济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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vIL-10调控肿瘤微环境在肿瘤发展中的作用机制研究

申报人：管思源 申报日期：2025-03-23

基本情况

2025创新项目
vIL-10调控肿瘤微环境在肿瘤发展中的作用机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生自主选题
二年期
本项目聚焦“vIL-10调控肿瘤微环境在肿瘤发展中的作用机制研究”。由于EB病毒编码的vIL-10与肿瘤关系密切，但它的作用机制不明，所以本研究将探讨vIL-10在肿瘤中的作用机理。本组将构建vIL-10基因表达载体，后在大肠杆菌中表达并纯化后得到vIL-10蛋白；利用多种技术进行体外细胞实验探究vIL-10对不同肿瘤细胞的影响；借助构建荷瘤小鼠模型分析vIL-10对于肿瘤生长、免疫细胞功能和肿瘤微环境的影响。本项目创新点突出，主要体现在创新性构建表达载体获纯净vIL-10蛋白，同时首次深入剖析了vIL-10调控肿瘤细胞增殖的能力，有望揭示肿瘤免疫逃逸新机制，为临床治疗提供理论与靶点。
曾参与济宁医学院病原微生物实验室一系列实验课题，掌握生物工程相关实验操作包括细胞的培养及细胞转染等，能够使用Western Blot、ELISA、免疫荧光、免疫组化等技术验证实验猜想。
现主持山东省自然基金重点项目、省自然科学基金面上项目、省高等学校科技计划项目多项，各项科研资金总计30余万元。
指导教师申请的“预防疾病，护佑健康－重组疫苗研究与开发工作坊”已获得学校立项，本申请已获得指导教师的⽀持与指导。 
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
管思源 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 细胞实验
宋姝颖 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 统计学分析
蒋文琪 精神卫生学院 精神医学（本科） 2022 动物实验
刘镇源 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 论文撰写
张安涛 临床医学院（附属医院） 儿科学（本科） 2024 动物实验
陈彦妤 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 细胞实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
薛庆节 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

  本研究将构建EB病毒vIL-10基因的表达载体，使其在大肠杆菌中表达。后利用多种技术进行体外细胞实验，探究vIL-10对不同肿瘤细胞的影响。将纯化后的vIL-10蛋白注射进小鼠肿瘤微环境中，系统分析动物模型中肿瘤生长情况、免疫细胞浸润状态及微环境变化等指标，推测vIL-10在肿瘤环境中发挥的作用。从而为预防EB病毒感染及其肿瘤的发生，以及测定vIL-10在人体肿瘤环境中所发挥的作用及其作用机制奠定基础。
1 vIL-10蛋白的获得（已完成）
1.1 构建重组质粒vIL-10-pGEX-4T-1
  提取人鼻咽癌细胞NPRC18的组DNA，同时根据vIL-10的基因序列设计实验所需引物，后进行目的基因的PCR扩增并纯化回收PCR产物。选择含有Ampr抗性编码基因、GST标签蛋白编码基因等元件的表达载体pGEX-4T-1，以方便进行后续的筛选及鉴定。将经过 EcoRⅠ、Sal Ⅰ双酶切后的pGEX-4T-1 与目的基因用T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒并命名为vIL-10-pGEX-4T-1。
1.2 vIL-10-pGEX-4T-1的鉴定和留菌
  使用化学转化法将重组质粒vIL-10-pGEX-4T-1转入感受态细胞E.coli.DH5α中，利用Ampr抗性来筛选阳性菌株，将从阳性菌株中提取的质粒用PCR扩增、双酶切及DNA测序的方法鉴定该菌株内含有重组质，测序成功的质粒即为vIL-10-pGEX-4T-1。将该质粒和空载质粒分别转化到E.Coil.DE3中后进行培养，将细胞培养到一定浓度时进行氨苄抗性平板涂布，一段时间后挑取阳性菌落，扩大培养并储存备用。
