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马齿苋细胞外囊泡对糖尿病慢性创面的治疗作用及机制研究

申报人:王云鹏 申报日期:2025-03-22

基本情况

2025创新项目
马齿苋细胞外囊泡对糖尿病慢性创面的治疗作用及机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生自主选题
二年期
糖尿病慢性创面(Diabetic Chronic Wound, DCW)作为糖尿病严重的并发症之一,由周围神经病变、血管病变及多重感染共同诱发,具有高截肢率(34.5%)、高致残率(28.7%)、年治疗费用超50亿美元及不足40%的治愈率等临床特征,已成为全球公共卫生领域的重大挑战。传统治疗手段受限于创面微环境复杂性和多靶点调控需求,亟需探索新型治疗策略。 马齿苋(Portulaca oleracea L.)作为药食同源的传统中药材,其多组学特征揭示出显著的抗炎、抗氧化及促血管生成活性。近五年研究证实,马齿苋提取物通过双重调控TLR4/NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路,可有效抑制DCW微环境中的炎症风暴,同时促进成纤维细胞增殖和角质形成细胞迁移,展现出独特的创面修复潜能。本研究创新性聚焦于马齿苋细胞外囊泡(Portulaca-derived Extracellular Vesicles, PDEVs)这一新型纳米级(30-1000 nm)生物活性载体。
       通过两学年的学习,本项目组成员掌握了HE染色、石蜡切片、冰冻切片、Western Blot和糖尿病慢性创面鼠模型的制备等实验方法,并具备利用生物信息学分析解决问题的能力。擅长于细胞生物学与分子生物学实验室的常规操作,对于在实验中遇到的问题和疑惑会深究到底,同时有严谨的研究态度,可以做到实验前准备足,实验中考虑全,实验后处理强。在此之前,我跟随白春雨老师和高玉花老师在精准医学研究院参与其国家自然科学基金和山东省自然科学基金项目,掌握了基本的分子生物学实验技术与方法以及本项目实验的一些步骤和注意事项等,具备了实施本项目的基本实验技能。
指导教师承担国家自然科学基金1项、济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站基金 1项、济宁市重点研发项目 1项
教师将给本项目提供理论、技术及经费支持
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
王云鹏 医学影像与检验学院 医学影像学(本科) 2023 查阅资料,蛋白印迹检测,组织分析,小鼠模型造模,细胞外囊泡提取,协调团队
李佳欣 临床医学院(附属医院) 临床医学(本科-临床医学院) 2022 小鼠模型造模,蛋白印迹检测
董望云 临床医学院(附属医院) 临床医学(圣地卓越医师班) 2024 小鼠模型造模,蛋白印迹检测,细胞外囊泡提取
支渊 临床医学院(附属医院) 临床医学(圣地卓越医师班) 2024 小鼠模型造模,蛋白印迹检测,细胞外囊泡提取
苗正洁 临床医学院(附属医院) 临床医学(本科) 2023 查阅资料,生物信息学分析,免疫组织化学分析,蛋白印迹检测,组织分析
张丝影 临床医学院(附属医院) 临床医学(本科) 2023 查阅资料,生物信息学分析,免疫组织化学分析,蛋白印迹检测,组织分析

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张亚南 临床医学院(附属医院)
胡传兵 临床医学院(附属医院)

立项依据

