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阿达木单抗在葡萄膜炎治疗中的作用及机制研究

申报人：任家慧 申报日期：2025-03-24

基本情况

2025创新项目
阿达木单抗在葡萄膜炎治疗中的作用及机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目旨在探讨阿达木单抗这一生物制剂在葡萄膜炎中的免疫调节作用，阐明其作用机制，为找到新的药物治疗靶点、开发生产安全有效且廉价的新的生物制剂提供思路。
无
(1) 济宁医学院附属医院, 院级, JYFY357942, 生物制剂在自身免疫性葡萄膜炎中的作用机制研究, 2023-9 至今, 100万元, 在研, 主持
(2) 中国博士后科学基金会, 国家级, 2024M761148,ISG15+单核细胞在Behcet病发生中的促炎作用及其机制研究，2024-11 至今, 8万元, 在研，主持
（3）山东省科学技术厅, 省级, SDCX-ZG-202400041, TNF-α抑制剂在 Behcet 病治疗中的作用机制研究, 2023-08 至今, 3万元, 在研, 主持
（4）山东省自然科学基金委, 省级, ZR2019PH093,干扰素调节因子DNA甲基化水平在Vogt-小柳原田综合征和Behcet病中的研究, 2019-07至2022-06, 5万元, 结题, 主持 
（1）项目选题与规划：导师凭借自身对眼科葡萄膜炎疾病多年的研究，协助学生对项目选题进行深入剖析。引导学生筛选出具有创新性与可行性的研究方向。在项目规划阶段，帮助学生梳理研究思路，制定详细且合理的研究方案，明确各阶段的研究目标、任务与时间节点，确保项目有条不紊地推进。
（2）项目成果指导：从数据的分析与呈现，到研究报告、学术论文的撰写，我将提供全面的指导。帮助学生掌握学术论文的写作规范与技巧，提高学生的科研写作能力，确保项目成果能够以高质量的形式呈现。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
任家慧 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 实验操作,文章撰写
邢婧怡 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 文献查阅
李婼溪 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 数据记录及分析
刘子嘉 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 文章撰写
朱金铭 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 实验操作

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
朱云云 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

通过本项研究以期阐明阿达木单抗在 Vogt-小柳原田综合征和 Behcet 病两种不同类型葡萄膜炎治疗中的作用机制，从巨噬细胞极化、CD4+T 调控层面揭示阿达木作用机制的同质性和异质性，有望为研发治疗不同性质葡萄膜炎的生物制剂寻找到重要靶分子。
1、探讨阿达木对巨噬细胞极化和功能的影响
以活动期Behcet 病和Vogt-小柳原田综合征患者作为研究对象，体外培养其CD14+单核细胞并诱导分化为巨噬细胞，同时给予阿达木处理，用流式细胞术检测巨噬细胞表面标志的表达，用qRT-PCR检测巨噬细胞中炎症因子mRNA的表达，用ELISA检测巨噬细胞培养上清中炎症因子分泌水平，以期确定出阿达木对两种葡萄膜炎患者巨噬细胞极化及功能影响。
2、探讨阿达木单抗对T细胞活化和分化的直接和间接作用
（1）以活动期Behcet 病和Vogt-小柳原田综合征患者作为研究对象，体外培养其CD4+T细胞，同时给予阿达木处理，用流式细胞术检测CD4+T细胞凋亡以及Th1、Th17和Treg细胞的频率，用qRT-PCR检测CD4+T中转录因子和炎症因子的表达水平，用ELISA检测CD4+T培养上清中炎症因子分泌水平，以期确定出阿达木对两种葡萄膜炎患者CD4+T活化和分化作用的异同。
