FBXO6 在食管癌发生发展中的作用及其机制研究

申报人：张峻豪申报日期：2025-03-22

基本情况

所属批次:

2025创新项目

项目名称:

FBXO6 在食管癌发生发展中的作用及其机制研究学生申报

项目类型:

创新训练项目

所属学科门类:

医学

所属专业类:

基础医学类

项目来源名称:

学生来源于教师科研项目选题

项目归属学院:

项目期限:

二年期

项目简介:

FBXO6 基因是 E3 泛素酶蛋白家族成员之一，其分布非常广泛几乎在所以细胞中都有表达。统计分析，表明 FBXO6在多种肿瘤组织中表达异常，而食管癌是常见的恶性肿瘤之一，FBXO6 在食管癌中的作用尚不明确，本项目将研究 (1)检测 FBXO6 在人食管癌组织和细胞的表达（蛋白质水平和mRNA水平）； (2)构建 FBXO6 稳定表达和 CRISPCas9 基因敲除细胞系，检测 FBXO6 对食管癌细胞生物学行为的影响； (3)利用 FBXO6 稳定表达和 FBXO6基因敲除细胞株，进行移植瘤实验，探讨FBXO6 在食管癌中的作用，为食管癌的治疗提供新策略。

负责人曾经参与科研的情况:

自 2024 年 3 月开始利用课余时间跟随精准医学院研究院王姗姗老师和杜峰老师学习实验技术，现已掌握荧光定量 PCR 技术、分子克隆、食管癌细胞培养、 Western blot 等实验技术，对肿瘤生物学研究有浓厚的兴趣。

指导教师承担科研课题情况:

本项目指导教师王姗姗主持项目包括国家自然科学基金，山东省自然科学基金，山东省医药卫生科技项目，济宁医学院培育项目，贺林院士新医学临床转化工作站科研基金，济宁医学院青年教师扶持基金等6 项，参与国家自然科学基金 1 项，参与山东省自然科学基金项目 2 项和山东省医药卫生科技项目 1 项。

本项目指导教师杜峰主持项目包括山东省自然科学基金，济宁医学院培育项目，贺林院士新医学临床转化工作站科研基金，济宁医学院青年教师扶持基金等，参与山东省自然科学基金项目1项。

指导教师对本项目的支持情况:

(1) 指导教师所在精准医学研究院现有流式细胞仪、体视显微镜、Bio-Rad 梯度PCR 仪、罗氏荧光定量 PCR 仪、Bio-Rad 电泳仪、Bio-Rad 凝胶成像仪、Nikon 倒置显微镜、Nikon 荧光倒置显微镜、超净工作台、恒温摇床、液氮罐、超声破碎仪、高速冷冻离心机、低速冷冻离心机、酶标仪等常规设备。研究院的病理学实验室、细胞生物学实验室、生物化学与分子生物学实验室、 SPF 级动物房、生物样本库等研究平台。研究院的实验平台和仪器设备能够支持本项目的顺利完成。

(2) 指导教师已熟练掌握本项目所需的实验技术包括慢病毒表达载体的构建和稳定细胞株的筛选，CRISPR/Cas9 基因敲除技术，荧光定量 PCR 的检测，免疫荧光实验、免疫组化实验，免疫共沉淀以及流式细胞技术等，可为本项目提供理论知识和技术指导。

项目级别:

校级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	张峻豪	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2023	细胞生物行为实验	第一主持人
2	王庆华	口腔医学院	口腔医学（本科）	2024	移植瘤实验和蛋白相互作用实验	成员
3	关桐然	中西医结合学院	中西医临床医学（本科）	2024	慢病毒包装、FBXO6稳定/基因敲除细胞株的构建	成员
4	李媛媛	临床医学院（附属医院）	临床医学(本科)	2024	Western Blot，免疫组化	成员

指导教师

序号	教师姓名	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	王姗姗	精准医学研究院	否	第一指导教师
2	杜峰	基础医学院	否	指导教师

立项依据

研究目的:

食管癌是常见的一种恶性肿瘤疾病，据相关的数据统计表明，食管癌的死亡率，在我国恶性肿瘤死亡率的第二位，其中河北省的食管癌比较严重，占到了恶性肿瘤死亡率的第一位，对于恶性肿瘤的处理，主要以预防为主，在发病的早期发现，患者被治愈的几率超过90%，而由于食管癌的预后存活率较差，常规的手术治疗、化疗、放疗等手段难以对肿瘤转移进行有效逆转，所以筛查早期诊断标志物和阐明食管癌的发生和发展的分子机制对临床治疗尤为重要。初步分析TCGA（The Cancer Genome Atlas）相关数据，发现FBXO6在多种肿瘤组织都显著上调表达，FBXO6在人食管癌组织中亦显著上调表达。FBXO6在不同病理期的临床病人食管癌组织有明显上调表达，随着病人病情的发展，FBXO6表达呈现明显递增趋势，预测FBXO6可能是食管癌不同病理期检测的新的肿瘤标志物。

故本项目将探究FBXO6 在食管癌不同阶段病理组织中的差异表达，与临床病理及病人预后的相关性。探索FBXO6在食管癌发生和发展中的功能及其潜在机制。以明确其作为新的诊断标志物和肿瘤靶向治疗的价值。

研究内容:

（1）检测 FBXO6 在人食管癌组织中的表达

利用实验室收集的200例食管癌临床病理冰冻样本和从公司购买的商品化食管癌组织芯片进行实验，分别检测FBXO6在不同病理阶段组织样本中的差异表达，选择不同临床病理特征的临床样本包括病人的病理分期（I-IV期）、分级、生存期及5年存活率等进行免疫组化染色，参照病人的随访资料，绘制FBXO6的差异表达与临床病理分级分期以及生存期之间的相关性曲线，揭示FBXO6在食管癌发生发展中的临床意义。

（2）检测 FBXO6 在人食管癌细胞中的表达

① 食管癌细胞株的筛选：利用精准医学研究院实验室提供的 8 株人的食管癌细胞株：EC109、TE10、TE8、TE11、OE33、KYSE150、KYSE410、KYSE450等，分别在mRNA 水平（Q-PCR实验）和蛋白水平检测 FBXO6 在食管癌细胞内的表达，前期通过荧光定量PCR实验检测发现，FBXO6 在TE11和TE8 食管癌细胞中相对表达高细胞株，在KYSE450和KYSE410细胞中相对低表达。

② 构建稳定表达细胞株：利用慢病毒载体 pL-EH- FBXO6-Flag-puro，在293T 细胞内包装表达 FBXO6 的慢病毒，收集病毒液，分别侵染KYSE450和KYSE410细胞，通过嘌呤霉素筛选稳定表达FBXO6的细胞株，。

③ CRISPR/Cas9 基因敲除细胞株的筛选：使用 CRISPR/Cas9 设计网站设计

FBXO6-sgRNA 序列，设计的 sgRNA 长度为 20bp，选取 3 个高分 sgRNA 序列送上海生物工程公司合成 oligo 。构建 pSpCas9(BB)-2A-puro-sg FBXO6 质粒和对照组质粒。在TE11和TE8 食管癌细胞内，通过嘌呤霉素筛选 FBXO6 敲除细胞株用于实验。

（3）明确 FBXO6 对食管癌细胞生物学行为的影响

① 细胞增殖：在 FBXO6 稳定表达细胞株/敲除细胞株内，通过CCK8 试剂或者EDU实验，检测过表达或者敲除FBXO6 对食管癌细胞增殖的影响。

②细胞迁移和侵袭：在 FBXO6 稳定表达细胞株/敲除细胞株内，通过 Transwell小室实验或划痕实验检测 FBXO6 对细胞迁移和侵袭的影响。

③ 细胞周期：在 FBXO6 稳定表达细胞株/敲除细胞株内，利用细胞周期试剂对细胞进行标记染色，通过流式细胞仪检测 FBXO6 对细胞周期的影响。

③ 细胞凋亡：在 FBXO6 稳定表达细胞株/敲除细胞株内，利用细胞凋亡试剂对细胞进行标记染色，通过流式细胞仪检测 FBXO6 对细胞凋亡的影响。

（4）探讨 FBXO6 在食管癌发生发展中的作用及其机制

① 选择从医院收集的新鲜临床食管癌组织及其癌旁组织，分别提取蛋白，进行FBXO6蛋白的免疫共沉淀实验（Co-IP），收取蛋白胶条进行蛋白质谱检测，筛选与FBXO6相互作用的蛋白。