机制解析:系统阐明马齿苋细胞外囊泡(PDEVs)调控糖尿病慢性创面(DCW)微环境的多靶点分子机制,重点揭示其通过PI3K-Akt/mTOR/Notch等信号通路干预炎症-氧化应激-血管新生失衡的作用网络,填补植物源EVs治疗代谢性创面的基础研究空白。
治疗策略转变:基于PDEVs的纳米载体特性及其功能成分(如miRNA、15-HETE、FGF-2等),探索其在创面修复中的多模态协同效应,为开发低副作用、高靶向性的新型纳米药物提供理论依据与物质基础。
方法学创新:构建"动物-细胞-分子"三维验证体系,整合CRISPR基因编辑、单细胞测序及多模态成像技术,建立中医药活性成分研究的标准化技术路径,推动传统药用植物资源的现代化开发与应用转化 
○1植物源纳米囊泡的标准化制备与多维度表征(已完成)
采用差速离心联合超滤技术建立PDEVs标准化制备流程:新鲜马齿苋经预冷PBS清洗后,通过低温破壁及多级过滤获得粗提液,经梯度离心获取高纯度PDEVs沉淀。运用纳米颗粒追踪分析(NTA)测定粒径分布(主要分布在80-200nm),透射电镜(TEM)确认双层囊状盘样结构,BCA法测定蛋白浓度。LC-MS/MS等方法鉴定出56种特征性组分,包括新型miRNA类似物、特异性脂质介质(15-HETE、Resolvin D1)及创伤修复相关蛋白(FGF-2、VEGF-A)。马齿苋来源细胞外囊泡内含有蛋白质、脂质、核酸等成分,使用LC-MS和SDS-PAGE进行检测与分析。
○2 多组学驱动的机制预测网络构建(已完成)
基于LC-MS分析结果,联合TCMSP数据库比对筛选出54种未收录的新型活性成分。通过Drug Bank、TTD、PubChem及Swiss Target数据库检索上述成分,经取交集和去重处理获取潜在作用靶点,并利用UniProt数据库对靶点命名进行标准化,筛选已验证的小鼠来源靶点基因。基于GEO数据集(GSE8041),采用limma算法通过GEO2R平台进行差异分析,鉴定327个DCW相关差异基因,通过火山图与热图实现可视化。进一步使用Venny 2.1工具对活性成分靶点与差异基因取交集,获得172个关键调控基因。STRING数据库构建蛋白质互作(PPI)网络,导入Cytoscape 3.9.1进行蛋白质相互作用网络图,识别9个核心靶点。最终构 “成分-靶点-通路”多维网络,预测PDEVs可能通过PI3K-Akt/mTOR/Notch信号通路调控成纤维细胞活化及血管新生。
○3多模态体内疗效评价体系
构建STZ诱导的糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型(直径1cm),分为三组(每组各8只小鼠):①空白对照组②PBS对照组③PDEVs局部给药组(外敷+伤口局部皮下注射)。创面每日外敷+伤口局部皮下注射PDEVs,PDEVs浓度呈梯度稀释,进行多次重复实验。每24小时采用钢尺测量创面面积,探讨PDEVs浓度对糖尿病慢性创面治疗效果的影响。ImageJ量化伤口面积,分析伤口愈合率;制作伤口愈合叠加图,使愈合进程可视化。取不同天数的伤口组织样本,进行伤口皮肤HE染色观察组织形态学变化检测方法。
○4分子机制的多组学验证
分子路径的挖掘:整合RNA-seq与磷酸化蛋白质组学,构建PI3K-Akt/mTOR/Notch信号级联调控网络。通过RNA干扰介导的AKT1基因敲除实验证实,PDEVs和成纤维细胞活化呈AKT依赖性。
对PDEVs生物学特性的系统性评估:考察PDEVs免疫原性、细胞摄取效率。采用外周血单个核细胞(PBMC)体外共培养模型,梯度浓度PDEVs刺激,通过ELISA定量培养上清中IL-1β、IFN-γ和IL-10等炎症因子的动态变化。通过建立荧光标记追踪体系,计算标准化摄取率。