1.3 vIL-10的诱导表达和SDS-PAGE 分析
  将转化后的E.Coil.DE3菌液在摇床内培养至OD600 =0.8 时，加入IPTG来诱导重组基因的表达。二者离心并用PBS洗涤后加入适量裂解液、PMSF、溶菌酶、ddH2O 进行冰浴超声波破碎进而获得细胞破碎液，细胞破碎液低温离心后加入ddH2O重悬离心后，将上清移至另一EP管中。向清液和沉淀中分别加入上样缓冲液混匀后高温加热至完全变性，后进行SDS-PAGE分析和Western Blot实验来检测重组基因的表达情况。
1.4 vIL-10 蛋白的亲和层析纯化
  培养含有重组质粒的E.Coil.DE3菌液，以含空质粒的E.Coil.DE3为对照，培养和提取蛋白方法同 1.3 。将GST标签蛋白纯化试剂和上清液混匀后低温离心,弃清液，加入裂解液混匀后离心，重复该操作两次。将蛋白上清液与凝胶混匀，摇床培养。将混合液装入配套的纯化柱，使上清液缓慢流出，进行两次裂解液洗柱。加入1×GSH 以洗脱 vIL-10 ,并重复一次，每次均收集液体。将收集液进行 SDS-PAGE分析和 WB实验,方法同 1.3。收集剩余洗脱液体备用。
1.5 vIL-10 蛋白的切割、透析、浓缩
  将含有 vIL-10 的洗脱液装入透析袋，置于足量缓冲液中，过夜；向其中加入适量凝血酶，低温过夜；收集透析袋内液体与GST标签蛋白纯化试剂混匀，低温摇床培养后离心,收集上清，此时获得的上清中含有切掉 GST 标签的 vIL-10。再次将上清装入透析袋，置于足量的 PBS 缓冲液中，低温过夜。取出透析袋包埋于大量蔗糖中除水浓缩,收集溶液，测定蛋白浓度后-20℃保存。
2 体外细胞实验
2.1 MC38 细胞的复苏与培养
  将液氮储存的MC38细胞迅速放入37℃水浴锅中水浴融化，然后低温离心5 min并弃上清液。用 1mL 1640 完全培养液重悬细胞，沉淀后将混匀液移至含 10mL 1640 完全培养液的细胞培养皿中，并放入细胞培养箱（37℃，5% CO2）中培养。当细胞铺满皿底面积 90% 时，取出培养皿并倒掉原培养液。用PBS清洗皿底后用 1mL 0.25%胰酶处理细胞，当细胞几乎完全脱落时加入2mL 培养液混匀，使细胞完全脱落。将细胞悬液移至离心管中离心（1000r/min，5min）并弃上清。向其中加入1.2mL培养液重悬细胞，后均分至3个含有 10mL 培养液的培养皿中，并在细胞培养箱中培养。
2.2 MFC细胞的复苏与培养
  与MC38细胞的复苏与培养操作类似，仅需将培养液换成 DMEM 完全培养液。
2.3 vIL-10对EB病毒阴性肿瘤细胞和EB病毒阳性肿瘤细胞的影响
  将EB病毒阳性肿瘤细胞和阴性肿瘤细胞，分为4组，分别为PBS对照组1(EB病毒阴性肿瘤细胞)、vIL-10 组1(EB病毒阴性肿瘤细胞); PBS对照组2(EB病毒阳性肿瘤细胞)、vIL-10 组2(EB病毒阳性肿瘤细胞);将不同浓度的vIL-10(0,1,5,10,20,50ng/ml)分别作用于实验组并培养。
2.3.1 Transwell小室实验
  将CD4+T细胞培养在Corning Costar公司的24孔Transwell板的下层，再培养了24、48、72h的EBV阴性和阳性的癌细胞系（CNE-1和C666-1）移入上层后再培养3天。通过ELISA试剂盒测定CD4+T细胞悬浮液中vIL-10和IL-6的浓度并用流式细胞术检测CD4+T中CD25+CD4+Treg的比率。
2.3.2 CCK-8 实验
  待细胞长至 4×106~6×106个/mL 时，按照1×106个/mL 的接种密度传代（摇床条件：125 r/min ，37 ℃ , 5% CO2 ；摇瓶：125 mL 一次性摇瓶）。选取至少培养至 59 代的 MDCK-siat7e 细胞，当细胞存活率≥97%后，将细胞从摇瓶中转移离心（相对离心力（RCF）=233,5min）获得细胞沉淀。使用 0.7%生理盐水重悬细胞，按照溶液终浓度 75%加入无水乙醇，室温静置 5 min 杀死并固定细胞，将沉淀用培养基充分重悬，获得死细胞悬液。取与 2%台盼蓝溶液等体积的悬液共同加入离心管，混匀后获得待测混合液。将混合液加入全自动细胞分析仪专用的计数板中，选定参数，从而获得细胞密度与存活率结果。离心（RCF=233,5min）活得沉淀，后向沉淀中加入2mL 培养反应环境溶液，将沉淀充分重悬，进行细胞计数，依据悬液的细胞密度加入一定体积的CCK-8 溶液后移于 Edge-6 孔培养板，充分混匀并培养一定时间获得培养反应液。对培养反应液离心（RCF=233,5 min），将上清液加入 96 孔板，测定指定波长下的 A 值，此 A 值为细胞活力的表征。（整个过程需无菌操作）
