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基于ESR1/MAPK信号通路探究乌梅丸调控脂质代谢干预肺纤维化的作用及机制

申报人：张秋月 申报日期：2025-03-22

基本情况

2025创新项目
基于ESR1/MAPK信号通路探究乌梅丸调控脂质代谢干预肺纤维化的作用及机制 学生申报
创新训练项目
医学
中药学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
肺纤维化是一种进展性、致命性炎性纤维化间质性肺部疾病，目前药物仅能缓解症状且副作用较大，亟需有效治疗手段。经典名方乌梅丸具有较好抗炎作用，本研究重点探讨其对肺纤维化的干预机制。研究表明，脂质代谢紊乱与ESR1/MAPK信号通路在肺纤维化的发展中发挥了关键作用。我们前期研究显示乌梅丸对ESR1/MAPK通路具有调控作用，但在脂质代谢方面的具体干预机制尚待揭示。本项目通过构建博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型，运用多组学联合分析技术，系统解析乌梅丸主要活性成分对该通路的影响，特别是其通过调节关键脂肪酸氧化代谢相关蛋白（如T-SOD、MDA、GSH-PX）表达来抑制肌成纤维细胞转化与细胞外基质沉积的机制。本研究创新性地建立了中医药在“代谢-表观遗传-细胞重塑”中的多维调控网络，为肺纤维化的治疗提供了全新的靶点和策略。
参与多项省级创新与技能类比赛
熟悉并能够独立操作本项目中主要研究内容
为本项目前期研究基础的主要参与者
参与并主持省级、市级与校级项目多项
指导教师对项目内容十分熟悉，有充足的科研经费支持
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
张秋月 药学院 中药学（本科） 2023 研究内容
曹琳娜 药学院 中药学（本科） 2023 创新点与项目特色、技术路线、拟解决的问题及预期成果
王子昕 药学院 中药学（本科） 2023 国内外研究现状和发展动态
胡婉婷 药学院 中药学（本科） 2023 项目研究进度安排，已有基础
李纪芸 药学院 中药学（本科） 2023 项目简介、研究目的

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
黄路芬 药学院 否

立项依据

      肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是目前临床难以治愈的疾病，临床资料显示肺纤维化在明确诊断后，患者的中位生存期仅有2-3年，西医治疗效果并不明显，而传统中医药在治疗PF方面展现出显著优势。脂质代谢参与神经系统、代谢系统、呼吸系统等多系统疾病的发生发展，且与炎症关系密切，近两年不断有研究发现PF病理进展中伴随脂质代谢异常，其与炎症信号通路的交互作用也成为近期研究热点。经典名方乌梅丸具有抗氧化、减少炎症因子表达、增强免疫应答等作用，对PF的作用尚存在空白。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和雌激素受体1（ESR1）信号通路是参与炎症反应的重要信号转导机制，其与脂质代谢异常在肺纤维化中的交互作用仍不十分清楚。本研究主要目的在于探究乌梅丸调控ESR1/MAPK炎性信号通路影响脂质代谢干预PF的作用及其机制，为PF治疗寻找新的治疗策略并提供科学依据。

1.乌梅丸混悬液的制备

      乌梅丸冻干粉制备：冻干粉制备实验所需药材均购买于北京同仁堂，将乌梅30 g，细辛 6 g，干姜 9 g，黄连 9 g，当归 6 g，炮附子 6 g，炒蜀椒 5 g，桂枝 6 g，人参 6 g，黄柏 6 g 煎煮，旋转蒸发后，使用冷冻干燥机冻干，粉末保存于干燥器。混悬液的制备：将一定量的冻干粉加入适量生理盐水制成混悬液，用以后续实验。

2.乌梅丸混悬液主要化学成分的定性分析

      采用 Q-Orbitrap 高分辨质谱仪，Welch RP-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，1.8 m)，以 0. 1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为 0.8 mL/min，正、负离子切换扫描采集模式，扫描范围m/z 50 ~ 500。通过分析 UH-PLC-Q-Orbitrap HRMS 所得到的化合物分子量以及 MS/ MS 碰撞解离碎片，结合文献报道，准确鉴定出乌梅丸的化学成分及药材归属。