对PDEVs促成纤维细胞转换能力的评估:验证PDEVs处理组成纤维细胞转换率显著提高,α-SMA表达上调。Western Blot检测Smad2/3磷酸化水平以评估TGF-β/Smad信号通路活性,验证PDEVs促进成纤维细胞转化。EdU标记法量化PDEVs促成纤维细胞增殖能力,免疫组化技术(IHC)结合抗Ki67特异性抗体定量细胞增殖活性。Transwell体系评估成纤维细胞迁移能力。
对PDEVs促进血管生成的效应的评估:对血管内皮细胞进行相同浓度梯度的PDEVs处理,并开展时间依赖性血管生成功能评价。包括血管生成评价,血管细胞体外成血管分析证明PDEVs处理组毛细管网状结构密度变化显著高于未处理组及对照组。
5. 安全性评估与免疫调控解析
建立四维毒理评价体系:①组织病理学(经由HE染色检测肝肾有无病变), ②炎症因子风暴监测(使用ELISA检测 IL-6与 TNF-α), ③免疫细胞亚群分析(流式检测M2型巨噬细胞的占比) ,④系统毒性评分(检测AST/ALT是否维持正常范围),○5转录组测序揭示PDEVs通过调控SIRPα-CD47轴抑制吞噬细胞过度活化,同时促进Treg细胞分化。 
①糖尿病慢性创面溃疡治疗
糖尿病慢性创面溃疡是糖尿病的常见并发症,严重影响患者的生活质量。糖尿病慢性创面(DCW)是糖尿病患者的主要临床问题,在全球范围内汇总的患病率是6.3%[1],伤口愈合的四个阶段包括止血期,炎症期,增殖期和成熟期。糖尿病慢性创面溃疡的愈合过程被中断并停滞在不同的阶段,这主要归因于高血糖,慢性炎症和感染,血液供应不足,自主性和感觉神经病[2]。目前,糖尿病慢性创面溃疡的标准处理包括控制血糖,感染控制,创面敷料选择,清创与创面处理,肢体缺血的血供改善,减压与负荷管理以及足部护理管理。然而,对于难治性伤口,糖尿病慢性创面溃疡的治疗效果仍然不理想。
中医中药在糖尿病慢性创面溃疡的治疗中,主要应用包括辨证施治的内服中药,外治法如熏洗和外敷,以及结合现代科技研究的新型中药敷料。中药外治法在糖尿病慢性创面溃疡中逐渐受到重视,多项研究表明,中药外敷可抗菌消炎、祛腐生肌,直接作用于创面,减少感染风险[3]。可通过调控炎症因子(如IL-6、TNF-α)、促进血管生成(如VEGF、bFGF)等机制改善糖尿病慢性创面溃疡[4]。但是,这种方法也具有一定的局限性,主要源于机制模糊,见效缓慢等方面,所以寻求一种新型治疗糖尿病慢性创面溃疡治疗是对社会和科学存在所必要的。
②植物源性囊泡 (PDV)跨界治疗动物疾病
植物源性外泌体是细胞外囊泡(EVs)的一种,直径约40~160 nm (平均约100 nm),可将核酸、蛋白质、代谢物传递到受体细胞中,研究表明,外泌体在细胞间信号传导、炎症反应、凝血功能、血管生成、细胞增殖分化、抗原呈递、细胞凋亡等生物过程中发挥着重要作用[5][24][25],同时外泌体联合智能敷料,外泌体与温敏水凝胶(如FHE水凝胶)结合可延长局部作用时间,并通过负载生长因子(如rhEGF)增强疗效[6]。细胞外囊泡(EVS)是介导细胞到细胞通信并影响糖尿病性慢性溃疡的重要分泌产物[7]。此外,外泌体膜中的脂质和蛋白质促进了其细胞摄取和运输能力,并且完全降解的特征可最大程度地减少副作用和毒性[8]。葡萄柚来源的纳米囊泡通过递送miR-181a抑制TLR4/NF-κB通路,减少促炎因子 (TNF-α、IL-6)释放,并促进M2型巨噬细胞极化,加速糖尿病小鼠创面愈合[9],芦荟外泌体负载于壳聚糖水凝胶中,通过促进血管生成(上调VEGF、Ang-1)和胶原沉积,显著缩短烧伤创面愈合时间,其机制可类比应用于糖尿病慢性创面[10]。由EV传播介导的双向细胞的信息传递已成为伤口愈合的关键机制[11]。然而,EVS 表现出复杂的异质性,并介导了生理和病理过程中的各种功能[12][13]。EVs在抗炎、抗肿瘤、组织修复等方面发挥独特的潜力。