2.4 流式细胞仪检测vIL-10作用后的细胞凋亡率

分组
药物浓度（ng/ml）
空白组 0
vIL-10组 1

  处理24h后，收集各组细胞于流式管内，在6℃条件下预冷，然后使用磷酸缓冲溶液清洗两次，调整细胞的终浓度为3*105个/m1，离心；用400µl的Annexin V结合液使细胞重悬后加入5µL Annexin V-FITC染色液并混匀，于4℃冰箱避光静置15 min；加入10µl碘化丙碇(PI)染色液，轻轻混匀后，于4℃冰箱避光静置5min；使用流式细胞仪检测（激发波长为488nm，Annexin V-FITC和PI的发射波长分别为525nm和630nm）凋亡细胞数量和细胞总数量，后计算细胞凋亡率。（细胞凋亡率(%)=(早晚期调亡细胞数之和/总细胞数)×100%）
2.5 ELISA 检测细胞培养上清中的细胞因子 IFN-γ、TNF-α的分泌
  将冻干的标准品按照说明书溶解，并用稀释液稀释至推荐浓度。后将标准品和样品加入预先包被有抗小鼠IFN-γ（TNF-α）抗体的微孔板中，每个样品和标准品都应适量加入以保证实验的准确性。将加好样的酶标板放入37℃恒温箱中温育一段时间，保证抗体与抗原充分结合。用洗涤液洗去未结合的成份，去除酶标板中未固定的样品和标准品。加入生物素标记的抗小鼠IFN-γ（TNF-α）抗体，并再次温育，使其与IFN-γ（TNF-α）结合；随后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素；当链霉亲和素与生物素化的抗体结合后加入显色底物TMB（若反应孔中有小鼠IFN-γ（TNF-α）存在，HRP会使无色的TMB变成蓝色），然后加入终止液。用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度（OD值）。
3 动物实验
  本实验已通过济宁医学院实验动物伦理委员会审查（编号：JNMC-2025-DW-056）。
3.1 EB病毒阳性肿瘤细胞和EB病毒阴性肿瘤细胞构建荷瘤小鼠动物模型的构建
  分别收集对数生长期EB病毒阳性和阴性肿瘤细胞，无菌条件下接种在IL-10-KO荷瘤小鼠雌性小鼠背部右侧皮下；若接种后长出直径达约3-5mm的肿瘤即可作为实验动物。将实验动物分为4组，每组6只，空白对照组小鼠给予生理盐水腹腔注射，vIL-10组小鼠给予vIL-10 50µg/kg肿瘤部位皮下注射，每三天给药一次。每周观察4次,注意其肿瘤大小、状态、毛色、饮食、体重等变化。测量肿瘤长径(X)和短径(Y),计算肿瘤体积V=(X*Y2)/2，实验结束后处死小鼠，尽可能完整的取下肿瘤，将肿瘤除血污、脂肪，测定和记录各种数据；
3.2 vIL-10对IL-10-KO小鼠肿瘤模型体内CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、NK细胞、Tregs细胞、骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)的影响
3.2.1 淋巴细胞的分离
  末次注射两周后，取小鼠眼球血至肝素抗凝管，并分离小鼠脾脏。眼球血静置15 min后离心（4℃ 3500 rpm，15 min），将上层血浆转移至新离心管中，向沉淀中加入1 mL红细胞裂解液混匀，后转移至15 mL离心管中。加入4 mL红细胞裂解液混匀，静置5 min，加入8 mL PBS混匀后离心（1500 rpm，5 min）并去上清；重复上一步骤，直至红细胞裂解完全。将脾脏置于PBS中研磨，研磨后将所有细胞转移至离心管中，离心（1500 rpm，5 min）并去上清；加入3 mL红细胞裂解液混匀，静置5 min，加入10 mL PBS后离心（1500 rpm，5 min）并去上清；重复上一步骤，直至红细胞裂解完全。将红细胞裂解完全的血淋巴细胞液和脾淋巴细胞液通过滤膜进行过滤，得到血淋巴细胞和脾淋巴细胞。
3.2.2 肿瘤组织的HE染色
  首先用10%中性福尔马林对肿瘤样本进行固定24小时后使用由低浓度到高浓度的酒精进行脱水，然后用二甲苯进行透明处理。随后将组织块置于熔化的石蜡中，冷却后包埋；将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，厚度为5微米，然后将切片贴到载玻片上。用二甲苯将切片中的石蜡去除并将切片依次置于不同浓度的乙醇中，后用蒸馏水处理，最后将切片放入苏木精染液中染色数分钟。使用1%盐酸酒精分化液进行分化后，用弱碱性溶液将细胞核染成蓝色，用伊红染液对细胞质进行染色。染色后的切片经过不同浓度的乙醇脱水后用二甲苯透明，并用中性树胶将切片封固，盖上盖玻片，最后在显微镜下观察并记录。
