基于工程化红细胞外囊泡的核酸药物靶向递送系统治疗骨关节炎的研究

申报人：王可瑜申报日期：2025-03-24

基本情况

所属批次:

2025创新项目

项目名称:

基于工程化红细胞外囊泡的核酸药物靶向递送系统治疗骨关节炎的研究学生申报

项目类型:

创新训练项目

所属学科门类:

医学

所属专业类:

药学类

项目来源名称:

学生来源于教师科研项目选题

项目归属学院:

项目期限:

二年期

项目简介:

递送技术被认为是药物开发的最后一公里，是生物医药未来的卡“卡脖子”难题。本项目立足于治疗骨性关节炎的核酸药物靶向递送系统的设计与应用，建立具有软骨组织靶向能力的新型红细胞外囊泡纳米递送平台，实现核酸小分子控制释放、靶向递送和骨性关节炎(OA)的软骨修复。项目拟开展以下研究工作：（1）建立新型红细胞外囊泡（REVs）靶向递送体系，提高REVs对软骨基质的靶向识别能力；（2）评价新型REVs靶向递送小核酸siRNA(siMMP-13)治疗软骨病损效果，提高核酸药物治疗OA的生物安全性和有效性；本项目通过构建高度靶向软骨基质的REVs药物缓释体系，充分挖掘关节腔内给药体系在治疗骨性关节炎方面的巨大潜力，通过阐明REVs突破软骨基质屏障的分子调控机制，为利用REVs靶向递送小核酸药物治疗OA提供可靠的理论依据。

负责人曾经参与科研的情况:

负责人曾获得山东省大学生医养健康创新创业大赛一等奖，参加挑战杯项目获得校级重点立项，获得山东省科技翻译大赛三等奖。项目组核心成员苗俊清现主持2024年大学生创新创业训练计划项目（国家级重点项目），3D打印的双相支架复合间充质干细胞修复骨软骨损伤的研究。

指导教师承担科研课题情况:

指导教师近年来主持4项省市厅级科研项目、参与多项国家级和粤港澳项目。主持“医工融合智能康复医疗设备关键技术山东工程研究中心”、“山东省智能康复工程研究中心”等平台类项目，科研经费包括济宁医学院高层次人才科研启动经费总计 450万，项目指导老师组成员入选2023年度及2024年度“全球前2%顶尖科学家榜单”。

指导学生获奖情况：

2023-03至203-1构建基于ERAS理念下的膝关节置换(TKA)围手术期管理模式金鼎奖

2020-10至203-1康桥医联康复综合服务平台金鼎奖

2019-09至2023-1康桥医联康复综合服务平台银奖

2021-12至203-1构建基于ERAS理念下的膝关节置换(TKA)围手术期管理模式铜奖

指导教师对本项目的支持情况:

指导项目整体设计、给予研发经费和技术支持。

项目级别:

省级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	王可瑜	康复医学院	康复工程（本科）	2023	外泌体载药体系构建	第一主持人
2	孙语	中西医结合学院	针灸推拿学（本科）	2024	骨性关节炎动物实验	成员
3	苗俊清	康复医学院	康复工程（本科）	2022	工程化外泌体体外功能验证	成员

指导教师

序号	教师姓名	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	梁宇杰	康复医学院	否	第一指导教师
2	张元民	康复医学院	否	指导教师

立项依据

研究目的:

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种严重影响患者生活质量的关节退行性疾病。目前，全球OA患者数量高达8亿,我国OA患病总数超过1.5亿。随着社会老龄化进程加速，骨性关节炎的发病率急剧攀升，给国家、家庭和个人带来沉重的经济负担，已成为中老年人致残的主要原因，世界卫生组织（WHO）也将其列为残疾的第二大原因。目前，临床治疗仍然集中在缓解关节疼痛，改善症状以及人工关节置换术。迄今为止，临床上尚无有效治愈骨关节炎或延缓OA病程的药物。核酸药物的基因治疗是在疾病发生的最根本层面上实现骨关节炎治疗的重要策略。然而,通过关节内注射核酸药物易快速被清除，并且带负电荷的糖胺聚糖组成致密无血管软骨基质屏障，严重阻碍核酸小分子药物进入靶细胞，降低药物疗效，这是骨关节炎药物研发屡次失败的主要原因。因此,开发安全高效的核酸小分子药物递送系统有效靶向关节并实现软骨修复与再生是OA基因治疗的压舱石。