② 根据蛋白质谱测序结果筛选蛋白，利用双荧光素酶报告细胞和Co-IP进一步检测，筛选与FBXO6相互作用的关键靶蛋白,构建FBXO6截短体，通过Co-IP实验检测FBXO6与靶蛋白相互作用区域。加入MG132/CHX，利用体内体外泛素化实验，研究FBXO6与其靶蛋白在食管癌发生发展中的作用及其机制。

③小鼠移植瘤实验利用筛选的FBXO6稳定表达细胞株和基因敲除FBXO6细胞株，采用皮下注射方法进行裸鼠成瘤实验，待其成瘤后，定期对小鼠肿瘤进行测量，绘制小鼠肿瘤生长曲线；收取肿瘤组织利用免疫组化和Western blot方法检测FBXO6及其靶蛋白的表达变化，研究在裸鼠体内FBXO6对肿瘤生长的影响。

国、内外研究现状和发展动态:

食管癌（Esophageal cancer，EC），是全球范围内常见的恶性肿瘤，是导致癌症死亡的主要原因之一，食管癌在世界各类肿瘤中发病率位居第７位，死亡率位居第６位。食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma，EAC）是两种主要的组织学亚型，我国食管癌患者组织学亚型以鳞状细胞癌为主。2020 年新诊断病例为60.4万例，其中，中国的食管癌患者占全球食管癌患者的50% 以上。近年来新发病例和死亡人数仍在持续增加，食管癌的防控形势非常严峻。

早期食管癌缺乏明显的临床症状，且尚无特异性高的生物标志物。因此，食管癌通常在局部晚期或者晚期才被诊断出来，错过了最佳早期手术治疗的机会，即使采取手术干预，也很难获得良好的预后。局部晚期食管癌患者术后５年存活率20%～35%，而晚期食管癌患者生存率则更差。食管癌是一种环境相关性肿瘤，多因素作用、多基因参与、多阶段发展的复杂性疾病。所以，筛选食管癌早期生物标志物，探讨食管癌发生和发展分子机制对临床治疗至关重要，用于降低食管癌的发病率，改善食管癌患者的预后，延长食管癌患者的生存期。本项目将重点探究食管癌组织中FBXO6 在肿瘤发生发展中的作用，以明确其作为新的诊断标志物或靶向治疗的价值。

泛素-蛋白酶体系统是生命体内最常见的蛋白降解方式之一，参与DNA 修复、分子信号转导、细胞生长及分化等细胞生命活动。泛素分子经E1泛素激活酶活化、E2泛素结合酶呈递和E3 泛素连接酶的特异性识别作用最后将泛素分子连接到底物的赖氨酸残基上。F-box蛋白是SKP1- Cullin1-F-box蛋白E3泛素连接酶复合物中不可或缺的底物识别亚单位，并且与肿瘤发生和进展相关。根据其底物结合结构域不同主要分为三个亚家族：FBXW（带有WD40基序的F-box）、FBXL（带有LRR基序的F-box）和FBXO（仅有F-box）亚家族。不同的F-box 蛋白在各种细胞生物反应及信号通路中发挥不同的重要作用。