3.网络药理学预测
 
3.1乌梅丸的活性成分与靶点筛选

      乌梅丸是一种传统中药方剂，主要由乌梅、附子、细辛、黄连、黄柏、人参、当归、桂枝、干姜和蜀椒等十种成分组成。可通过槲皮素、鬃毛酮、苦楝酮、五味子酯乙和benzoylnapelline等主要活性成分作用于 AKT1、TNF、IL-6、TP53、SRC等核心靶点，起到显著的抗炎、抗肿瘤等作用，从而有效治疗多种胃肠疾病和脑疾病[1]。

3.2药物作用靶点挖掘

      乌梅丸的效应靶点从TCMSP的Related Targets——Targets Information中检索获取，利用R语言将收集到的靶点基因名和Gene Cards数据库中的人类疾病靶点进行比对、筛选，使用Uniport数据库，将药物有效成分对应的靶点蛋白转化为基因名，并将乌梅丸效靶点名称标准化。

3.3构建复方调控网络

      将乌梅丸活性成分及其作用靶点数据集进行编号、拆分、处理。将处理好的结果导入Cytoscape 3.9.0软件生成图片并将图片美化，最终得到乌梅丸复方调控网络，并确定关键成分。

3.4肺纤维化疾病靶点的确定
     
      从Disgenet中获取肺纤维化的准确名称，并从Gene Cards、OMIM、TTD数据库中进行检索汇总；并将乌梅丸中药调控数据集与肺纤维化疾病靶点数据集进行比对，对乌梅丸有效成分及肺纤维化的靶点取交集，绘制Venn图。

3.5蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络的构建

      将共有靶点导入 STRING 数据库进行蛋白互作分析，物种设置为“Homo sapiens”，设置最低需求互作分数≥0.4，置信水平设置为“最高置信度（0.900）”，制作PPI蛋白互作网络图。将共有靶点导入 STRING 数据库进行蛋白互作分析，其中物种设置为智人（Homo sapien）得出 PPI 网络，下载并导入Cytoscape3.7.2 中进行网络拓扑分析，根据degree值筛选出前10的核心靶点，并将这10个靶点重新导入STRING数据库得出核心靶点互作网络图。

3.6核心靶点筛选

      将活性成分和靶点上传至Cytoscape 3.9.0构建“成分-靶点”网络。基于网络拓扑进行统计分析，采用度值、中间性中心性、亲近性中心性评价成分的显著性。筛选两次后得到乌梅丸作用肺纤维化的核心靶点。

3.7 GO及KEGG分析

      通过Metascape数据库对交集靶点进行GO生物功能富集分析和 KEGG 通路富集分析。GO生物功能富集分析主要包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），得到核心药组治疗肺纤维化的主要作用通路和功能富集，在微生信平台绘制GO生物功能与KEGG通路气泡图。

3.8分子对接

      将小分子配体的2D结构从Explore Chemistry（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库上下载下来。大的蛋白受体从UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库查找最常使用的编号，后将编号输入PDB（https://www.rcsb.org/）数据库，下载蛋白受体3D结构。接着将小分子配体导入Chem3D，对其进行优化，使其变成最小结合能形态。将蛋白受体导入PyMOL去除蛋白上的水分子和小分子。将小分子和蛋白受体导入Schrodinger进行对接，对接完成后导入PyMOL进行美化与可视化。

4.动物模型制备及给药方案

4.1肺纤维化动物模型构建

      SPF级ICR雌性小鼠适应饲养7d后将28只分为4组（n=7）分为生理盐水对照组（NS 组），模型组（Model组），乌梅丸低剂量组（80 mg/kg WMW-L），乌梅丸高剂量组（120 mg/kg WMW-H）。结合前期预实验结果，证实本项目中采取博来霉素（bleomycin，BLM）诱导肺纤维化小鼠的实验方法真实可靠，具有可实施性[2]。
      小鼠肺纤维化模型制备：小鼠腹腔注射10%水合氯醛(5 mg/kg)麻醉后，仰卧位固定于手术板上，颈部消毒，剪开颈前皮肤，钝性分离暴露气管；NS组气管内注入无菌的生理盐水0.1 mL；Model组及其余各组气管内注入含BLM（2 mg/kg）的无菌生理盐水 0.1 mL；注射后立即将小鼠直立并适当旋转，使药物均匀分布于肺组织[3]，随机分为3组（Model组、WMW-L、WMW-H）。