药物递送系统（DDS）作为药物开发的“最后一公里”，是生物医药开发中“卡脖子”难题。仿生药物递送系统近年来取得了瞩目的进展，特别是细胞来源的纳米囊泡载体因具有人工载体难以取代的天然性和功能性而愈发受到关注。这些由细胞分泌的纳米粒子在细胞间的通讯和调控中起着关键作用。自2013年诺贝尔生理学和医学奖授予发现了“细胞的囊泡运输调控机制”的科学家之后，细胞外泌体的研究便迅速成为科学界的焦点。由于外泌体纳米囊泡不仅可保护核酸不被降解，还能穿过细胞膜，且不易引起免疫反应，成为传递核酸和其它基因药物的理想载体。特别是红细胞来源的EVs（REVs）,它们避免了有核细胞EVs在药物传递中带来的基因转移风险。尽管如此，在将REVs用于治疗OA的药物递送中，依然面临严峻挑战：一是天然REVs对软骨组织缺乏特异靶向性；二是REVs通过软骨屏障进行药物递送治疗OA的确切分子机制尚不清楚。因此，提升REVs对软骨组织的亲合力和药物递送效率，揭示REVs穿越软骨屏障的分子机制，对于开发新型REVs靶向药物递送策略，从而突破OA治疗的瓶颈至关重要。在前期工作中，项目研发小组采用化学方法将软骨基质亲和肽PIGF2结合SLC4A1锚定肽E4表达于红细胞外囊泡(REVs)表面，实现REVs靶向抑制软骨细胞基质金属蛋白酶(MMP)-13，从而抑制了OA关节软骨基质的降解；前期研究结果初步提示REVs膜上的水通道蛋白AQP1调控REVs形变，影响其跨越软骨屏障能力。基于此，本项目提出科学假设：REVs膜上整合AQP1可使细胞外囊泡快速膨胀和收缩以适应组织基质的渗透性变化，从而调控其穿透软骨屏障和靶向治疗OA的生物学行为。

本项目针对细胞外囊泡递送OA治疗药物存在靶向不足与软骨屏障等问题，拟对红细胞外囊泡靶向修饰，建立新型REVs递送体系，提高REVs对软骨基质的靶向识别能力；并以OA动物模型评价新型REVs靶向递送小核酸药物siMMP-13治疗软骨病损效果。本研究将为细胞外囊泡作为DDS的研究开拓关节腔局部递送和软骨组织损伤治疗的新篇章，对疾病的精准靶向治疗具有广泛的应用价值和重要意义。

研究内容:

2.1 化学生物学改造红细胞外囊泡（REVs）的靶向递送核酸药物体系构建

通过红细胞外囊泡表面锚定肽(SLC4A1-E4)偶联软骨基质靶向肽。首先筛选特异结合红细胞外囊泡多肽及验证。项目前期研究已通过蛋白组学分析筛选REVs的高表达膜蛋白SLC4A1，Western blot进行验证；表达纯化REVs的高表达膜蛋白（REVs标志蛋白）；利用噬菌体展示文库筛选REVs标志蛋白的特异结合多肽，体外合成REVs结合多肽（锚定肽E4）；细胞实验评价经锚定肽修饰的REVs对红细胞的亲和力。利用此锚定肽模块化组合软骨基质靶向肽PIGF-2，可以将靶向分子偶联到外泌体表面，从而改变红细胞外囊泡靶向性。这种外泌体表面装载方式操作简单、成本低廉且不破坏外泌体原有结构，用于药物装载回输，具备临床应用前景。