FBXO6蛋白是 F-box 蛋白家族成员之一，该家族成员与结合蛋白Skp1、骨架蛋白Cullin类蛋白、Ring-finger家族和Rbxl蛋白组成SKP1-CUL1-F-box（ SCF）E3 复合物，在泛素-蛋白酶体（ubiquitin-Proteasome system, UPS）途径中介导SCF复合物特异性的识别并降解底物，在调控细胞周期、转录、信号通路传导等过程发挥关键作用。研究表明，FBXO6能通过其FBA结构域识别糖基化蛋白，参与调控糖蛋白的内质网相关降解（ERAD）。研究发现，在卵巢癌中，FBXO6可以介导RNASET2的泛素化和降解，影响卵巢癌的发展,而UPS18在卵巢癌中可以通过FBXO6的转录调控发挥促癌作用，沉默FBXO6会显著削弱USP18在卵巢癌细胞种的促增殖功能。在非小细胞肺癌中，FBXO6可以通过抑制Chk1的活化导致顺铂药物细胞敏感性，在乳腺癌研究中，FBXO6可以调节Chk1的泛素化和降解，使肿瘤细胞对抗癌治疗产生耐药性。在宫颈癌中，HSP90可以通过减少FBXO6介导的CD147多聚泛素化，促进宫颈癌细胞的放射抗性。在结直肠癌和胃癌中，RIOK1甲基化可以减少小鼠模型中的肿瘤生长和转移。FBXO6可以通过其FBA结构域特异性的与K411甲基化的RIOK1相互作用，诱导RIOK1的泛素化。文献报道，FBXO6在宫颈癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌以及骨肉瘤中作为新生标志物与预测肿瘤患者预后有关。

创新点与项目特色:

（1）统计分析TCGA数据库发现FBXO6在几十种肿瘤组织都有显著上调表达，我们前期预实验发现在Ⅰ-Ⅳ期的人食管癌组织FBXO6呈差异性表达，在食管癌组织中研究FBXO6的差异表达与其临床病理特征及预后生存的相关性，将为食管癌的早期诊断和治疗提供临床依据。

（2）本项目分别从临床组织样本、食管癌细胞和小鼠移植瘤实验三个方面研究FBXO6在食管癌发生发展的作用及其机制，以转化医学研究为目标，力图实现基础研究与临床应用的有机结合。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

技术路线(1): 研究食管癌组织中FBXO6表达与临床病例特征的相关性

技术路线(2): 研究FBXO6在食管癌发生发展中的作用及其机制

拟解决的问题：

（1）在食管癌发生、发展过程中，FBXO6的表达如何变化，以及这些变化对食管癌的发生发展有何病理学意义。

（2）通过蛋白质谱检测，筛选与FBXO6相互作用的靶蛋白，探索FBXO6与其靶蛋白之间的相互作用，揭示FBXO6与靶蛋白通过何种分子机制参与食管癌的发生发展过程，将为食管癌的靶向治疗提供新策略。

预期成果：

（1）研究 FBXO6 在人食管癌发生发展中的作用，为食管癌早期诊断和治疗提供新策略。

（2）培养大学生的科研理论知识和实验操作技能，提高学生的科研积极性。

（3）预期发表论文 1-2 篇。

项目研究进度安排:

2025.06-2025.08 利用荧光定量 PCR 方法和 Western blot 方法分别在 RNA 水平和蛋白水平检测8 株食管癌细胞内 FBXO6 的表达，筛选FBXO6相对高表达细胞株和FBXO6相对低表达细胞株。

2025.09-2024.12 利用慢病毒载体包装病毒，侵染和筛选食管癌细胞，构建FBXO6稳定表达和基因敲除细胞株用检测FBXO6对食管癌细胞的生物学行为（细胞增殖、细胞迁移和侵袭、细胞周期、细胞凋亡等）的影响。

2026.01-2026.05 利用FBXO6稳定表达和基因敲除细胞株进行小鼠移植瘤实验，测量肿瘤大小，检测FBXO6对小鼠移植瘤生长的影响。

2026.06-2026.12 在 FBXO6 稳定表达和敲除表达细胞株检测 FBXO6 与靶蛋白相互作用，加入MG132或者CHX，通过泛素化实验，检测FBXO6与靶蛋白相互作用的机制，明确FBXO6在食管癌发生发展中的作用。