3.2.3 肿瘤组织的免疫荧光染色
  用5%山羊血清或其他封闭液将样本完全覆盖，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30分钟。去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，IL-17、CD19、CD138、RORγt、CD4、CD25抗体染色后，切片需放置于湿盒内，置于4℃孵育过夜。将样本置于常温，复温15分钟，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟后用缓冲液TBS洗涤2次，每次5分钟。在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时。去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟后用缓冲液TBS洗涤2次，每次5分钟。在样本上滴加1 µg/mL DAPI工作液后避光，室温孵育30分钟。滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像。
3.2.4 Percoll密度梯度离心分离T细胞
  将肿瘤放置于1.5mL的EP管内，加入胶原酶、DNA酶，用剪刀剪碎，然后用200目滤网过滤后，低温离心8 min获得细胞。用PBS 洗涤后离心10 min后用PBS重悬，进行44% Percoll密度梯度离心，调整细胞浓度为1×107/L。 当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后进行流式分析。
3.2.5 T细胞的流式分析
  用PE标记兔抗鼠CD8抗体、FITC标记兔抗鼠CD4抗体，APC标记兔抗鼠CD3抗体，V450标记兔抗鼠CD3抗体，流式细胞仪分析小鼠肿瘤中CD3+CD45+CD8＋T、CD3+CD45+CD4＋T淋巴细胞、血液中的CD3+CD8＋T、CD3+CD4＋T淋巴细胞和脾脏中的CD3+CD8＋T、CD3+CD4＋T淋巴细胞。
3.2.6 胞内细胞因子的流式分析
  对于胞内细胞因子染色，经细胞表面分子染色后，进行固定及穿膜，再加入相应细胞内抗体染色，同时设不加抗体、单独加二抗不加一抗及同型对照抗体作为对照组，用流式细胞检测仪检测，并应用 FACS Diva 软件进行获取，FlowJo 软件分析。
3.2.7 vIL-10对脾淋巴细胞的体外刺激
  从每组脾淋巴细胞中随机取3只小鼠的脾淋巴细胞，离心（1500 rpm，5 min），加入1 ml 1640完全培养基洗涤后离心并弃上清，向其中加入1 ml培养液混匀后定量分3份至48孔板，并用1640完全培养基调整体积为1 ml。PBS组均加入100 µl PBS，BCG组分别加入100 µl的PBS、100 µl 1ng/ml vIL-10和100 µl 5ng/ml vIL-10，放入CO2培养箱培养48 h。
3.2.8 流式细胞分析vIL-10刺激脾淋巴细胞后T细胞内因子检测
  收集脾淋巴细胞离心（1500 rpm，5min）弃上清，加1ml1640完全培养基、0.2 µlPMA、2µl离子霉素和1µl莫能霉素混匀，37℃培养4-6h。将培养液离心（1500 rpm，5 min）弃上清，加1 ml PBS洗涤后离心5 min，弃上清。再加入100 µl PBS混匀，分别加入0.25 µl小鼠CD4流式抗体（FITC）和小鼠CD8流式抗体（APC）混匀，4℃避光孵育30 min。加1 ml PBS洗涤，离心（1500 rpm，5 min）弃上清，再加入PBS混匀，离心（1500 rpm，5 min）去上清。向其中加入800 µl IC Fixation Buffer混匀，4℃避光孵育30 min，离心（1500 rpm，5 min）后加入1 ml PBS洗涤，离心并弃上清。再加1 ml 1×Permeabilization Buffer混匀，离心并弃上清，加100 µl 1×Permeabilization Buffer混匀，分别加入0.25 µl小鼠IFN-γ流式抗体（PE）和小鼠TNF-α流式抗体（V450）混匀，4℃避光孵育过夜。第二天加1 ml PBS洗涤，离心（1500 rpm，5 min）弃上清后加200 µl PBS重悬细胞，过滤后使用流式细胞仪进行检测。
