断和治疗提供有潜力的有效策略。本课题利用脂质体瞬转miR-155乳腺癌MDA-MB-231/MCF7细胞和慢病毒稳转乳腺癌MDA-MB-231/MCF7细胞构建miR-155高表达和低表达细胞系，进而研究has-miR-155-5p Mimics、Inhibitor对乳腺癌MDA-MB-231/MCF7细胞的凋亡、细胞周期、自噬等生物学功能的调控与机制。慢病毒稳转乳腺癌MDA-MB-231/MCF7细胞构建过表达和低表达稳筛细胞系后通过与免疫细胞共培养和制备荷瘤小鼠，进而研究miR-155对乳腺癌肿瘤微环境（TME）和免疫检查点的调控作用机制。

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1. 聚焦miR-155的双重调控网络，整合肿瘤细胞自身行为与免疫微环境的交互作用。项目突破单一维度研究，系统揭示miR-155在乳腺癌细胞增殖/凋亡/自噬等内在生物学行为中的直接调控作用，同时通过体外共培养与体内荷瘤模型，创新性解析miR-155对肿瘤微环境中NK细胞、巨噬细胞极化、MDSC等免疫细胞功能的重编程机制。"肿瘤细胞-免疫微环境"双轨式研究策略，创新了miR-155在乳腺癌中调控网络的研究。

2. 建立自噬-免疫逃逸轴的新型机制探索范式。通过结合电镜扫描、CIF检测等自噬表征技术与免疫细胞浸润分析，项目创新性地将自噬过程与肿瘤免疫微环境调控相耦合。特别是通过拯救实验验证IKBKE/RELA介导的NF-κB通路在miR-155调控中的枢纽作用，揭示自噬与免疫检查点（如PD-L1）的分子互作网络，为解析乳腺癌免疫逃逸提供了新的理论框架。

3. 开发多模态研究平台实现调控机制的时空动态解析。项目特色在于构建了涵盖瞬转/稳转细胞系、多类型免疫细胞共培养系统、荷瘤小鼠模型的三维研究体系，结合流式检测与组织水平转录组/WB验证，实现了从体外分子机制到体内整体效应的多尺度验证。其中通过慢病毒稳转技术建立MDA-MB-231/MCF7双细胞模型，有效克服乳腺癌异质性对研究结果的干扰。 

1.研究技术路线

2.拟解决的问题

（1）揭示miR-155调控乳腺癌生物学功能和肿瘤微环境的作用机制；

（2）寻找前期诊断乳腺癌的易感基因和调控肿瘤微环境的关键基因；

（3）揭示介导miR-155治疗乳腺癌的作用机制。

3.预期成果

（1）提出并解析miR-155调控乳腺癌肿瘤微环境的分子机制

（2）发表论文1-2篇；

（3）获省级以上学科竞赛奖项1-2项。

1.准备阶段

2025年6月，查阅相关资料，对相关研究进行文献检索分析，在此基础上建立本项目实验方案。

2.实施阶段

2025年7月-2025年8月，建立慢病毒载体miR-155稳定过表达或敲低乳腺癌稳筛细胞系；

2025年9月-2025年11月，通过细胞共培养揭示免疫细胞对miR-155高表达和低表达乳腺癌肿瘤细胞的杀伤作用。并通过流式细胞术、酶联免疫等检测miR-155高表达和低表达乳腺癌肿瘤细胞对免疫细胞的调控和细胞因子表达的影响。

2025年12月-2026年2月，制备裸鼠荷瘤模型；通过流式细胞术等评估miR-155对乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞的调控作用。

2026年3月-2026年6月，结合多组学分析和qPCR、WB实验验证，解析miR-155调控乳腺癌细胞生物学功能和肿瘤微环境的分子机制。

2026年7月-2026年12月，通过靶基因的拯救实验，揭示miR-155对乳腺癌细胞的增殖、凋亡、自噬等生物学功能和肿瘤微环境的调控及分子机制。