4.2给药

      于造模后第2天开始进行灌胃给药干预，其中WMW-H组给药剂量为120 mg/kg，NS组、Model组灌胃等体积的生理盐水，WMW-L组给药剂量80mg/kg。每日一次，持续给药21d，动态观察给药7d，14天乌梅丸对PF进展的阶段性影响（炎症期与纤维化期），期间每日记录体质量变化。

5.取材与指标

5.1取材

      小鼠眼眶取血后，在-4℃、3000r/min条件下离心10min，收集上清液血浆，于-80℃保存备用。后断颈处死，取出肝脏、脾脏、胸腺及小肠，并剥离其他组织，迅速称重后，使用公式计算出小鼠脏器指数。
脏器指数=脏器质量÷体质量×100%

5.2小鼠肺组织湿/干（W/D）重比

      滤纸吸干左肺叶表面液体，去除脂肪，称量湿重（W）。然后将肺组织置于60℃恒温烘箱中，烘烤24 h后取出，再次称取肺组织的干重（D），然后计算肺组织的W/D重比。

5.3肺组织病理学监测

      取固定48h以上的小鼠肺组织，经过脱水、浸蜡、包埋、切片处理后的石蜡切片，按照HE、Masson试剂盒说明书进行染色。由两位同学运用双盲法进行阅片，每张切片随机选取5个不同视野，通过光学显微镜观察并采集肺组织病理形态图像，并根据相应标准[4]肺损伤进行评分。每个肺组织样本使用5分量表评分标准：0分，最小损伤；1，轻度损伤；2分，中等损伤；3分，重度损伤；4分，最大损伤。将各项分数相加，得到总分数，该数值表示肺损伤评分，最高为12分。
      将小鼠肺组织切片顺次放入二甲苯中脱蜡处理并通过梯度乙醇溶液逐步水化，Weigert 铁苏木素染色后酸性乙醇分化，Masson蓝化液返蓝后丽春红品红染色，磷钼酸溶液洗后滴加苯胺蓝染色液，乙醇脱水和二甲苯透明后用中性树胶封固。由两位同学运用双盲法进行阅片，每张切片随机选取5个不同视野，显微镜下观察拍照，使用Image J对阳性染色（呈蓝色）面积进行计量并分析结果。

5.4抗氧化相关指标检测

      检测肺组织与血清中T-SOD、MDA与GSH-PX含量，将小鼠血液静置2 h后进行离心，抽取上层血清，用生化试剂盒检测小鼠血清中MDA、T-SOD、GSH-PX的含量或活力，严格参照说明书进行，使用DNM-9602酶标分析仪，于对应波长下读取光密度（OD）值，根据标准曲线计算上述氧化应激因子含量或活力。

5.5高分辨率红外热像仪检测肺组织热量变化检测

      将环境温度控制在25±1℃，湿度保持在40-60%且无强气流干扰。紧接着使用黑体辐射源校准设备，确保温度测量准确性。然后将小鼠轻度麻醉并剃除背部毛发，体位固定成仰卧位，充分暴露胸腹部，静置10分钟，待呼吸平稳后检测。接着根据设备焦距调整20-30 cm的拍摄距离，垂直对准小鼠胸腹部连续拍摄3-5帧，取平均值减少呼吸运动干扰。最后保存原始热图（.jpg或专用格式）及温度矩阵数据（.csv），便于后续分析。

5.6 小鼠与临床样本血清脂质代谢组学检测

      血清样本处理：取100 μL血清于1.5mL的离心管中，加入300μL预冷的异丙醇，涡旋5 min 后，放入-20 ℃冰箱孵育1 h，14 000 r/min，4 ℃离心 20 min（离心半径为10cm），取上清至进样小瓶，待测。质控样品（QC）样本：从每个样本中取10μL血清至1.5mL的离心管中，涡旋 5 min，加2倍体积的异丙醇，同法处理，制备QC 样本。
      实验条件：仪器采用ABsciex6500+，方法为三重四极质谱仪的多反应监测（MRM），每个样品分别采用正负两种模式分析（不同模式监视不同离子对）。使用ACQUITYUPLCBEHC8 色谱柱（Waters，1.7 μm，2.1 mm×100 mm）进行液相色谱分离。流动相由水相（A）和有机相（B）组成，A相为水：甲醇：乙腈（3∶1∶1）+5 mmol/L 醋酸铵（质谱级），B 相为异丙醇+5 mmol/L 醋酸铵。梯度洗脱设置为：0~0.5 min，20%B；0.5~1.5 min，20%~40% B；1.5~3 min，40%~ 60% B；3~13 min，60%~100% B；13~14 min，100% B；流速0.3 mL/min，进样量为2 μL。质谱（MS）通用参数设置为：气温400℃，离子喷雾电压5500V，喷雾气（GS1）、辅助加热气（GS2）均为 50 psi，气帘气为35psi。
      数据处理：采用OS软件进行峰识别、脂质鉴定、 峰提取、峰对齐及定量等处理，提取得到的数据。对OS提取得到的数据，进行总峰面积归一化处理。将得到的数据矩阵导入SIMCA-P14.1软件，进行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS DA）、置换检验等多元统计分析。筛选差异代谢物的通用标准为：变量投影重要性值（VIP）>1，同时P< 0.05。其中P来源于单变量分析方法（t检验），而VIP 来源于多变量分析方法（OPLS-DA模型），物质的VIP 越大，说明该物质对造成组间差异的贡献度越大。