4.1 国外研究现状和发展动态
4.1.2 生物学特性研究
  国外研究发现EB病毒基因组编码的vIL-10在结构上与IL-10具有一定的相似性，但对其胸腺细胞和T细胞的作用存在差异，例如其抑制T细胞增殖和促炎因子分泌的能力更强。同时vIL-10可通过阻断树突状细胞成熟，抑制Th1型免疫反应，促进病毒持续性感染的能力。
4.1.3 器官移植与基因治疗
  由于 vIL-10 的免疫抑制特性，国外研究重点关注其在器官移植中的抗排斥能力。但在移植模型中，高水平表达 vIL-10 的移植物并不一定能延长移植物的存活时间。例如，将转基因小鼠（vIL-10 Tg）的心脏作为血管化同种异体移植物移植到未修饰的主要组织相容性复合体（MHC）完全不匹配或 MHC II 类不同的小鼠中，结果发现 vIL-10 Tg 小鼠的心脏移植物未能显示出延长的存活时间，在 MHC II 类不同的小鼠中，vIL-10 Tg 心脏移植物甚至出现了严重的 CD8 T 细胞浸润，以及干扰素 γ mRNA 表达增加的情况。
4.2 国内研究现状和发展动态
4.2.1 基础机制研究
  国内研究团队发现EB病毒编码的vIL-10可通过下调鼻咽癌细胞中TAP-1基因表达，抑制抗原呈递，从而逃避免疫清除。此外，vIL-10信号肽区域的基因多态性可能与鼻咽癌的易感性相关。同时，国内团队系统综述了21种病毒编码的vIL-10基因特征，发现其与宿主IL-10同源性高，但信号肽区域存在特异性突变，可能影响蛋白质分泌效率。
4.2.2 临床应用探索
1)组织工程皮肤移植：通过将vIL-10基因转染至成纤维细胞构建组织工程化皮肤，初步证实其可延长同种异体移植物的存活时间，为解决皮肤种子细胞来源和免疫排斥问题提供新思路。
2)肿瘤免疫逃逸研究：在鼻咽癌、EBV相关胃癌中，vIL-10的变异型分布与健康人群存在差异，提示其在肿瘤微环境中的免疫调控作用。
4.3 国内外的未来研究方向
3)精准调控vIL-10功能：针对其信号肽和受体结合区域的基因变异，开发特异性抑制剂或基因编辑工具。
4)联合治疗策略：将vIL-10的免疫抑制特性与新型免疫检查点抑制剂结合，用于肿瘤或自身免疫性疾病治疗。
5)临床转化验证：推动vIL-10相关基因疗法在皮肤移植、器官移植等领域的临床试验，验证长期安全性和疗效。

参考文献：
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本研究主要创新点:
  1. 研究方法创新：创造性构建 EB 病毒 vIL-10 基因表达载体并在大肠杆菌中表达，获取的 vIL-10 相较于从 EB 病毒中提取的更为纯净，有效减少杂质干扰，使实验结果更精准可靠，为验证实验猜想提供坚实基础，在 vIL-10 获取途径上实现创新突破。
  2. 机制探索创新：首次深入探究 vIL-10 调控肿瘤细胞增殖的生物学功能机制，发现其可通过影响机体免疫促进肿瘤增殖和生长，揭示了 vIL-10 与肿瘤免疫之间的全新关联，为肿瘤免疫机制研究开辟新方向。
  3. 理论认知创新：研究成果有助于深入揭示 EB 病毒阳性肿瘤免疫逃逸机制，突破现有认知局限，为理解肿瘤发生发展过程提供新视角和理论依据，丰富了肿瘤学领域的理论体系。
  4. 潜在应用创新：发现 vIL-10 作为危险相关信号分子在 EB 病毒阳性肿瘤组织中广泛表达和分泌，这一发现可能为临床 EB 病毒感染及肿瘤治疗提供极具价值的小分子治疗靶点，为开发新型治疗策略提供创新思路。
  5. 多维度综合研究视角创新：本项目突破单一研究维度的局限，将体外细胞实验、动物实验以及基因和蛋白层面的分析相结合。整合多种先进技术，如基因测序技术、Western-blot技术、转录组测序技术（RNA-seq）以及蛋白质质谱技术等，从不同层面系统分析vIL-10对肿瘤的影响。通过这些技术的联合应用，能够更全面、深入地揭示vIL-10在肿瘤发生发展过程中的分子机制，为深入了解肿瘤微环境提供有力的技术支撑，这在vIL-10相关研究中是技术运用上的创新之举。
  6. 实验模型创新：选用IL-10-KO小鼠构建荷瘤小鼠模型，有效消除IL-10在活体组织中的影响，避免内源性IL-10对实验结果的干扰，使vIL-10在肿瘤微环境中的作用能够更清晰地展现出来，为研究vIL-10在肿瘤发展中的作用机制提供了更精准的动物模型，有助于获得更准确、可靠的实验数据。
  7. 成果转化创新：预期成果不仅聚焦于学术研究层面，还注重向临床应用的转化。通过揭示vIL-10在肿瘤发生发展中的作用机制，有望为临床EB病毒感染及肿瘤治疗提供切实可行的小分子治疗靶点，直接服务于临床治疗，缩短从基础研究到临床应用的转化周期，为肿瘤治疗带来新的希望和突破。