另外一种方案是利用糖代谢标记策略来实现红细胞外囊泡表面靶向多肽修饰。首先利用一种常见的代谢标识剂Ac4ManAz（四乙酰基N-叠氮乙酰甘露糖胺）对红细胞表面含唾液酸的糖蛋白中进行糖代谢标记。Ac4ManAz被红细胞摄取后会在红细胞胞表面人工生成了含有叠氮基团的非天然唾液酸。因为红细胞外囊泡来源于红细胞膜，所以外泌体的表面也展示叠氮基团，方便后续通过无铜点击化学反应引入二苄基环辛烷(DBCO )-多肽进行做外泌体靶向修饰。本方法这是一种简单、高效且非破坏性的方法，不影响外泌体的完整性和生物活性，更适用于红细胞外囊泡的靶向改造。

合成PIGF-2多肽，通过以上二种化学方法修饰，将PIGF-2多肽结合REVs，利用电穿孔法将核酸小分子siRNA (siMMP-13)或MMP13-ASO 导入PIGF-2-REVs中，建立工程化工程化红细胞外囊泡，对其进行载药量测定、体内外示踪工程化红细胞外囊泡的靶向递送能力检测。利用OA软骨外植体实验评价PIGF-2多肽修饰的工程化红细胞外囊泡穿越软骨组织屏障能力、对软骨组织的结合力和软骨细胞的靶向效能。

2.2 负载工程化红细胞外囊泡的水凝胶控释药物控释平台的软骨修复支架的设计与构建

利用明胶水凝胶的温敏型以及光固化成型双交联技术将GelMA水凝胶与工程化改造的红细胞外囊泡复合构建成可注射型水凝胶，并对其组分、交联方法和交联条件进行优化。表征此可注射型工程化外囊泡的水凝胶材料的成分和微观结构，体外研究了含REVs的水凝胶药物释放行为，并探讨究了水凝胶在大鼠皮下的降解率以及生物相容性。对水凝胶的组分、浓度及交联度进行设计，实现外泌体的可控释放。优化相关制备参数来调控支架的结构和壳核结构厚度，进而调控支架的不同相的力学性能和降解性能。

2.3 体内外模型评价红细胞来源外囊泡靶向递送和控释系统对软骨的生物学行为的影响

软骨细胞分离培养及生物学行为鉴定，REVs靶向递送siMMP-13/MMP13-ASO至软骨细胞，探讨REVs靶向递送siMMP-13/MMP13-ASO及负载工程化红细胞外囊泡的水凝胶抑制软骨基质分解代谢及维持软骨细胞特性等作用。

建立大鼠、实验兔关节炎性骨软骨缺损模型，关节腔注射红细胞来源外囊泡靶向递送和控释体系，根据核磁MRI和组织学评估OA关节软骨病变情况，研究具有靶向性的REVs递送siMMP-13/MMP13-ASO治疗OA软骨病损修复的效应。

本项目首先筛选红细胞外囊泡膜蛋白SLC4A1高效结合多肽E4构建新型REVs递送体系，验证REVs靶向递送siMMP-13对大鼠OA软骨病损的修复效应；并利用大鼠OA软骨缺损模型进一步验证其修复软骨组织效果。旨在为利用REVs靶向递送技术突破临床难治性OA疾病的瓶颈提供新的策略。

图1.本项目的研究思路。

国、内外研究现状和发展动态:

3.1 新型细胞外囊泡为核酸药物靶向递送提供优良的纳米载体

核酸药物通过特异性调控靶基因表达，有望攻克尚无药可医的包括骨关节炎在内的多种难治性疾病，在生物医药界掀起继小分子药物、抗体药物后的“第三次制药浪潮”。然而，小核酸药物在人体内不稳定，进入血液之后极易被核酸酶降解，且容易通过肾脏清除，半衰期短。因此，要充分发挥核酸药物的潜力，就必须开发一种安全、高效、生物相容性、稳定、组织特异性和非免疫原性的给药系统，以确保核酸药物在体内存留足够时间并精确靶向到病变部位。随着纳米技术和核酸药物的最新研究，各类核酸纳米颗粒在疾病治疗方面显示出巨大的前景。