5.7小鼠肺组织中细胞因子mRNA表达检测

      取小鼠肺脏组织，加入RNA-easy Isolation Reagent充分裂解，然后使用Trizol法提取组织中的总RNA。测定样品纯度（A260/A280 =1.80~2.0）等于浓度后，使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。加入随机引物4 μL，样品5 μL，混匀后，在50℃下延伸15 min，80℃下静置5 min进行高温变性，随后加入相应引物进行实时逆转录聚合酶链（RT-PCR）反应，采用2-ΔΔCt法进行数据统计。β-actin、IL-6、IL-1β、TNF-α、α- SMA、mmp-2、TGF-β的引物序列见下表。
表1 Real-time RT-PCR引物序列
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5.8肺纤维化相关炎症因子检测

      按照ELISA 法测定与肺纤维化有关的各种炎症指标，如IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β等；以曲线方程计算各样品中各指标水平，并检测各组小鼠血清中炎症因子的含量。

5.9 Western blotting 检测小鼠肺组织中TGF-β、MAPK与ERS1/HIF-1α等蛋白的表达

      称取小鼠肺脏组织20 mg，置于冰上剪碎后，按照质量体积比1:9，加入相应体积的RIPA裂解液，使用组织研磨仪器提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。采用SDS-PAGE电泳（100 V，90~120 min）分离蛋白，湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素（NC）膜上（350 mA，45 min）；用封闭液封闭15 min；分别加入一抗（β-actin、TGF-β、NF-Bp65、phospho-NF-Bp65）（1:1000），在4℃下孵育过夜；之后用PBST（0.5% Tween-20）洗膜，再加入用辣根过氧化物酶标记的二抗（1:1000），室温下孵育1h；PBST洗涤5次后，使用ECL化学发光试剂盒进行化学发光检测；采用Image J软件进行数据分析。
1.肺纤维化病理机制与治疗研究现状

      肺纤维化（Pulmonary Fibrosis， PF）是一种以肺组织慢性炎症和细胞外基质过度沉积为特征的致命性疾病。其核心机制涉及肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞异常活化及免疫调节失衡[5]。雌激素受体1（ESR1）和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一，刺激MAPK信号通路可以激活TGF-β，而它是最主要的一种强效的致PF因子，ESR1通过抑制成纤维细胞的活化和增殖，减少细胞外基质的过度沉积，从而缓解PF。
      国内研究聚焦中医药干预，如黄芪甲苷通过抑制IL-17A/STAT3信号通路调节Th17/Treg平衡，显著减轻博来霉素诱导的小鼠PF。丹参酮IIA通过阻断上皮-间质转化（EMT）过程抑制成纤维细胞活化[6]。香青兰提取物通过调控肺组织PI3K-AKT信号通路抑制炎症反应干预肺纤维化[7]。补阳还五汤通过靶向PPARG/SPP41/CD44信号通路抑制肺纤维化[8]。柴胡皂甙-d通过调控PI3K/AKT通路缓解ECM的异常沉积和肺纤维化区域炎症因子的释放，改变ECM微环境，从而延缓肺纤维化的进展[9]。木犀草素，丹参酮Ⅱ可以很好的与EGFR、SRC等蛋白进行对接，从而发挥抗纤维化的作用。连翘苷通过抑制细胞凋亡来改善肺纤维化[10]。
      目前，抗纤维化药物如尼达尼布（Nintedanib）虽能延缓疾病进展，但存在肝毒性等副作用[11]，亟需更安全有效的替代疗法。数据表明吡非尼酮能够降低肺功能下降的速度，改变肺活量, 并且使疾病进展风险显著降低30%。从目前临床来看，西药治疗PF的疗效不甚理想，而中医药例在防治PF方面作用显著，毒副作用小，作用缓慢、持久的特点。