（2）以活动期Behcet 病、Vogt-小柳原田综合征患者以及健康对照者作为研究对象，体外培养葡萄膜炎患者CD14+单核细胞并诱导分化为巨噬细胞，同时给予阿达木处理。分离健康对照者CD4+T细胞，与上述巨噬细胞共培养，用流式细胞术检测CD4+T细胞凋亡以及Th1、Th17和Treg细胞的频率，用qRT-PCR检测CD4+T细胞中转录因子和炎症因子的表达水平，用ELISA检测共培养上清中炎症因子分泌水平，以期确定出阿达木通过巨噬细胞对CD4+T活化和分化的间接作用。
3、揭示阿达木单抗对巨噬细胞影响的分子机制
以活动期Behcet 病和Vogt-小柳原田综合征患者作为研究对象，体外培养其CD14+单核细胞并诱导分化为巨噬细胞，同时给予阿达木处理，利用测序技术对阿达木处理的巨噬细胞进行转录组和蛋白组学测序并联合分析，寻找阿达木作用的主要靶分子和信号通路，并通过qRT-PCR方法验证靶分子表达情况。
1、Behcet病和Vogt-小柳原田综合征是我国最常见的两种高致盲性葡萄膜炎
葡萄膜炎是一类眼内炎症性疾病，临床上常表现为慢性或复发性，治疗棘手，是世界范围内重要的致盲眼病[1]。Behcet 病和Vogt-小柳原田综合征是我国最为常见的两种葡萄膜炎类型[2]，分别表现为全身多系统多器官受累的自身炎症性和自身免疫性疾病[3, 4]。杨培增教授曾对1214例（1892 只眼）葡萄膜炎患者的临床资料进行统计分析，发现盲目者有355眼（占患眼总数的18.76%），其中Behcet病和Vogt-小柳原田综合征所致者分别有128眼和78眼（占盲目眼总数的56.62%）。由此可见，Behcet病和Vogt-小柳原田综合征是我国常见且高致盲性的葡萄膜炎。
2、揭示阿达木单抗在葡萄膜炎治疗中的作用机制的临床意义
葡萄膜炎多数是非感染因素所致，一般认为是体内免疫系统调节和炎症机制之间的失衡。随着现代免疫学和分子生物学技术的发展，阿达木单抗( adalimumab，ADA) 等生物制剂逐渐成为非感染性葡萄膜炎治疗的新型药物[5, 6]。阿达木单抗是针对肿瘤坏死因子-α ( TNF-α) 的全人源化重组免疫 γ 球蛋白单克隆抗体，可特异性结合TNF-α 并阻断其与受体(TNFR-1、TNFR-2) 结合而发挥生物学效应。TNF-α 是一种促炎细胞因子，在炎症性疾病中，TNF-α主要由单核/巨噬细胞谱系产生，当然，其他免疫细胞如T细胞, B细胞和中性粒细胞等也可产生[7]。既往研究表明，TNF-α 与非感染性葡萄膜炎的发生、发展密切相关[8]。有研究发现，葡萄膜炎患者血清及房水中 TNF-α 水平均显著高于正常水平[9]，且将健康对照者巨噬细胞与Behcet 病患者血清共培养，发现患者血清能够促进巨噬细胞向M1方向的分化，而向M2方向的分化被抑制，并增强巨噬细胞的吞噬能力和促使Th1细胞分化的能力[10, 11]。虽然阿达木在治疗非感染性葡萄膜炎方面的有效性、持续性以及安全性已被初步证实，但其具体的作用机制还不完全清楚，阐明和揭示阿达木在葡萄膜炎治疗中的作用机制，将进一步提高我们对葡萄膜炎发病机制的认识，对我们为患者提供长期安全性及个体化用药方案以及预防不良反应的发生至关重要，同时也为开发新的生物制剂提供思路。
在前期的预实验中我们发现，阿达木可显著降低Behcet 病和Vogt-小柳原田综合征患者M1型巨噬细胞表面标志CD80 和HLA-DR的表达，减少CD80+CD86+M1型巨噬细胞的比例（预实验图1），以及炎症因子TNF-α, IL-1β和 IL-6的表达（预实验图2）。另外我们还发现，阿达木可通过葡萄膜炎患者M1型巨噬细胞显著降低CD4+T细胞中Th1和Th17的频率（预实验图3）。这些实验结果表明：葡萄膜炎患者体内巨噬细胞可能是阿达木作用的靶细胞，阿达木通过作用于固有免疫细胞巨噬细胞进而调控CD4+T细胞的分化，从而达到免疫调控的作用。
综上所述，我们提出本课题的假说：阿达木单抗可能通过调控葡萄膜炎患者固有免疫细胞巨噬细胞的极化和功能，影响适应性免疫细胞CD4+T细胞的分化和活化，进而发挥治疗作用。本项目通过研究阿达木单抗在葡萄膜炎治疗中的作用并探讨其作用机制，为深入全面理解葡萄膜炎的发病机制提供依据，以期为诊治该病提供更好的治疗靶点。
参考文献：
1. Goldstein, H., The reported demography and causes of blindness throughout the world. Adv Ophthalmol, 1980. 40: p. 1-99.