作为一种由细胞分泌的直径为30～1000 nm的脂质双分子层及其内容物组成的膜性结构，细胞外囊泡（EVs）或通常称之为“外泌体”在细胞间通讯中具有重要作用，参与了一系列生理与病理过程的调节。EVs作为一种细胞间传递信息和互相调控的胞外器官，能够穿透生理屏障和细胞而不易引发免疫反应，成为一种理想的生物相容性药物输送载体。EVs的脂质膜围绕亲水核心，允许同时掺入疏水和亲水药物、核酸和蛋白质。这种天然的细胞囊泡纳米级载体因可保护核酸药物免于降解，入胞效率高而引起药物递送研发领域的密切关注（图2）。

细胞外囊泡所具备的诸多生物学优势在作为新型药物输送工具上发展潜力巨大。然而，在人体关节病变部位直接注射胞外囊泡，因其靶向性低而无选择性地进入所有细胞及组织，且在充斥高浓度炎症因子和降解酶的病变部位的恶劣微环境条件下，胞外囊泡难以发挥其生物学效应。因此，需利用靶向配体和共价连接的胞外囊泡膜的表面修饰改造，在EVs上安装GPS定位，赋予EVs靶向性。为了实现EVs靶向递送药物，目前研究主要通过基因编码的靶标序列与EVs膜上的蛋白融合表达，将靶向片段展示于EVs表面，图3展示EVs的工程化改造用于靶向药物递送，系统阐述了通过工程化改造EVs有望成为纳米医学的突破点。该文引起国内外药物递送领域的广泛关注，已被国内外同行引用627次，并入选ESI高被引论文。

同时，通过编码多肽配体和外泌体膜蛋白Lamp2b的融合表达展示靶向配体于有核细胞来源的EVs膜表面，项目团队实现对软骨细胞、间充质干细胞的核酸及小分子药物靶向递送，研究成果已发表3篇中科院一区论文(ACS Appl Mater Interfaces.2020，影响因子9.5);(Biomaterials.2021，影响因子14; Theranostics.2022; 影响因子12.4)，并入选ESI高被引论文和中国骨科领域高价值论文TOP100。项目团队在EVs领域的研究结果提示：工程化EVs靶向性改造显著提高EVs穿透软骨组织屏障递送药物的能力，关节腔注射工程化EVs递送核酸药物miRNA可有效抑制OA软骨的退变。然而，我们也发现通过基因工程手段改造EVs存在靶向性多肽容易降解和基因整合的生物安全性问题。为此，项目团队通过红细胞外囊泡膜蛋白CD63连接破骨细胞的靶向亲和肽TRAP-CP05对REVs进行化学改造，实现靶向递送anti-miR-214至破骨细胞治疗骨质疏松症。目前已有多家国外公司开展工程化细胞外囊泡载药系统的研发，并有多款产品进入临床试验阶段（表1）。

图2. 细胞外囊泡生成机制，结构及作为纳米递送载体的优势

(Liang,Y.et al.,Chembiochem.2021)。

图3.细胞外囊泡表面工程化改造用于药物靶向递送

表1.工程化细胞外囊泡载药的临床及临床前产品开发

3.2 红细胞外囊泡（REVs）为穿越软骨屏障递送药物治疗骨关节炎提供新的解决思路

目前尚无能够可改变OA疾病进程的疗法。软骨细胞是致密软骨组织的唯一细胞类型，也是OA软骨退化的主要靶点。尽管一些生长因子、基质金属蛋白酶抑制剂和抗炎小分子在临床前研究中展现出了抑制软骨细胞退化的潜力，但都在临床试验中以失败告终。这主要是由于关节内注射药物会受到关节液中酶和蛋白质的作用，或通过关节周围滑膜下方的淋巴管和毛细血管引流，导致药物快速清除。此外，药物还需穿透厚达1000至2000微米的软骨层，才能接触到软骨细胞，以抑制软骨及软骨下骨的病理性变化。然而，软骨中的致密基质由交错排列的胶原纤维和蛋白多糖构成，形成了复杂的三维网络结构。蛋白多糖中丰富的负电荷在胶原纤维网络中建立起电荷屏障。这些物理和电荷的双重屏障形成了复杂的生物屏障，大大限制了药物在软骨层中的扩散，从而显著减弱了治疗效果。