2027.01-2027.06 分析数据汇总，写作文章，并完成项目结题。

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

① FBXO6在肿瘤组织中的表达

利用生物信息学数据库 TCGA（The Cancer Genome Atlas）对FBXO6相关数据进行统计分析，我们发现 FBXO6 在多种肿瘤组织都有显著上调表达，在食管癌组织中亦上调表达。

图1 FBXO6 在不同肿瘤中的表达

我们利用公共数据库对FBXO6在食管癌中的表达及与肿瘤分期、分级等进行了分析，与正常食管癌组织相比，FBXO6在食管癌组织中的表达普遍升高；在不同病理分期（I-IV期）的组织中，FBXO6在IV组织中表达最高；而随着食管癌病理分级升高，FBXO6的表达呈下降趋势；FBXO6在食管癌组织中的表达与性别、年龄、吸烟以及TP53突变等因素无显著相关性。

图2 FBXO6 在正常组织和食管癌组织的差异表达

图3 食管癌组织FBXO6的表达与病理分期、分级等的相关性分析

(A）FBXO6 在不同分期食管癌组织中的表达；（B）FBXO6 在不同分级食管癌组织中的表达；

（C）FBXO6 在不同性别食管癌组织中的表达；（D）TP53突变对FBXO6在食管癌组织中表达影响不显著。

② FBXO6在8种食管癌细胞中的表达

利用实验室现有的8株食管癌细胞，提取细胞RNA和蛋白，分别进行RT-PCR和Western blot 实验，从RNA水平和蛋白水平分别检测FBXO6在8株食管癌细胞的表达，结果发现FBXO6在TE11和TE8细胞表达相对较高，设置为相对高表达组，FBXO6在KYSE450细胞和KYSE410细胞内表达相对较低，设置为相对低表达组。

图4 荧光定量PCR检测FBXO6在8种食管癌细胞中的差异表达

③食管癌细胞中FBXO6转录组测序结果

图5 在食管癌细胞中FBXO6影响的上调及下调基因

在食管癌细胞外源表达FBXO6蛋白，收取实验组和对照组细胞样品进行转录组（RNA-seq）测序，已筛选出显著上调表达基因2671个和下调表达基因478个，综合分析测序结果，发现在食管癌细胞内外源表达FBXO6能影响大约100多条信号通路相关基因的差异表达。

图6 FBXO6影响的基因富集相关信号通路

本项目前期统计分析 TCGA 数据库相关数据，发现 FBXO6 在多种肿瘤组织高表达，FBXO6 在食管癌组织中亦高表达，FBXO6 在食管癌组织中的表达与临床病理分期呈正相关，与临床病理分级呈负相关。本项目将充分利用研究院提供8种食管癌细胞、临床食管癌组织以及移植瘤小鼠，探究FBXO6在食管癌发生发展中的作用，以明确其作为新诊断标志物或靶向治疗的价值。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

本项目将在精准医学研究院进行，在学校和附属医院的强力支持下，研究院已经建成完善的病理学实验室、分子生物学实验室、生物化学实验室、细胞培养室、SPF级动物房、食管癌临床样本库等研究平台。尤其是依托于学校附属医院收集的附带有病人随访资料的临床病理样本，为本项目的研究提供便利和保障。

本项目团队成员是由 2个临床专业、1个口腔专业、1个中西医临床专业的同学共同组成，本项目团队成员搭配合理，各自发挥跨专业优势特长，相互协作，共同完成本项目的各项实验。

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	20000.00	本项目实验经费	10000.00	10000.00
1. 业务费	6000.00	论文发表版面费	0.00	6000.00
（1）计算、分析、测试费	0.00	无	0.00	0.00
（2）能源动力费	0.00	无	0.00	0.00
（3）会议、差旅费	0.00	无	0.00	0.00
（4）文献检索费	0.00	无	0.00	0.00
（5）论文出版费	6000.00	用于论文发表	0.00	6000.00
2. 仪器设备购置费	0.00	无	0.00	0.00
3. 实验装置试制费	0.00	无	0.00	0.00
4. 材料费	14000.00	购买抗体，细胞培养基及耗材等	10000.00	4000.00

结束

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