5.1 技术路线
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5.2 拟解决问题
(1)vIL-10对EB病毒阳性和阴性鼻咽癌细胞及MC38肿瘤细胞及MFC肿瘤细胞的影响；
(2)利用IL-10-KO小鼠以消除IL-10在活体组织中的影响；
(3)利用基因测序技术、Western-blot技术、转录组测序技术（RNA-seq）以及蛋白质质谱技术分析vIL-10对肿瘤的影响及其机制。
5.3预期成果
(1)2.3结果预测：采用 ELISA 试剂盒检测显示，CD4+T 细胞悬液中 vIL-10和 IL-6浓度显著升高；流式细胞术检测结果表明，CD4+T 细胞中 CD25+CD4 + 调节性 T 细胞的比例显著增加；细胞浓度及存活率均显著升高。
(2)2.4结果预测：经 vIL-10 处理的细胞凋亡率显著降低。
(3)2.5结果预测：细胞培养上清液中 IFN-γ和 TNF-α的分泌量显著增加，对应 OD 值明显升高。
(4)3.2.2结果预测：HE 染色结果显示肿瘤组织中可见明显的血管生成现象，且肿瘤细胞呈现侵袭性生长特征，提示存在潜在转移倾向；免疫荧光染色结果显示，IL-17、CD19、CD138、RORγt、CD4 及 CD25 抗体标记的荧光信号均清晰可辨 。
(5)3.2.5结果预测：CD3+CD45+CD8+T 细胞、CD3+CD45+CD4+T 细胞数量低于正常对照组；CD3+CD8+T 细胞细胞数量显著低于正常水平。
(6)3.2.7结果预测：流式细胞术分析证实，vIL-10 刺激后脾淋巴细胞中 T 细胞内细胞因子IFN-γ和 TNF-α的分泌量有明显变化。
6.1 2024年9月 - 2024年12月：项目启动与基础研究
（一）初步免疫学实验
  将vIL-10分别注射到IL-10-KO和野生鼠C57BL/6体内，一段时间后，无菌分离小鼠脾脏和血液。运用流式细胞术精确检测CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞在小鼠体内的数量变化；采用ELISA试剂盒定量分析免疫小鼠脾脏细胞产生的特异性细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-10等，以及IFN-γ的分泌水平，初步探究vIL-10对小鼠免疫系统的影响。
（二）鼻咽癌组织研究
  收集鼻咽癌患者组织样本，运用免疫组化技术检测vIL-10基因在鼻咽癌组织中的表达定位和表达量；采用qPCR技术从mRNA水平定量分析vIL-10的表达情况。同时，将不同浓度vIL-10作用于EB病毒阴性鼻咽癌细胞，利用CCK-8实验检测细胞增殖活性，通过Transwell小室实验评估细胞迁移能力，初步探究vIL-10对EB病毒阴性鼻咽癌细胞的影响。
6.2 2025年1月 - 2025年12月：深入细胞与动物实验研究
（一）细胞实验拓展
  使用流式细胞仪全面分析纯化后的vIL-10作用于EB病毒阴性鼻咽癌细胞后，细胞周期分布、细胞凋亡率以及细胞表面标志物表达的变化。运用Transwell小室实验，设置不同时间点和vIL-10浓度梯度，检测细胞迁移和侵袭能力的动态变化，并设置阴性和阳性对照组确保实验准确性。同时，将研究范围拓展至EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901、BGC823、HGC27）和EBV阳性胃癌细胞系（GT38、GT39、SNU719），重复上述实验，对比不同细胞系对vIL-10的反应差异，深入探究vIL-10对肿瘤细胞生物学行为的影响机制。
（二）荷瘤小鼠模型构建与实验
  将EB病毒阳性和阴性鼻咽癌细胞CNE-2分别接种至野生鼠C57BL/6和IL-10-KO小鼠背部皮下，定期观察小鼠状态和肿瘤生长情况，使用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积。待肿瘤生长至合适大小，选取肿瘤大小相近的荷瘤小鼠12只，随机分为vIL-10处理组和对照组，在肿瘤周围浸润注射vIL-10或生理盐水。定期测量肿瘤大小、体积变化，实验结束后处死小鼠，完整剥离肿瘤，称重并记录。运用流式细胞术检测肿瘤组织中NK细胞、T细胞、调节性T细胞（Tregs）、骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）的数量和比例，深入研究vIL-10对荷瘤小鼠肿瘤微环境中免疫细胞的影响。