2.脂质代谢在肺纤维化中具有重要作用

      脂质成分在肺部功能的维持过程中起到至关重要的作用，脂质在肺组织中的过度积累会引发炎症和氧化应激，导致肺泡上皮细胞损伤，进而激活成纤维细胞，促进细胞外基质（ECM）沉积，暂时性积累的ECM成分会被机体清除，促使正常的细胞组织结构进行修复[12-13]。当损伤是严重的或是重复性的，ECM 将出现持续性的累积，这可能会导致组织结构的破坏，瘢痕化发生，组织或者器官产生纤维化，遗传、衰老、细菌或病毒性感染以及慢性炎症反应都会影响纤维化的发生和最终的修复[14]。因为ECM的积累可以促进成纤维细胞的增加，而激活TGF-β以及Rho/ROCK信号通路促进成纤维细胞的分化，成纤维细胞和异常 ECM 之间存在正反馈，这种正反馈循环促进纤维化的发展[15]。
      目前，这种疾病的发病机理尚未阐明，在临床上也缺乏有效的治疗手段。而肺部脂质组成的变化取决于脂质代谢的改变，由于脂质代谢在生物学过程中发挥着重要的功能作用，各种不同类型的脂质也在PF中被广泛研究，如鞘脂，溶血磷脂酸等[16-17]；脂肪酸氧化（FAO）是肺泡上皮细胞的主要能量来源，其失调会导致细胞能量供应不足，增加细胞凋亡和纤维化风险；还参与抗氧化防御，维持氧化还原平衡，减少氧化应激对肺组织的损害；FAO通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）调控基因表达[18]，影响纤维化相关基因的表达;通过能量供应、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡与自噬、基因表达调控等多方面影响肺纤维化的发展，深入理解其机制有助于开发新的治疗手段[19]。现有研究表明，促进FAO或抑制脂质积累的药物已在动物模型中显示出抗纤维化效果，调节脂质代谢可能成为PF的治疗策略。

3.ESR1与MAPK在肺纤维化脂质代谢中具有关键调控作用

      ESR1是雌激素的主要受体，属于核受体超家族，广泛分布于肺组织。它不仅调控生殖系统，还在脂质代谢和纤维化过程中发挥重要作用[20]。ESR1通过抑制TGF-β信号通路，减少胶原沉积和纤维化，并影响脂质代谢相关基因的表达，维持脂质稳态，减轻脂质代谢紊乱对肺组织的损伤；MAPK通路通过影响脂质代谢相关酶的活性，调控脂质合成与分解，影响肺纤维化中的脂质代谢[21]。MAPK通过调节SREBP和PPAR-γ，影响脂质合成和分解。MAPK通路激活NF-κB和AP-1，促进炎症因子释放，加重脂质过氧化和炎症。ESR1通过调控MAPK信号通路，影响成纤维细胞的活化和脂质代谢[22]。
     
      ESR1和MAPK在肺纤维化和脂质代谢中存在复杂的相互作用。ESR1通过抑制MAPK通路，减少炎症和纤维化反应；MAPK则通过磷酸化ESR1，影响其转录活性。两者共同调控TGF-α、SREBP和PPAR-γ等靶点，协同影响脂质代谢和纤维化。ESR1和MAPK在肺纤维化和脂质代谢中发挥关键作用[23]。ESR1通过抗炎、抗氧化和抗纤维化效应保护肺组织，而MAPK则通过加速炎症和促进纤维化效应加重损伤；两者通过交叉调控和共同靶点，协同影响疾病进程并深入研究其机制有助于开发新的治疗策略。
     
      ESR1和MAPK通过协同作用，抑制成纤维细胞的活化和炎症反应，减轻肺纤维化。调节脂质代谢两者共同调控脂质代谢相关基因的表达，维持脂质稳态，减轻脂质代谢紊乱对肺组织的损伤[24]。ESR1和MAPK在PF脂质代谢中具有关键调控作用，通过抗纤维化、抗氧化、抗炎及调节脂质代谢等机制，共同维持肺组织的稳态。