EVs表面的多样粘附蛋白以及其纳米级尺寸和可塑性使其能够穿透生物屏障。项目团队已建立EVs递送药物平台，关节腔注射后EVs携带药物跨越软骨屏障治疗OA(图4)，但其穿透软骨屏障的机制尚不清楚。与常用的有核细胞来源EVs相比，红细胞来源的外囊泡(REVs)缺乏核DNA及线粒体DNA，作为药物递送载体不会造成外源基因DNA污染，而且来源丰富。因此，REVs作为优良的纳米药物递送载体，在药物递送领域已受到高度关注，可为OA治疗提供新的思路。然而，天然EVs对软骨组织缺乏特异靶向性，增强EVs对软骨基质的亲和力将极大提高药物递送治疗OA的效果。

项目团队通过化学方法对EVs进行软骨基质亲和肽PlGF-2靶向修饰，通过增加保护序列，增强EVs表面展示多肽的稳定性，有望提高负载药物递送效率，解决基因工程改造EVs可能产生的生物安全性问题。已有研究采用对ECM具有高度亲和力的PlGF-2（123–144）肽修饰工程化EVs，可以延长其在软骨组织中的滞留时间。最近，Delint等构建了PlGF-2与超电荷绿色荧光蛋白（scGFP）的纳米复合物,插入间充质干细胞（MSCs）的质膜中，结果表明PIGF-2纳米复合物修饰的MSCs对软骨ECM的亲和力显著增加。在前期研究中，项目团队利用胶原靶向特异性结合多肽序列PlGF-2（123–144）对EVs进行了化学生物学处理，在EVs表面通过DSPE-PEG展示此亲和肽，可有效提高EVs靶向软骨基质的能力（详见研究基础）。

图4.关节腔注射工程化细胞外囊泡递送系统开发

(Liang,Y.et al.,Theranostics.2021; Biomaterials.2021; Curr Med Chem. 2021)。

3.3 项目前期研究工作：基于SLC4A1筛选锚定肽E4改造REVs,建立靶向软骨基质的新型红细胞外囊泡递送系统REVs-E4-PIGF-2

目前改造细胞外囊泡建立工程化外囊泡递送体系通常是通过基因工程的方法将靶向基团表达于EVs表面。利用Lamp2b对外泌体膜蛋白进行基因工程改造，将组织和细胞特异性多肽融合于Lamp2b,已实现靶向递送药物至脑和软骨等组织。四跨膜蛋白CD63也常被用作融合蛋白展示于EVs表面。前期工作中，我们团队通过红细胞外囊泡膜蛋白CD63连接破骨细胞的靶向亲和肽TRAP-CP05对REVs进行化学改造，实现靶向递送anti-miR-214至破骨细胞治疗骨质疏松症。然而，进一步研究发现，与间充质干细胞来源的EVs比较，REVs中CD63表达水平较低,然而REVs的SLC4A1表达水平显著高于CD63。在此，本团队通过噬菌体展示技术筛选出特异性结合SLC4A1的锚定肽段XRE4(图5)。基于SLC4A1-XRE4的结合方式，我们创建REVs的靶向递送小核酸分子 siMMP-13/MMP13-ASO 体系(REVs-E4-PIGF-2)，可显著抑制软骨细胞中显著MMP-13表达水平（见研究基础）。因此，利用REVs-E4-PIGF-2靶向递送 siMMP-13/MMP13-ASO 有望穿透软骨屏障，抑制软骨基质分解代谢，从而实现靶向治疗OA。此外，EVs通过软骨屏障进行药物递送治疗OA的确切分子机制尚不清楚。因此，深入解析EVs穿透软骨屏障的分子调控机制，将为研发基于红细胞囊泡的核酸药物递送载体治疗OA提供理论支撑。