③马齿苋对糖尿病慢性溃疡的治疗效果
马齿苋作为一种传统中药,性寒,味酸,归肝、大肠经,在《本草纲目》等古籍中被记载为清热解毒、凉血止血的功效,具有抗炎、抗氧化和促进组织修复的核心药理作用。马齿苋具有多种生物学活性,包括杀菌性,抗糖尿病,利尿剂,抗炎,肝保护性,神经保护性,抗血脂性,抗关节炎和抗癌药物[14][23],其细胞外囊泡(PD-EVs)作为天然纳米载体,携带活性成分(如多酚类、黄酮类化合物及特定miRNA),通过参与抗炎与免疫调节,促进血管生成,抗菌与抗氧化等机制参与糖尿病慢性溃疡治疗[15][22]。马齿苋常与针灸、艾灸等中医技术联用。艾灸改善局部血液循环后,配合马齿苋湿敷可增强抗感染效果,缩短愈合周期[16]。
马齿苋既含有多种营养成分,又含有较多的黄酮类化合物(如槲皮素、山奈酚),对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等常见创面致病菌具有显著抑制作用。同时,马齿苋有机酸对耐药菌具有抑制效果,发挥抑菌作用。此外,炎症信号传导级联反应的激活与氧化应激有关[17],马齿苋的抗氧化特性主要是由于黄酮酸等化合物[18],马齿苋已被证明可以通过抑制氧化应激反应(例如一氧化氮和超氧化物歧化酶)以及降低TNF-α,IL-1β和IL-6,可以有效地抑制结肠炎等炎症的发生[19][20][21]。这证实了除了传统疗法外,使用现代医学技术对于马齿苋处理后注射用药的可行性。
参考文献:
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○1研究方式创新:传统药源活性载体的纳米化重构
首次系统性解析马齿苋细胞外囊泡(PDEVs)的纳米药物属性,突破传统中药以粗提物或单一成分给药的模式。通过建立标准化分离工艺(差速离心联合超滤技术)和纳米载体表征体系(NTA-TEM联用),实现粒径可控(80-200 nm)的高纯度PDEVs制备,其携带的miRNA类似物及15-HETE等脂质介质构成独特的“天然药物递送系统”,为植物源纳米药物的开发提供全新模式。
○2机制解析创新:多靶点调控网络的深度破译
构建“计算预测-实验验证”双循环研究体系,在计算层面整合TCMSP、STRING和转录组数据,发现PDEVs通过调控AKT1/VEGFA/MMP9核心靶点群,形成PI3K-Akt-mTORC1/Notch多通路协同作用网络;在实验层面,利用RNA干扰介导AKT1基因敲除模型,证实PDEVs促血管生成效应和成纤维细胞活化具有AKT依赖性。
○3传统与现代的深度融合
以马齿苋这一经典抗炎中药为载体,结合外泌体递送系统的靶向性与生物相容性优势,推动中药活性成分的现代化研究与临床应用。注重基础研究与临床需求的衔接,通过安全性评估(肝肾功能病理检测)与疗效分析(创面面积量化、血管生成评价),为PDEVs的临床转化提供关键实验证据。 
① 技术路线
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②拟解决的问题
当前发现PDEVs对于治疗DCW有一定作用,本项目旨在阐明PDEVs治疗DCW的有效成分和分子作用机制,以期为DCW的临床治疗提供一种全新的方法和理论依据。
○3预期成果
通过本项目的研究,揭示PDEVs治疗DCW的有效成分和分子作用机制,为利用马齿苋细胞外囊泡对DCW的临床诊疗提供实验理论依据,以期寻找一种全新的中药注射剂制备工艺和一种有效的DCW临床干预方法。
通过开展本项目,不断激发项目组成员的学习能力、好奇心、求知欲、创新精神,提高项目组成员的科学素养和科研兴趣。研究成果以论文形式发表,发表高质量论文1-2篇。 