6.3 2026年1月 - 2026年12月：项目收尾与成果总结
（一）延续动物实验研究
  将纯化的vIL-10与MC38肿瘤细胞及MFC肿瘤细胞共培养，利用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力，通过细胞划痕实验评估细胞的愈合能力，进一步探究vIL-10对肿瘤细胞运动能力的影响。将MC38肿瘤细胞或MFC肿瘤细胞分别接种至野生鼠C57BL/6和IL10-KO小鼠，构建荷瘤小鼠模型。选取肿瘤大小相等的荷瘤小鼠各12只，在肿瘤周围浸润注射vIL-10，密切观察和测量肿瘤的变化，实验结束后处死小鼠，测定肿瘤重量、体积，运用流式细胞仪精确检测NK细胞、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞、调节性T细胞（Tregs）、骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）在肿瘤内的数量，通过组织病理学分析观察vIL-10对肿瘤组织的形态学影响，如淋巴细胞浸润情况、肿瘤细胞坏死程度等，全面评估vIL-10对肿瘤生长和肿瘤微环境的影响。
（二）项目总结与论文撰写
  整理、汇总和分析整个项目研究过程中获得的所有实验数据，运用统计学方法进行数据处理，确保数据的准确性和可靠性。结合国内外相关研究成果，深入讨论vIL-10调控肿瘤微环境在肿瘤发展中的作用机制，总结研究的创新点和不足之处。根据数据分析结果和讨论内容，撰写1-2篇高质量中文论文，投稿至相关领域的权威学术期刊，同时整理项目研究资料，为项目验收做好充分准备。
  本人入学以来，就加入了老师的研究团队，跟随刘瑞坪学长学习了分子生物学和免疫学等一系列技术，本实验室具备与本课题相关一切条件，课题中所涉及的技术在本实验室非常成熟。
本课题部分预实验结果：
  本课题组已经对本项目开展了部分预实验，并且取得了可喜的成果；结果如图所示：vIL-10的PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳结果如图1 A所示，电泳条带清晰，大小符合预期范围。vIL-10与pGEX-4T-1的EcoRⅠ、SalⅠ双酶切电泳如图1 B所示，电泳条带清晰，大小均符合预期范围。取重组质粒，进行EcoRⅠ与SalⅠ双酶切鉴定，经1.2%琼脂糖凝胶电泳后结果如图1 C所示，大小符合预期。
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A M DNA标志物（DL5000） 1 vIL-10的PCR产物
B M DNA标志物（DL5000） 1 vIL-10双酶切产物 2 pGEX-4T-1双酶切产物
C M DNA标志物（DL10000） 1 重组质粒双酶切鉴定
图1 PCR 扩增及重组质粒鉴定琼脂糖凝胶电泳结果
  选取该重组质粒进行测序，经比对，测序结果正确。重组质粒vIL-10-pGEX-4T-1结构图如图2所示。
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图2 重组质粒vIL-10-pGEX-4T-1图谱
  将转入vIL-10-pGEX-4T-1的E.Coil.DE3与转入pGEX-4T-1的E.Coil.DE3破碎后取适量上清，提取蛋白进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。GST标签蛋白大小为26kD，vIL-10蛋白大小约为17kD。结果如图3 A所示，转入vIL-10-pGEX-4T-1的E.Coil.DE3与转入pGEX-4T-1的E.Coil.DE3相比，45kD下方有一明显条带。转入vIL-10-pGEX-4T-1的E.Coil.DE3蛋白提取液经GST标签蛋白纯化试剂盒纯化，结果如图3 B所示，45kD下方有一明显条带，大小符合预期，表明本研究成功表达并纯化了vIL-10。
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A M 蛋白分子量标志物 1 转入vIL-10-pGEX-4T-1的E.coil.DE3蛋白提取液 2 转入vIL-10-pGEX-4T-1的E.coil.DE3蛋白提取液
B M 蛋白质分子量标准 1 vIL-10的GST标签纯化产物
图3. vL-10的SDS –PAGE及Western blot 分析