4.乌梅丸药理作用与抗纤维化研究进展

      乌梅丸出自《伤寒论》，由乌梅、细辛、黄连等十味中药组成，乌梅丸作为治疗厥阴病寒热错杂证的千古名方，具有温阳解郁、燮理阴阳之效[25-26]，其中正气虚损为乌梅丸证主要病因病机；现有研究表明乌梅丸可以治疗糖尿病、厥阴病、胆道蛔虫症、肠易激综合征结肠炎等。现代药理学研究表明，其活性成分如熊果酸、槲皮素和小檗碱具有显著的抗炎与抗氧化作用。张海明[27]等记载，乌梅丸是治疗PF的有效方剂，方中乌梅、细辛、干姜、花椒、桂枝、人参6味药入肺经，具有敛肺、温肺、补肺之功[28-29]。此外，乌梅丸临床还可用于治疗慢性阻塞性肺疾病、机化性肺炎等肺系疾病。体外实验证实，乌梅丸提取物可抑制LPS诱导的巨噬细胞M1极化，降低TNF-α和IL-6分泌。
在动物模型中，乌梅丸干预可显著改善二氧化硅诱导的大鼠肺纤维化，表现为肺组织羟脯氨酸含量下降及TGF-β表达抑制。网络药理学分析进一步揭示，乌梅丸可能通过调控IL-17、PI3K/AKT等信号通路干预纤维化进程[30]。乌梅丸在抗纤维化方面展现出潜力，其多成分、多靶点的作用机制为其临床应用提供了依据。未来需进一步研究其具体机制和临床应用，以推动其在抗纤维化治疗中的发展。

      综上所述，肺纤维化是具有显著组织损伤的炎性疾病，其极低的存活率引起了人们的广泛关注，且目前临床尚缺乏安全有效的治疗药物；而乌梅丸作为中医药经典名方，具有较好的抗炎作用且毒副作用少，对不同纤维化病理机制具有调控作用有重要的研究价值；所以本项目拟通过研究乌梅丸对肺纤维化脂质代谢异常关键病理的抑制作用，从“脂质代谢异常-慢性炎症”角度揭示其对肺纤维化主要信号通路ERS1/MAPK的调控作用，进而为其作为抗纤维化药物的临床使用和开发提供数据支持和理论依据。

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      乌梅丸作为经典名方，具有很好的抗炎作用，在干预肺纤维研究方向尚存在空白。本研究结合网络药理学、脂质代谢组学与动物实验，突破传统单一研究模式的局限性，多维度探究并并揭示乌梅丸干预肺纤维化的作用与机制。本项目主要以下三方面作为创新性与特色进行设计；
①以脂质代谢异常在肺纤维化病理进展中的关键作用为切入点，从脂质代谢相关氧化指标及信号通路首次探究经典名方乌梅丸对肺纤维化的作用及机制。
②基于网络药理学筛选乌梅丸抗肺纤维化活性成分及核心靶点，UHPLC-Q-Orbitrap HRMS定性分析鉴定乌梅丸化学成分，结合动物实验验证其对肺纤维化关键病理环节脂质代异常的调控作用，揭示其“多成分﹣多靶点﹣多通路”协同机制。
③网络药理学（干实验）预测与动物实验（湿实验）、临床样本结果验证相结合，提高研究效率与可靠性。
1.技术路线
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2.拟解决的关键问题