2. Yang, P., et al., Clinical patterns and characteristics of uveitis in a tertiary center for uveitis in China. Curr Eye Res, 2005. 30(11): p. 943-8.
3. Yang, P., et al., Clinical features of chinese patients with Behçet's disease. Ophthalmology, 2008. 115(2): p. 312-318.e4.
4. Yang, P., et al., Clinical characteristics of Vogt-Koyanagi-Harada syndrome in Chinese patients. Ophthalmology, 2007. 114(3): p. 606-14.
5. Dick, A.D., et al., Guidance on Noncorticosteroid Systemic Immunomodulatory Therapy in Noninfectious Uveitis: Fundamentals Of Care for UveitiS (FOCUS) Initiative. Ophthalmology, 2018. 125(5): p. 757-773.
6. Lee, J.T., et al., Adalimumab for the treatment of refractory active and inactive non-infectious uveitis. Br J Ophthalmol, 2018. 102(12): p. 1672-1678.
7. Bradley, J.R., TNF-mediated inflammatory disease. J Pathol, 2008. 214(2): p. 149-60.
8. Hale, S. and S. Lightman, Anti-TNF therapies in the management of acute and chronic uveitis. Cytokine, 2006. 33(4): p. 231-7.
9. Curnow, S.J., et al., Multiplex bead immunoassay analysis of aqueous humor reveals distinct cytokine profiles in uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2005. 46(11): p. 4251-9.
10. Alpsoy, E., et al., Serum of patients with Behçet's disease induces classical (pro-inflammatory) activation of human macrophages in vitro. Dermatology, 2003. 206(3): p. 225-32.
11. Wu, X., et al., Macrophage polarization toward M1 phenotype through NF-κB signaling in patients with Behçet's disease. Arthritis Res Ther, 2022. 24(1): p. 249.
1、研究的系统性：目前关于葡萄膜炎发病机制的研究多集中于单个分子功能层面，导致人们在认识葡萄膜炎发病机制时缺乏系统性。本项目以阿达木单抗治疗为出发点，系统的阐述阿达木单抗通过调控巨噬细胞功能进而影响CD4+T细胞分化的分子机制。本项目将从基因、蛋白、细胞功能层面较为系统、全面地探讨葡萄膜炎发病机制以及抗TNF-α治疗的关键分子及其机制。
2、临床意义显著性：葡萄膜炎的治疗一直是临床研究想要攻克的难点，虽然传统的免疫抑制剂治疗对大多数病人有效，但仍有部分病人病情不能很好的控制或者不能耐受药物的副作用。近年来，生物制剂越来越多的应用于自身免疫性疾病的治疗中，但很多新药在葡萄膜炎中的临床效果欠佳。因此，全面探讨阿达木单抗在葡萄膜炎治疗中的作用机制，找到新的药物作用靶点，开发安全有效的生物制剂对指导葡萄膜炎患者的精准治疗意义重大。
