结直肠癌（CRC）是消化内科常见恶性肿瘤之一,CRC在我国的发病率已高居全部恶性肿瘤的第二位，也是全球第三大恶性肿瘤，严重威胁病患的生命健康。根据数据显示，2020年全球结直肠癌新发病例数高达1919600例，死亡人数达到935200例。在世界各地，50岁以上年纪的人发病率和死亡率还在持续上升。男性发病率和死亡率均高于女性。世界各区域的发病率和死亡率存在差异，东亚是世界上结直肠癌发病率和死亡率最高的地区[1]。结直肠癌负担的改变反映了危险因素的变化，以及HDI水平和早期发现活动筛查的差异。中国患结直肠癌的人数较多，且发病率持续增加，这可能导致未来中国结直肠癌患病率负担持续加重，我国应扩大筛查以控制结直肠癌早发现早治疗，并将重点放在年轻人身上[2]。CRC的早期癌前病变通常表现出的症状为结直肠息肉或直肠腺瘤等，发展较为缓慢，并无明显症状，易漏诊和误诊，因此当患者确诊结直肠癌时多已到中晚期，错过最佳治疗时机，导致治疗效果较差。因此，早期诊断对于防治CRC、改善患者治疗效果、提高患者生活质量、延长生命时长至关重要。
糖酵解是真核细胞内葡萄糖最初经历的酶促分解过程，是葡萄糖分解代谢的共同途径。肿瘤细胞为了适应肿瘤微环境和满足快速增殖的需求，肿瘤细胞具有“Warburg效应”，在氧气充足的情况下肿瘤细胞倾向于通过糖酵解途径来分解葡萄糖获得能量。研究表明，恶性肿瘤细胞主要利用有氧糖酵解为其快速生长和增殖提供能量及生长所需物质[3-4]，且糖酵解与恶性肿瘤的发生、发展及转移密切相关，因此糖酵解这一生理过程是治疗恶性肿瘤的重要靶点。PFKFB3是糖酵解途径的关键调节蛋白，能够有效的调节糖酵解效率，敲低PFKFB3可使CRC细胞的有氧糖酵解和增殖活性受到明显抑制，抑癌基因（如p53）的缺失或原癌基因（如ras）的激活，均可激活PFKFB3基因，促进肿瘤的发生及进展[5]。敲除PFKFB3基因可降低PFKFB3的活性，可以抑制糖酵解速率及肿瘤生长速率[6]。从机制上来说PFKFB3介导的小管糖酵解重编程产生的乳酸显著增强了组蛋白乳酸化，特别是H4K12la,它富集于NF-κB信号基因如Ikbkb、Rela、Relb的启动子，激活他们的转录并且促进炎症反应的发生[7]。PFKFB3蛋白在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌及胃癌等多种恶性肿瘤中高表达，与恶性程度及不良预后密切相关。以上表明，PFKFB3在调控糖酵解及肿瘤生长中起重要作用。
肿瘤微环境是肿瘤细胞所生活的综合性生态系统，它包括肿瘤细胞所处的内外部环境，其核心构成免疫细胞群，它们共同编织着复杂的免疫网络，广泛的参与了各种免疫反应与调节功能活动｡肿瘤免疫微环境主要由肿瘤细胞、多种免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞、细胞因子和趋化因子等组成，它们构成了一个复杂的肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)[8]｡随着肿瘤的迅速生长，TME会呈现动态变化，为肿瘤增殖与侵袭的提供有利条件，有助于肿瘤免疫逃逸｡巨噬细胞是肿瘤微环境中最突出的免疫细胞类型，它不仅参与介导肿瘤细胞的逃逸，帮助肿瘤细胞进入血液循环系统并播散到全身各处，还具备抑制机体抗肿瘤免疫反应的能力，是调节肿瘤微环境内动态平衡与肿瘤进程的关键因素[9]。TAMs（TAMs是肿瘤相关巨噬细胞Tumor-associated Macrophages）具有高度可塑性和异质性，TAMs是TME中的含量最多的免疫细胞。TAMs在表型上分为两种，分别是经典活化的M1型和交替活化的M2型。M1型TAMs分泌促炎细胞因子，其作用是帮助清除病原体和肿瘤细胞，产生抗肿瘤免疫反应。M2型TAMs在TME中含量较多，主要参与抗炎和组织修复，并在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥了重要的作用[10]。TAMs被募集到肿瘤区域，对各种TME成分（如细胞因子、趋化因子和外泌体）作出反应。然后这些环境因素诱导TAMs的一定极化状态，从抗肿瘤状态（M1样）到促肿瘤状态（M2样）。此外，TAMs的极化过程是连续的，并随着肿瘤的恶性进展逐渐向M2样状态倾斜形成有利于肿瘤生长和转移的正反馈回路[11]。TAMs在抑制免疫应答、促进肿瘤细胞增殖、驱动血管新生、重塑肿瘤基质，以及提升肿瘤细胞的侵袭与迁移能力等方面发挥着重要作用[12]。肿瘤微环境中多胺的水平受肿瘤细胞与免疫细胞竞争性的调节，使得多胺平衡朝向有利于自身细胞功能的方向倾斜。这一过程最终导致肿瘤微环境中的多胺耗尽，促进肿瘤细胞侵袭机体并导致免疫细胞的功能受到抑制 [13] 。
