1.内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）损伤睾丸BTB功能
内质网是负责类固醇生物合成和维持细胞内稳态的重要细胞器。许多细胞外刺激，如缺氧、低血糖、酸中毒和自由基水平的增加，以及细胞内钙稳态的改变，能量和脂质代谢的波动，都会导致未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网的腔中积累，引发未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR），持续的UPR最终触发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）8。正常状态下，葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein，GRP78）直接与所有ERS传感器相互作用，并保持为非活性形式。在应激状态下，未折叠蛋白通过诱导内质网跨膜传感器：肌醇需要蛋白1α（Inositol-requiring protein-1，IRE1α）、激活转录因子6（Activating transcription factor-6，ATF3）和蛋白激酶RNA样内质网激酶（Protein kinase RNA（PKR）-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）的磷酸化和再定位，促进GRP78的解离，激活下游信号通路引发细胞凋亡或者ERS相关降解途径9,10。ATF3作为内质网UPR中关键的应激蛋白，当受到压力时被切割为具有转录因子活性的蛋白，并从高尔基体膜转位至细胞核中，激活靶基因的表达；从而参与调控ERS反应，维持细胞内蛋白质稳态11。
ERS或内质网稳态受损与生殖疾病及其导致的不育密切相关12。ERS是导致生殖细胞（包括精母细胞和睾丸支持细胞）凋亡的重要途径，并损坏类固醇激素合成和精子发生障碍等13。此外，ERS参与高热量饮食和2型糖尿病引起的睾丸功能障碍，肥胖通过睾丸脂肪合成紊乱等导致细胞过度ERS，并最终诱导细胞凋亡14。以上研究表明：ERS诱导支持细胞凋亡损伤睾丸BTB功能。
2.IDH1调控谷氨酰胺代谢促进脂肪合成
谷氨酰胺是人体内最丰富的细胞外氨基酸，参与细胞增殖、存活和免疫应答等过程，尤其是在快速分裂的肿瘤细胞15。谷氨酰胺一旦进入细胞内，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶（Glutaminase1，GLS1）的催化下生成谷氨酸，然后在谷氨酸酶（Glutamate dehydrogenase，GLUD）或者转氨酶的催化生成α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid，α-KG），并进入三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle，TCA）以维持氧化磷酸化16。α-KG还可通过催化逆向生成乙酰-CoA，用于从头脂肪生成途径，这一过程涉及通过TCA循环的反向转移和IDHs的还原羧化以生成乙酰辅酶A17。尽管所有三种IDH异构体（包括IDH1，IDH2和IDH3）都催化异柠檬酸盐向α-KG的基本转化，但它们在维持细胞氧化还原和能量状态方面都有独特的作用。
IDH1和IDH2均有助于脂质合成，其中发现IDH1是非恶性和恶性细胞脂质合成的主要调节因子18。相反，IDH3是一种线粒体酶，在三羧酸循环中发挥中心作用，促进氧化磷酸化生成腺苷三磷酸19。具有IDH3突变的细胞表现出最大和储备能力的降低，表明线粒体功能和适应呼吸应激能力增强。谷氨酰胺剥夺对线粒体功能产生不利影响，而IDH1和IDH3基因表达上调通过调控谷氨酰胺代谢促进细胞分化过程中脂肪生成和腺苷三磷酸生成20。因此，IDH1基因调控谷氨酰胺代谢促进脂肪合成，但IDH1在睾丸SCs中的表达以及是否参与脂肪合成尚未见报道。
3.ERS促进睾丸支持细胞脂肪滴聚集，但其作用尚不明确
脂肪是生殖细胞膜中最丰富的甾醇，在睾丸和附睾的生殖细胞成熟过程中，这些细胞膜经历了广泛的重塑。精子膜内不同脂质的比例对正常功能和随后的信号事件非常重要，它们富含多不饱和脂肪酸，是精子运动、获能和精卵融合所必需的21。当精子成熟后，脂质成分的显著变化对生育至关重要。精子通过附睾是质量控制的一种重要形式，可以根除异常精子，同时也可以通过改变胆固醇含量来促进精子膜的修饰。胆固醇对精子膜的流动性有重要影响，胆固醇外流是精子获得获能所必需的22。因此，胆固醇代谢或磷脂调节的任何异常都可能影响男性生育能力。在啮齿动物研究中，尽管最近在人类精浆研究中，分析表明较高的血清胆固醇水平与有利的精液参数有关，但较高的胆固醇摄入影响精子质量23。因此，睾丸SCs脂肪代谢对于维持精子功能尤为重要，异常脂肪代谢损伤精子功能。