  取转入vIL-10-pGEX-4T-1的E.Coil.DE3与转入pGEX-4T-1的E.Coil.DE3提取蛋白进行Western-Blot分析。结果如图4 A所示，转入vIL-10-pGEX-4T-1的E.Coil.DE3菌株vIL-10表达阳性，转入pGEX-4T-1的E.Coil.DE3不表达vIL-10。
  将蛋白提取产物分别进行GST标签蛋白纯化后做Western-Blot分析，结果如图4 B所示，可见转入vIL-10-pGEX-4T-1的E.Coil.DE3所表达的vIL-10能被纯化，大小符合预期，转入pGEX-4T-1的E.Coil.DE3不表达vIL-10。
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A 1 vIL-10-pGEX-4T-1的Western blot M 蛋白质分子质量标准 2 pGEX-4T-1的Western blot
B M 蛋白质分子质量标准 1 vIL-10-pGEX-4T-1的GST标签纯化 2 pGEX-4T-1的GST标签纯化
图4. vL-10的Western blot 分析
  经反复探索最适纯化条件，得到了纯化后的vL-10，其收率和纯度较高，可以用于下一步的科研实验。
  vIL-10经纯化、切割、浓缩后测得vIL-10浓度为0.56mg/ml。收集MC38细胞并用PBS混匀，使用血细胞计数板测得细胞浓度为7.6×107个/ml。对C57BL/6J小鼠与IL-10-KO小鼠进行MC38细胞悬液皮下注射，小鼠肿瘤模型成制备功后，分别于肿瘤周围浸润注射vIL-10与PBS。每7天注射一次共注射2次。
  动物实验结果如图5所示，图5 A显示野生型C57BL/6J小鼠注射vIL-10比注射PBS肿瘤重量明显增加，结果具有统计学意义(P＜0.05)；基因敲除IL-10-KO小鼠注射vIL-10比注射PBS肿瘤重量明显增加，结果具有统计学意义(P＜0.01)；表明EBV vIL-10能够促进肿瘤生长。图5 B为离体MC38肿瘤图片，肿瘤组织状况良好。
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A 肿瘤重量分析 *P<0.05, ***P<0.001
B 离体肿瘤图片
图5. 离体肿瘤分析
已具备的条件：
申请者所在学科及实验室分别是山东省省级重点学科（医学免疫学），济宁医学院“泰山学者”专家实验室。建有专门的分子生物学实验室、蛋白纯化实验室、细胞生物学实验室、动物实验室等，具备与该项目相关的实验条件。其中P2实验室为质粒重组、蛋白纯化和细胞培养提供条件，先进的BRET和FRET用于检测蛋白质相互作用，激光共聚焦显微镜可以为研究细胞内信号传导和分析细胞周期和凋亡提供帮助。还有蛋白电泳及转印系统、荧光成像分析系统、多功能荧光发光仪、分选式流式细胞仪、质谱仪、立体定位仪以及活细胞工作站、活体光学成像系统等仪器设备及设施。同时济宁医学院实验动物中心拥有SPF级动物房（SYXK（鲁）20180002），为科研所需实验动物的饲养、繁殖提供了保障。同时具有良好的计算机及通信设施，为生物信息学的运用提供了良好的条件。
尚缺少的条件：无
解决方法：无

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 30000.00 实验用途 15550.00 14450.00
1. 业务费 8000.00 实验用途 4550.00 3450.00
（1）计算、分析、测试费 3000.00 DNA测序（6次，500/次） 2500.00 500.00
（2）能源动力费 1500.00 水费、电费等 750.00 750.00
（3）会议、差旅费 2000.00 国内学术交流会3~4次 1000.00 1000.00
（4）文献检索费 600.00 文献检索 300.00 300.00
（5）论文出版费 900.00 论文查重、出版 0.00 900.00
2. 仪器设备购置费 2000.00 试剂、分子生物学相关试剂 1000.00 1000.00
3. 实验装置试制费 15000.00 动物费（IL-10-KO小鼠20只，动物购买及运输费约需600元/只 X20只=1.20万元，饲料、垫料及饲养费0.30万元，动物费共约1.50万元） 5000.00 10000.00
4. 材料费 5000.00 细胞株 5000.00 0.00
结束

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