结直肠癌转移(colorectal liver metastasis, CRLM)是结直肠癌患者治疗的重点和难点之一，也是CRC患者最主要的死亡原因｡侵袭是一个复杂的、多步骤的过程，包括肿瘤细胞彼此分离，从原发肿瘤块位置移开，并侵入周围的基质[14-15]｡在侵袭过程中，肿瘤细胞暴露于不断发生变化的肿瘤微环境细胞和分子成分中，表型转换是一个必要的过程｡一些研究已经发现，在结直肠肿瘤细胞侵袭过程中会通过特定程序失去上皮表型，获得间质表型，这个过程称为上皮间充质转化(EMT：Epithelial-Mesenchymal Transition)[16]｡在癌症生长和转移过程中,EMT的异常再激活与肿瘤细胞的恶性特征有关，包括促进迁移与侵袭，增加肿瘤干性，增强对化疗和免疫治疗的抵抗力。EMT受到一个复杂网络的严格调控，该网络是由多种内在因素和外在因素相互作用影响所精心策划形成的，包括多种转录因子、翻译后控制、表观遗传修饰和非编码RNA介导的调控[17]。EMT期间，上皮细胞失去其细胞极性和细胞间黏附，获得迁移和侵袭特性，以获得间充质干细胞表型｡EMT过程中细胞标志物也在发生变化，其中上皮标志物如E⁃钙黏蛋白、角蛋白等表达缺失，而波形蛋白、N⁃钙黏蛋白、纤维连接蛋白等间质标志物表达增加，其中E⁃钙黏蛋白水平的下降可以导致细胞的黏附力降低，使细胞获得易于侵袭和转移的特性，是EMT最显著的特征｡因此肿瘤细胞的EMT过程有利于邻近的肿瘤细胞分离，增强肿瘤细胞迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力，促使肿瘤细胞转移｡结直肠癌发展过程中，肿瘤相关巨噬细胞的M2极化受到多种途径的调控，Runt相关转录因子1(RUNX1)能够通过促进CCL2的分泌和激活Hedgehog信号通路，招募巨噬细胞并诱导其向M2型极化，从而促进肿瘤血管生成和肿瘤细胞的恶性行为[18]。微生物促进肿瘤内乳酸的形成,通过对巨噬细胞RIG⁃Ilys852乳酸化修饰诱导其极化为M2，进而调控结直肠癌转移[19]。
为了研究成年小鼠和特定细胞类型中的基因功能，已经创建了一种依赖于DNA重组酶Cre及其识别位点loxP的条件基因失活的改进策略。对于条件诱变，通过插入两个loxP位点来修饰靶基因，从而通过cre介导的重组酶来切除侧翼floxed基因片段。通过与Cre转基因系杂交获得基因突变小鼠，使小鼠体内的表达域内的靶基因失活。Cre/loxP系统有助于开发用于谱系追踪的细胞和组织特异性报告小鼠，以及小鼠细胞特异性条件耗竭模型[20]。构建基于F4/80 Cre和flox/flox小鼠的条件性基因敲除模型（Conditional Knockout, cKO），需通过Cre-loxP系统实现巨噬细胞特异性基因敲除。以下是详细的构建流程和关键注意事项：基本原理：Cre-loxP系统，Cre重组酶：由F4/80启动子驱动，在巨噬细胞中特异性表达，可识别并剪切两侧带有loxP位点的DNA序列。Floxed基因（flox/flox小鼠）：目标基因（如PFKFB3等）的外显子被两个同向
的loxP位点包裹。当Cre存在时，loxP间的DNA被剪切重组，实现基因敲除。在本实验中，我们选择亲本F4/80cre+小鼠和PFKFB3flox/flox小鼠，通过两代杂交获得PFKFB3flox/floxF4/80cre+小鼠，然后以该基因型小鼠与PFKFB3flox/flox小鼠合笼繁育，后代即为实验用鼠。
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