时间阶段 主要任务
2025.01-2025.03 查阅文献,撰写综述
2025.04-2025.05 查阅文献,总结方法,提取PDEVs
2025.06-2025.10 糖尿病慢性创面小鼠模型造模,进行PDEVs处理局部注射和外敷处理
2025.11-2026.07 进行免疫荧光和冰冻切片实验以及Western Blot、qPCR等组织学和免疫组织化学实验
2026.08-2026.10 整理结果,撰写论文并投稿
2026.11-2027.01 准备结题答辩资料,提交结题报告 
与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
研究前期项目组成员查阅大量DFU、细胞外囊泡、生物信息学、中药注射剂等相关资料,具有一定的知识储备。项目前期通过M-UC法提取艾草的细胞外囊泡,并通过电镜观察MDEVs形态,利用LC-MS法分析MDEVs的主要成分,通过生物信息学预测作用靶点和作用途径,项目组成员具有一定的实验基础。研究院在胞外囊泡相关领域发表文章数篇,具有良好的前期基础,实验室小鼠种类与数量充足且丰富,能做到随取随用随时开展实验。 
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(1)已具备条件
本课题整个实验过程在精准医学院开展实施,精准医学院成立于2015年9月,是山东省高等学校“十三五”重点实验室,拥有专职科研人员近20人,山东省“泰山学者”特聘教授1位,学校高级职称5人以上,博士学历10人以上,具有雄厚的科研师资力量,能够很好的保证本课题持续进行。
研究院仪器设备充足,有细胞培养箱、超净工作台、普通PCR仪、QPCR仪、离心机、蛋白成像仪等仪器设备,能够保证实验的正常进行和实验数据的正常获取;寒暑假期间,学校后勤提供住宿保证,研究者的研究工作能够正常顺利进行
(2)尚缺少条件及解决办法
相关知识储备不足:项目组成员对实验相关的理论知识储备较为有限。
解决办法:通过查阅相关文献、参加学术讲座和培训课程,系统学习相关理论知识。同时,定期与指导老师讨论,及时解决实验中遇到的理论问题。
动手实操经验不足:实验操作(如细胞外囊泡提取、动物模型构建等)需要较高的技术熟练度,部分成员实操经验较少,可能导致实验误差。
解决办法:在实验前期进行多次模拟操作,熟练掌握实验步骤。同时,指导老师将亲自示范关键操作,确保实验的准确性和可重复性。
创伤模型伤口大小不一致:在构建糖尿病慢性创面小鼠模型时,可能会因操作技术不熟练导致伤口大小不完全相同,产生误差,影响实验结果的可比性与精准度。
解决办法:采用标准化的造模工具和操作流程,确保伤口大小一致。同时,通过预实验优化造模条件,减少误差。 

经费预算

开支科目 预算经费(元) 主要用途 阶段下达经费计划(元)
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 进行总体实验研究 12000.00 8000.00
1. 业务费 6000.00 3000.00 3000.00
(1)计算、分析、测试费 5000.00 用于囊泡有效成分分析,蛋白组织分析等 3000.00 2000.00
(2)能源动力费 0.00 0.00 0.00
(3)会议、差旅费 0.00 0.00 0.00
(4)文献检索费 0.00 0.00 0.00
(5)论文出版费 1000.00 论文发表 0.00 1000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 0.00 0.00
4. 材料费 14000.00 用于购买实验所用耗材、一系列所需试剂和小白鼠 9000.00 5000.00
结束