2.1乌梅丸干预肺纤维化的药效物质基础及作用靶点不明确。

2.2网络药理学预测的通路与靶点是否在动物模型中具有生物学意义。

2.3乌梅丸能否通过调控ESR1/MAPK信号通路影响脂质代谢延缓肺纤维化疾病进展。
项目研究进度安排
2024年4月-2024年7月为该项目的准备阶段：
1.查阅国内外关于乌梅丸及肺纤维化治疗的最新研究成果，总结当前研究现状。明确项目研究目标、内容、技术路线及预期成果。与指导老师沟通，评估项目的创新性和可行性，完善项目计划；
2.制定详细的实验方案，包括乌梅丸的制备、动物模型的构建、给药方案等。采购实验所需的药材、试剂、动物等，确保实验材料充足；
3.制定实验计划并进行组员合理分配。
2024年9月-2024年11月为该项目的实施阶段：
1.制备乌梅丸混悬液
2.将乌梅、细辛、干姜、黄连、当归、炮附子、炒蜀椒、桂枝、人参、黄柏煎煮，旋转后，冷冻干燥机冻干，粉末保存于干燥器。将一定量的冻干粉加入适量生理盐水制成混悬液；
3.构建肺纤维化小鼠模型，造模成功后分组给药；
4.给药结束后，取材进行HE染色观察小鼠肺组织病理变化及纤维化情况。RT-PCR结合2-ΔΔCt法来检测小鼠肺脏组织中细胞因子mRNA的表达水平，DNM-9602酶标分析仪，检测肺组织于血清中氧化相关因子的表达，FCM法检测免疫细胞的表达，ELISA法检测小鼠血清中的炎症因子水平，Western blot检测肺组织中的特定蛋白表达；
5.进行三次重复实验，使实验结果更加可靠。
2025年1月-2025年3月为该项目的总结评估验收阶段：
1.全面归纳实验结果，本研究表明。乌梅丸对博来霉素诱导小鼠肺纤维化有抑制作用，但其修饰后结构的改变有待探索，分析实验过程中存在的问题和不足，为项目进一步研究做准备；
2.整合实验数据和分析结果，撰写研究论文；
3.编写项目结题报告，总结项目执行情况、研究成果及创新点。
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
1.1 乌梅丸干预肺纤维化网络药理学预测
① 乌梅丸成分-靶点网络构建
      乌梅丸有效成分靶点通过 Uniprot 数据库转化去重后，共得到了203个相关靶点（图 1），主要有效成分有A1、B1、C1等（表2）
表 2乌梅丸有效成分
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图 1乌梅丸有效成分作用靶点

②乌梅丸与PF交集靶点与PPI 网络图构建

      通过 GeneCards数据库，获得肺纤维化的疾病靶点有 2386 个。经 Venn 图制作得乌梅丸有效成分与肺纤维化的交集靶点有 133个（图2）。绘制为PPI 网络图；其中度值前八的靶点为MAPK1、RELA、IL-6、TNF、ESR1、TP53、BCL2、AKT1。 TP53是PPI 网络中度值最高的节点，它是一种肿瘤抑制蛋白，在氧化应激条件下低浓度 TP53 抑制氧自由基的产生，高浓度的 TP53 促进 ROS 的产生，AKT1 是 PI3K-Akt 通路的关键节点，在氧化应激的发展中有重要作用；TNF 是炎症的信号蛋白，可诱导 ROS 的产生，加重器官损伤，进一步诱发氧化应激反应； ESR1 是 NR3 亚家族成员，在细胞的增殖分化中具有重要作用，也可以抑制氧化应激损伤。
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图2网络药理学和靶点筛选：（A）交集靶点的韦恩图；（B）交集靶点蛋白-蛋白PPI互作网络图，网络由STRING数据库构建；（C）基于Degree、Eigenvector、Subgragh、Closeness值的前8个节点

③GO 与 KEGG 通路富集

      GO 生物功能与 KEGG 通路富集结果（图 3），圆圈的大小和颜色得深浅代表了富集的显著性，圆圈越大，颜色越深代表了富集越显著。GO 富集后，得到生物过程（BP）条目，主要涉及细胞对脂质的反应、对异种刺激的反应、对细菌源分子的反应、对生长因子的反应等；细胞组分（CC）条目，主要涉及转录调节因子复合物、膜筏、膜侧、质膜蛋白复合物、分泌颗粒管腔等，分子功能（MF）条目，主要涉及蛋白激酶调节活性、激酶调节剂活性、细胞因子受体结合等；KEGG 富集分析得到主要有癌症的通路、脂质和动脉粥样硬化通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路等。这提示乌梅丸是多通路，多靶点治疗肺纤维化。上述通路和生物功能大多与脂质相关，提示脂质可能是乌梅丸治疗肺纤维化的关键。
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图3 GO和KEGG富集分析：（A）GO分析；（B）KEGG分析