技术路线
1、探讨阿达木对巨噬细胞极化及功能的影响
研究对象：活动期Vogt-小柳原田综合征患者、活动期Behcet病患者，健康对照者。
研究方法：用抗CD14+磁珠分选活动期 Behcet 病和Vogt-小柳原田综合征患者的CD14+单核细胞，体外培养6天并加入M-CSF诱导分化为M0巨噬细胞，继续加入IFN-γ或者M-CSF和IL-4诱导分化为M1和M2巨噬细胞，同时与阿达木（10μg/ml）共培养24小时，空白对照组给予等体积PBS处理，并进行以下研究： 通过流式细胞术评价阿达木分别对M1、M2型巨噬细胞表面CD80/CD86/HLA-DR和CD206/CD163表达的影响；通过qRT-PCR和ELISA技术评价阿达木分别对M1、M2型巨噬细胞炎症因子TNF-α/IL-1β/IL-6/IL-12和IL-10的mRNA 表达及分泌的影响。通过上述实验评价阿达木单抗对巨噬细胞极化和活化功能的影响，探讨阿达木对巨噬细胞功能影响的作用机制。
技术路线：
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2、探讨阿达木对T细胞活化和分化的直接和间接影响
研究对象：活动期Vogt-小柳原田综合征患者、活动期Behcet病患者（患者诊断和纳入标准同前），健康对照者。
研究方法：用抗CD4+磁珠 分选活动期Behcet 病和Vogt-小柳原田综合征患者的CD4+T细胞，并进行以下两方面研究：I. 通过qRT-PCR、ELISA和流式细胞术等技术评价阿达木对CD4+T 细胞的 T-bet（Th1 细胞转录因子）、ROR-γt（Th17 细胞转录因子）和 FOXP3（Treg 细胞转录因子）mRNA 表达，IFN-γ、IL-17 和 IL-10 产生，CD4+T 细胞的 凋亡以及 Th1、Th17 和 Treg 细胞活化及分化的影响；II.将给予阿达木处理后的巨噬细胞分别与健康对照者 CD4+T 细胞进行共培养，通过上述实验评价阿达木通过巨噬细胞对 Th1、Th17 和 Treg细胞活化及分化的间接影响。
技术路线：
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拟解决的关键科学问题：
本项目通过探讨阿达木单抗对 Vogt-小柳原田综合征和 Behcet 病两种不同性质葡萄膜炎患者巨噬细胞和CD4+T 细胞功能的调控作用，以期揭示两种葡萄膜炎的发病机制的异同以及阿达木在这两种类型葡萄膜炎治疗中的作用机制，为患者的精准个体化治疗提供依据。
预期研究结果：
（1）明确阿达木对葡萄膜炎患者巨噬细胞和CD4+T细胞的调控作用。
（2）阐明阿达木对葡萄膜炎患者免疫调节作用的机制。
（3）课题的成果形式主要为论文：发表高水平论文1-2篇。
年度研究计划：
2025.09-2026.09
（1）收集活动期Vogt-小柳原田综合征和Behcet病患者样本，检测。
（2）将收集到的PBMC样本进行单细胞转录组联合TCR测序，筛选TNF-α信号通路相关的靶细胞、差异信号通路及候选关键基因，并验证测序得到的候选关键基因。
2026.09-2027.08
（1）继续收集活动期Vogt-小柳原田综合征和Behcet病患者样本，同时收集正常对照者样本，基于上述测序结果，评价阿达木单抗对巨噬细胞和CD4+T细胞功能的影响。
（2）在EAU小鼠模型中进行体内实验，评价阿达木单抗及关键候选基因对 EAU 发生及炎症程度、巨噬细胞极化、Th1、Th17 和 Treg 细胞活化及分化的影响。
（3）总结实验结果，撰写学术论文。
1.1阿达木对巨噬细胞功能的影响
为了探讨阿达木对葡萄膜炎患者巨噬细胞功能的影响，我们收集了活动期Vogt-小柳原田综合征和Behcet 病患者各8例，分离其外周血CD14+单核细胞进行体外培养，并诱导分化为M1和M2型巨噬细胞，同时给予阿达木（10μg/ml）处理24小时，将处理后的细胞和上清收集并进行以下实验。首先，我们用流式细胞术检测了M1型巨噬细胞表面CD80, CD86和 HLA-DR的表达以及M2型巨噬细胞表面CD163和CD206的表达，结果显示阿达木可显著降低M1型巨噬细胞表面CD80和 HLA-DR的表达，并下调CD80+CD86+ M1型巨噬细胞的比例（图1），而对M2型巨噬细胞表面标志物的表达无明显作用。其次，我们用qRT-PCR的方法检测了Vogt-小柳原田综合征患者M1型巨噬细胞中炎症因子TNF-α, IL-1β, IL-6和 IL-10的表达，结果显示阿达木可显著降低M1型巨噬细胞TNF-α, IL-1β和 IL-6的表达（图2），而对IL-10的表达无明显影响。