图5.噬菌体展示技术筛选出结合红细胞外囊泡膜蛋白SLC4A1的锚定肽段XRE4。

创新点与项目特色:

4.1 首次提出红细胞外囊泡蛋白 SLC4A1 作为标志蛋白分子筛选结合多肽，不仅规避了有核细胞来源外泌体的基因水平转移风险，而且解决了 CD63 作为红细胞外囊泡标志蛋白分子表

达水平低的问题，为利用靶向多肽化学改造红细胞外囊泡提供了新的思路；

4.2 创建靶向软骨细胞的新型红细胞外囊泡递送系统 REVs- PIGF2 负载核酸分子 siRNA/ASOMMP-13，促进核酸分子精准靶向软骨细胞，突破了骨关节炎保守治疗的瓶颈，为实现骨性关

节炎精准治疗提供了新策略。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

一、技术路线

5.1构建红细胞外囊泡靶向软骨基质递送小核酸siMMP-13/MMP13-ASO体系（si-REVs- PIGF-2）及表征

图6. 新型红细胞外纳米囊泡递送体体系的构建方案。

5.2 在细胞水平、离体软骨组织水平评价siREVs-E4-PIGF-2的靶向性和功能，在体动物OA模型评价工程化细胞外囊泡递送小核酸siMMP-13/MMP13-ASO的治疗软骨病损的效果。 summernote-img

图7.OA动物模型评价工程化细胞外囊泡递送小核酸siMMP-13/MMP13-ASO治疗软骨损伤。

二、拟解决的问题

（1）探究化学生物学改造新型红细胞外囊泡递送系统对软骨基质的靶向识别能力以及工程化红细胞外囊泡的核酸药物递送系统与水凝胶支架复合的控释效果；

（2）探讨靶向修饰红细胞外囊泡递送小核酸药物siRNA（siMMP-13）及其负载水凝胶支架的控释放系统治疗OA软骨病损效果；

三、预期成果

（1）建立基于红细胞外囊泡靶向软骨基质的新型递送体系（REVs-PIGF-2)；

（2）建立REVs-PIGF-2靶向软骨基质递送核酸小分子体系，提高核酸小分子抑制软骨基质分解代谢，高效安全的基因治疗OA软骨病损；

（3）在项目团队成员发表科研论文1-2篇，参加重要学术会议1-2次。

项目研究进度安排:

本项目计划从2025年06月开始，到2027年06月结束，为期２年，项目计划安排如下表所示：

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩：

本项目申请依托于济宁市关节与运动康复工程实验室，项目核心指导老师简介：

张元民，教授，主任医师，医学博士，硕士生导师，济宁市政协委员、致公党济宁市委会副主委，现任济宁医学院康复医学院院长，济医附院关节与运动医学科主任。在山东省较早开展关节镜微创手术，开展了关节镜下半月板缝合，前后交叉韧带一期重建技术，复杂的膝、髋关节置换和关节翻修等技术项目。担任中国康复医学会教育专业委员会委员、中国康复医学会智能康复专业委员会第一届常务委员、山东省康复医学会骨与关节委员会副主任委员、山东省预防医学会骨与关节疾病防治分会副主任委员、山东省健康管理协会运动与健康促进专业委员会副主任委员、山东省医学会骨科手术加速康复多学科联合委员会第一届委员会副主任委员、山东省残疾人康复学会会员、山东省医学会骨科学分会第十届委员会委员等。曾荣获山东省省级青年岗位能手、山东省抗菌药物应用先进个人、山东省总工会颁发的富民兴鲁劳动奖章、山东省医院优秀科主任、山东省卫生健康系统劳模（高技能人才）张元民创新工作室、中国医师协会人文医生荣誉称号、济宁市自然科学学科带头人提名奖等荣誉称号。