睾丸SCs是生殖细胞发育的“护士”细胞，其数量和功能对精子发生至关重要，它们负责维持BTB功能，产生细胞外基质、转运蛋白、细胞因子、雄激素结合蛋白以及许多其他功能，包括脂质储存和流出。SCs提供生殖细胞成熟所需的胆固醇和脂肪酸，通过脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FASN和硬脂酰辅酶A去饱和酶Stearoyl‐CoA desaturase，SCD）促进脂肪合成。尽管它们可以进行脂肪重头，但这不足以满足精子生成所需的脂肪量。脂质稳态的任何失衡都可能导致支持细胞胞浆内脂质滴（Lipid droplet，LD）沉积过多，从而影响其功能。过大的LDs可能通过改变细胞骨架和BTB破坏引起机械功能障碍，影响精子发生过程中生殖细胞的存活和成熟24。LD摄取高密度脂蛋白，以及摄取低密度脂蛋白，肝X受体（Liver X Receptor，LXR）和类固醇生成因子1（Steroidogenic factor 1，SF-1）在内的其他核受体参与了类固醇生成的调控25。
内质网是参与脂质代谢的主要细胞器，因为内质网含有许多与脂质代谢相关的酶。内质网是过量营养素和脂质积聚之间的潜在机制联系，脂质积聚是睾酮分泌低下、生精细胞凋亡和精子发生障碍发展的重要途径26。睾丸ERS发生时，代谢紊乱导致脂质堆积。葡萄糖饮食通过激活ERS诱导睾丸脂质积聚，4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）和牛磺熊去氧胆酸（Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）可通过抑制高脂饮食诱导的睾丸脂质积聚27。这表明抑制ERS是减轻脂质积聚的一个潜在靶点。此外，4-PBA通过抑制ERS相关蛋白GRP78、磷酸化IRE1α和X-盒式结合蛋白（X-box-binding protein-1，XBP-1）的表达显著下调，并与改善的脂质代谢相关。研究发现，ERS可以激活SREBP和LXR等信号调节睾丸脂质代谢28。以上研究表明：ERS促进脂质合成以及脂肪滴聚集，阻断内质网可能改善脂质代谢紊乱。
4.本研究科学假说提出
睾丸支持细胞作为生精过程重要细胞，提供能量和脂肪等物质维持精子发生过程。谷氨酰胺摄入能够补偿葡萄糖不足，生成丙酮酸促进了乳酸的产生。但有关谷氨酰胺在生精过程尚未见报道。我们前期研究结果发现，谷氨酰胺参与睾丸SCs增殖和生长过程。ERS蛋白ATF3能否调节睾丸SCs。
基于前期发现，本研究提出创新性假说：ERS激活的ATF3通过转录调控IDH1促进脂肪酸过度合成，导致SCs脂质代谢失衡，进而损伤BTB功能。为此，本文通过Cre-loxP重组酶系统，构建睾丸支持细胞IDH1基因敲除的小鼠，结合血睾屏障损伤的动物模型，从分子、细胞与整体水平研究IDH1在睾丸支持细胞骨架结构维持和细胞极性形成、血睾屏障形成、睾丸发育和精子发生与成熟中的作用，进一步探讨IDH1调控脂肪代谢的分子机制，为精子发生的调控机制提供新内容，为精子发生障碍相关疾病的防治提供依据和潜在靶点。
参考文献
1. Eisenberg, M. L. et al. Male infertility. Nat Rev Dis Primers 9, 49 (2023).
2. Zhao, Y. et al. Connexin-43 is a promising target for lycopene preventing phthalate-induced spermatogenic disorders. J Adv Res 49, 115–126 (2023).
3. Tysoe, O. Sertoli cell lysosomal dysfunction drives age-related testicular degeneration. Nat Rev Endocrinol 20, 386 (2024).
4. Li, B. et al. IDH1 promotes foam cell formation by aggravating macrophage ferroptosis. Biology (Basel) 11, 1392 (2022).
5. Chen, H., Luo, S., Chen, H. & Zhang, C. ATF3 regulates SPHK1 in cardiomyocyte injury via endoplasmic reticulum stress. Immun Inflamm Dis 11, e998 (2023).