综上所述，我们的实验结果显示阿达木可显著下调M1型巨噬细胞表面标志物的表达以及炎症因子的分泌，而对M2型巨噬细胞功能无明显影响。这一结果提示M1型巨噬细胞在阿达木治疗葡萄膜炎过程中发挥重要作用。
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图1. 阿达木显著下调M1型巨噬细胞表面标志物的表达
A和B. 阿达木显著下调Vogt-小柳原田综合征患者M1型巨噬细胞表面CD80和HLA-DR的平均荧光强度。C. 阿达木显著降低Vogt-小柳原田综合征患者CD80+CD86+ M1型巨噬细胞的比例。D和E. 阿达木显著下调Behcet 病患者M1型巨噬细胞表面CD80和HLA-DR的平均荧光强度。F. 阿达木显著降低Behcet 病患者CD80+CD86+ M1型巨噬细胞的比例。 （MIF：平均荧光强度，NC：阴性对照，ADA：阿达木单抗。）
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图2. 阿达木显著下调M1型巨噬细胞炎症因子的表达
A，B和C. 阿达木显著下调Vogt-小柳原田综合征患者M1型巨噬细胞中TNF-α, IL-1β和 IL-6的表达。（NC：阴性对照，ADA：阿达木单抗。）
1.2阿达木通过固有免疫细胞巨噬细胞对CD4+T细胞分化的影响
为了探讨阿达木是否会通过M1型巨噬细胞影响CD4+T细胞分化，我们将阿达木处理和未处理的M1型巨噬细胞（来自活动期Vogt-小柳原田综合征患者）分别与健康对照者CD4+T细胞共培养，流式细胞术检测 Th1/Th17/Treg 细胞频率，结果显示阿达木处理的M1型巨噬细胞显著降低了CD4+T细胞中Th1和Th17细胞频率（图3），而对 Treg 细胞无明显作用。
以上结果提示我们，阿达木可能通过固有免疫细胞作用于适应性免疫细胞，进而发挥其免疫调节作用。
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图3. 阿达木处理的M1型巨噬细胞下调Th1和Th17细胞比例
A. 流式细胞术检测共培养CD4+T细胞中IFN-γ+和IL-17+ 细胞频率的代表图。B和C. 用流式细胞术检测共培养CD4+T细胞中IFN-γ+ (B)和IL-17+ (C)细胞的频率。（ADA：阿达木单抗。）

平台已拥有此项研究所需要的基本仪器设备和实验条件，拥有独立的细胞培养室、动物操作间等实验平台，拥有质谱仪、PCR仪、荧光定量PCR仪、流式分析仪、小动物活体成像仪、凝胶成像仪、激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜、电转仪、酶标仪等常规设备。课题组成员已经熟练掌握了遗传学、分子生物、免疫学实验技术以及生物信息学分析方法，从实验设施和实验技术层面为本项目顺利开展提供了重要保障。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 5000.00 无 2500.00 2500.00
1. 业务费 2000.00 无 1000.00 1000.00
（1）计算、分析、测试费 1000.00 PCR引物、肽段等试剂的合成和测试。 500.00 500.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 200.00 外出参会和学习。 100.00 100.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 800.00 文章出版版面费。 400.00 400.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 3000.00 用于购抗体、试剂盒、EP管、PCR管等试剂、耗材。 1500.00 1500.00
结束

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