梁宇杰，博士，教授，济宁市关节与运动康复工程实验室主任，学校全职引进的高层次人才，受聘为特聘教授，硕士研究生导师，主要从事工程化外泌体的靶向药物递送系统开发及治疗骨关节炎的关节腔注射递药系统研究。近年来，在国际权威杂志Nature Communication, PNAS, JACS, Biomaterials, J Control Release, Theranostics，ACS Appl Mater Interfaces，Molecular Therapy 等已累积发表130篇高水平SCI收录论文，近四年内的中科院一区论文15篇（一作/通讯），影响因子大于10分的六篇, 7篇论文入选全球Top 1% ESI高被引论文和热点论文, 二篇论文入选中国骨科领域高价值论文TOP100，论文被引用 3,426余次，H-index:30 (Scopus),入选2023年度“全球前2%顶尖科学家榜单”。已申请专利5项，获3项中国专利授权。自2020年博士毕业于香港中文大学至今，已获得二项省级自然科学基金面上项目、深圳市自然科学基金面上项目资助、并参与了多项国家自然基金项目，在研主持项目总经费190万元，于2021年入选深圳市海外高层次人才。目前担任 Extracellular Vesicle期刊、Journal of Orthopaedic Translation (JOT) 等国际期刊青年编委，为《Acta Biomaterialia》，《Journal of Extracellular Vesicles》，《ACS nano》，《Journal of Controlled Release》，《Journal of Nanobiotechnology》等杂志特约审稿人。

项目团队开展噬菌体展示技术筛选红细胞外囊泡锚定肽的研究工作

（1）不同细胞源性细胞外囊泡蛋白表达差异

分别提取人关节液间充质干细胞外囊泡(hSF-MSC-EVs)和红细胞外囊泡(hRBC-EVs)的蛋白，进行蛋白质组学高通量筛选，并利用Western blot验证两种不同细胞源性胞外囊泡蛋白表达水平的差异，结果发现CD63在hSF-MSCs源性胞外囊泡的表达水平显著高于hRBC-EVs，而SLC4A1在hRBC-EVs中的表达水平显著高于hSF-MSC-EVs（图8）。 summernote-img

图8.从MSCs和RBCs中得到的EVs的蛋白质组学比较和免疫印迹分析。（A）富集于RBC-EVs和MSC-EVs的细胞外囊泡标记物的表达；(B)皮尔逊相关系数分析以评估蛋白质定量的可重复性；(C)蛋白质组火山图显示RBC-EV和MSC-EV组之间差异表达的蛋白质；(D)热图分析：与MSC-EVs相比，RBC-EVs具有明显上调的膜蛋白；(E)RBC-EVs和MSC-EVs中SLC4A1和CD63蛋白表达水平的定量；(F)RBC-EVs中SLC4A1、CD63、CD9和CD81蛋白表达水平的定量；(G)RBC-EVs和MSC-EVs中SLC4A1、CD63和其他EV相关蛋白的典型免疫印迹带。

（2）人源SLC4A1蛋白表达及噬菌体肽库筛选

采用哺乳动物细胞表达串联表达SLC4A1两个胞外区的重复3次串联区域，C端添加6*His用于蛋白纯化，载体采用pATX2，表达纯化SLC4A1蛋白。经过噬菌体肽库3轮淘选，获得10个结合多肽阳性序列。从中选取OD值>1.0的三个序列进行合成。SLC4A1蛋白与荧光标记的合成多肽序列孵育，跑胶检测蛋白与多肽的结合能力（图9）。

图9.噬菌体肽库筛选人源SLC4A1蛋白的结合多肽。(A)技术路线；(B)噬菌体肽库筛选中前10个阳性单克隆抗体的ELISA验证结果；(C)统计肽段XRB2、XRE4和XRH7与SLC4A1-EC抗原的结合值。