6. Hu, S. et al. Atf3-mediated metabolic reprogramming in hepatic macrophage orchestrates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis. Sci Adv 10, eado3141 (2024).
7. Centola, C. L. et al. Glycolysis as key regulatory step in FSH-induced rat Sertoli cell proliferation: Role of the mTORC1 pathway. Biochimie 214, 145–156 (2023).
8. Chen, X., Shi, C., He, M., Xiong, S. & Xia, X. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther 8, 352 (2023).
9. Chen, S., Wang, Q., Wang, H. & Xia, S. Endoplasmic reticulum stress in T cell-mediated diseases. Scand J Immunol 98, e13307 (2023).
10. Marciniak, S. J., Chambers, J. E. & Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov 21, 115–140 (2022).
11. An, J. et al. Endoplasmic reticulum stress participates in apoptosis of HeLa cells exposed to TPHP and OH-TPHP via the eIF2α-ATF4/ATF3-CHOP-DR5/P53 signaling pathway. Toxicol Res (Camb) 12, 1159–1170 (2023).
12. Ge, X. et al. Protein palmitoylation-mediated palmitic acid sensing causes blood-testis barrier damage via inducing ER stress. Redox Biol 54, 102380 (2022).
13. Wu, L., Qu, J., Mou, L. & Liu, C. Apigenin improves testosterone synthesis by regulating endoplasmic reticulum stress. Biomed Pharmacother 177, 117075 (2024).
14. Li, Y. et al. Endoplasmic reticulum stress increases exosome biogenesis and packaging relevant to sperm maturation in response to oxidative stress in obese mice. Reprod Biol Endocrinol 20, 161 (2022).
15. Jin, J., Byun, J.-K., Choi, Y.-K. & Park, K.-G. Targeting glutamine metabolism as a therapeutic strategy for cancer. Exp Mol Med 55, 706–715 (2023).
16. Zhang, G.-F. et al. Reductive TCA cycle metabolism fuels glutamine- and glucose-stimulated insulin secretion. Cell Metab 33, 804-817.e5 (2021).
17. Du, D. et al. Metabolic dysregulation and emerging therapeutical targets for hepatocellular carcinoma. Acta Pharm Sin B 12, 558–580 (2022).
18. Mondesir, J., Willekens, C., Touat, M. & de Botton, S. IDH1 and IDH2 mutations as novel therapeutic targets: current perspectives. J Blood Med 7, 171–180 (2016).
19. Liu, X. et al. The existence of a nonclassical TCA cycle in the nucleus that wires the metabolic-epigenetic circuitry. Signal Transduct Target Ther 6, 375 (2021).
20. Ivanov, S., Nano, O., Hana, C., Bonano-Rios, A. & Hussein, A. Molecular targeting of the isocitrate dehydrogenase pathway and the implications for cancer therapy. Int J Mol Sci 25, 7337 (2024).
21. Ding, N. et al. Impairment of spermatogenesis and sperm motility by the high-fat diet-induced dysbiosis of gut microbes. Gut 69, 1608–1619 (2020).
22. De Toni, L. et al. Membrane Cholesterol Inhibits Progesterone-Mediated Sperm Function through the Possible Involvement of ABHD2. Int J Mol Sci 24, 9254 (2023).
23. Antunes, K. V. et al. Sperm characteristics of cryopreserved Prochilodus lineatus semen after adding cholesterol-loaded cyclodextrin. Cryobiology 115, 104888 (2024).
24. Zomer, H. D. et al. Sertoli cells require TDP-43 to support spermatogenesis†. Biol Reprod 107, 1345–1359 (2022).
25. Goo, Y.-H. et al. Lipid droplet-associated hydrolase mobilizes stores of liver X receptor sterol ligands and protects against atherosclerosis. Nat Commun 15, 6540 (2024).
26. Celik, C., Lee, S. Y. T., Yap, W. S. & Thibault, G. Endoplasmic reticulum stress and lipids in health and diseases. Prog Lipid Res 89, 101198 (2023).
27. Doğanyiğit, Z. et al. Can endoplasmic reticulum stress observed in the PTZ-kindling model seizures be prevented with TUDCA and 4-PBA? Eur J Pharmacol 960, 176072 (2023).
28. Borok, Z. et al. Grp78 Loss in Epithelial Progenitors Reveals an Age-linked Role for Endoplasmic Reticulum Stress in Pulmonary Fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 201, 198–211 (2020).