④分子对接

      运用Schrodinger对 8个核心靶点 MAPK1、RELA、IL-6、TNF、ESR1、TP53、BCL2、AKT1， TP53和 3个关键活性成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇进行分析，结果见图4。乌梅丸2个关键活性成分和2个核心靶点的结合能均 < −7 kcal/mol，表明乌梅丸活性成分与肺纤维化核心靶点具有良好的结合能力，具有潜在抗纤维化能力。
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图4 乌梅丸主要活性成分与作用靶点的分子对接：（A）分子对接结合能（B）MAPK1与槲皮素、山奈酚的分子对接可视化（C）MAPK1与槲皮素、山奈酚的分子对接可视化

⑤乌梅丸具有较好的抗肺纤维化作用

      HE 染色结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肺泡结构被破坏，肺泡间隔增宽，炎性细胞浸润明显；与模型组相比，乌梅丸高剂量和低剂量组小鼠肺泡间隔较薄，实变程度和炎性浸润程度较模型组明显减轻，见图 5-6。Masson 染色结果显示，对照组小鼠肺组织结构完整，肺泡间隔中胶原纤维沉积较少；模型组中大鼠肺泡结构被破坏，肺泡壁变厚，肺泡之间的距离明显增宽，并且可见蓝色的
条索状胶原纤维明显沉积；经过乌梅丸干预后，可观察到乌梅丸低剂量组与高剂量组中大鼠肺组织中蓝色胶原纤维减少，肺泡结构紊乱程度降低。见图 5-6。
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图5乌梅丸对PF小鼠肺组织与肠组织的影响

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图6 基于 Masson染色结果分析纤维化面积
注：****P <0.0001vsControl，&&&&P <0.0001vsBLM

⑥乌梅丸显著抑制肺纤维化关键因子IL1-β和TGF-β的mRNA表达

      实时荧光定量PCR分析显示，博来霉素（BLM）模型组小鼠肺组织中TLR-4 mRNA相对表达量较空白组（Control）显著上调，同时IL1-β与TGF-β表达水平也呈现升高。经乌梅丸低剂量（WMW-L）与高剂量（WMW-H）干预后，TLR-4、IL1-β、TGF-β表达均出现降低，但IL1-β高剂量组较低剂量组表达量增高。
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图7A.乌梅丸对PF小鼠肺组织IL1-β的mRNA的表达量的影响；B.乌梅丸对PF小鼠肺组织TGF-β的mRNA的表达量的影响

⑦乌梅丸显著抑制肺纤维化关键蛋白TGF-的表达
     
      TGF-广泛存在于人体的正常细胞中，具有多种抗炎、免疫调节等多种生物学作用，是各种组织和器官形成纤维化的关键因子。能诱导胶原mRNA的产生，使细胞外基质的胶原合成增加并在肺内沉积，从而导致肺纤维化的发生。因此TGF-β表达量与肺纤维化程度呈正相关。本项目研究结果显示乌梅丸能显著抑制肺纤维化关键蛋白TGF-β的表达。
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图8 乌梅丸对PF小鼠肺组织TGF-β蛋白的影响

⑧乌梅丸干预肺纤维化与能量代谢关系密切

      能量代谢与肺纤维化的发生发展关系密切，肺纤维化患者肺线粒体功能被抑制，且糖酵解作用增强，乳酸生成增加，造成能量代谢与肺组织温度异常。热成像与热成像数据结果显示（图7）乌梅丸能显著改善肺纤维化小鼠肺部温度，表明乌梅丸干预PF与能量代谢关系密切，结合现有文献对脂质代谢异常在PF中的关键作用，本项目将结合已有研究结果就脂质代谢具体改变进一步进行探究，并揭示其作用机制。
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图9小鼠肺温度：A.小鼠热成像图；B.乌梅丸对PF小鼠肺温度的影响
注：****p<0.0001vsControl，&&&&p<0.0001vsBLM

   
已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法

1.开展本项目所需的动物饲养条件及相关检测单位科研平台已经完全具备。

2.脂质代谢检测分析，需要与合作单位共同进行。（前期已经与检测技术较为成熟且信誉良好的检测公司开展过相关合作，可保证本项目研究结果的真实可靠性。）

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 实验试剂购买、动物购置、论文发表 15000.00 5000.00
1. 业务费 10000.00 试剂费用、测试费用 5000.00 5000.00
（1）计算、分析、测试费 5000.00 脂质组学检测 5000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 5000.00 论文发表费用 0.00 5000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 10000.00 SOD等检测试剂盒购置、IL-6与TGF-d等ELISA kits购置、PCR等其它实验用试剂及耗材购置 10000.00 0.00
结束

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