（3）体外检测筛选阳性多肽与红细胞外囊泡(REVs)结合能力

为进一步测试多肽XRB2、XRE4和XRH7能否结合到RBC-EVs表面的SLC4A1蛋白质，项目团队将等量的TMR标记的XRB2、XRE4和XRH7肽与RBC-EVs在4摄氏度孵育6小时，然后将混合物转移到超滤管中，经过持续超滤去除未结合的肽。流式细胞术和荧光显微镜用于检测肽与RBC-EVs的结合。结果显示，TMR标记的XRB2、XRE4和XRH7肽能够结合到RBC-EVs，但XRE4和XRH7的结合阳性率高于XRB2。荧光结果表明，肽XRB2、XRE4和XRH7能够结合到RBC-EVs，但它们具有不同的结合能力（图10B）。此外，通过荧光法计算XRB2、XRE4和XRH7与RBCEVs或MSC-EVs的结合情况(图10E)。结果表明，RBC-EVs与肽的结合率显著高于MSC-EVs。此外，XRE4对RBC-EVs的结合比XRB2和XRH7更强（图10）。

图10.筛选的阳性锚定多肽与人RBC-EVs结合。(A)使用流式细胞术检测XRB2、XRE4和XRH7锚定肽与RBC-EVs的结合;(B)荧光显微镜图像显示TMR标记的肽与RBC-EVs结合。(E) &(F)流式分析检测锚定肽与MSC-EVs的结合情况。

（3）红细胞外囊泡靶向软骨基质递送系统（REVs-E4-PIGF-2)的构建和鉴定

利用Western blotting评价红细胞外囊泡靶向软骨基质递送系统（REVs-E4-PIGF-2)是否构建成功。REVs-E4-PIGF-2表达EVs的标记蛋白（图11）。对重要的几个水通道蛋白进行检测，发现红细胞外囊泡富集AQP1含量最高，提示AQP1在红细胞外囊泡具有特殊功能。

图11.红细胞外囊泡的鉴定。(A)经PIGF-2修饰的REVs-E4的蛋白标志物鉴定; (C) 红细胞外囊泡中几种重要水通道蛋白比较；（B）红细胞外囊泡的冷冻电镜检测。

（4）红细胞外囊泡靶向软骨基质递送系统（REVs-E4-PIGF-2)的靶向性检测，REVs-E4-PIGF-2递送siRNA MMP-13抑制软骨细胞MMP-13的表达（图12）

图12.工程化红细胞外囊泡的靶向性检测以及递送小核酸分子抑制软骨细胞MMP-13的表达。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

已具备的条件：

本项目依托于学校关节与运动康复工程实验室为团队独立实验平台，拥有 3 间科研实验室、1 个细胞培养室，万元以上仪器设备 50 余台（件）。拥有双向电泳仪、凝胶成像系统、荧光定量 PCR 仪、酶标仪、高速（低速）冷冻离心机等仪器设备，能够满足现代分子细胞生物研究的需要。学校及附属医院的实验平台总建筑面积约 2500 平方米, 包括项目所需的激光共聚焦显微镜、活细胞工作站、超高速冷冻离心机、纳米粒度及 zeta 电位分析仪、小动物 Micro-CT 及活体成像系统等大型设备。实验动物中心具备 SPF 动物饲养系统，能满足动物相关实验以及动物实验样品检测分析。

尚缺少的条件：

无

解决方法：

无

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	20000.00	发表论文版面和订购实验室动物及水凝胶等	20000.00	0.00
1. 业务费	6000.00	发表论文版面费	6000.00	0.00
（1）计算、分析、测试费	0.00	无	0.00	0.00
（2）能源动力费	0.00	无	0.00	0.00
（3）会议、差旅费	0.00	无	0.00	0.00
（4）文献检索费	0.00	无	0.00	0.00
（5）论文出版费	6000.00	发表论文版面费	6000.00	0.00
2. 仪器设备购置费	0.00	无	0.00	0.00
3. 实验装置试制费	0.00	无	0.00	0.00
4. 材料费	14000.00	订购实验室动物及外泌体平台制备等	14000.00	0.00

结束

大学生创新创业训练计划管理系统

创新创业管理系统

详情