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休眠细胞磷脂酸代谢异常在涎腺腺样囊性癌化疗耐药中的作用及机制探究

申报人：常远 申报日期：2025-03-22

基本情况

2025创新项目
休眠细胞磷脂酸代谢异常在涎腺腺样囊性癌化疗耐药中的作用及机制探究 学生申报
创新训练项目
医学
口腔医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
涎腺腺样囊性癌（SACC）发病隐匿，但药物敏感性差且复发转移率高，故患者预后不佳。我们前期研究发现SACC中存在大量DEC2+休眠细胞，其药物敏感性显著降低并与患者的不良预后密切相关；进一步筛选发现，DGKH是DEC2的下游结合靶点，基于DGKH是细胞磷脂酸代谢的重要调控因子，我们提出科学假设：休眠细胞中DEC2通过靶向调控DGKH的表达水平导致胞内磷脂酸代谢异常，进而增强其化疗耐药性，最终导致预后不良。围绕此假设，本项目拟分析SACC组织中DEC2+休眠细胞、DGKH表达与化疗耐药的相关性；建立 体内外休眠模型，深入探究休眠细胞中DEC2/DGKH信号轴通过调控磷脂酸代谢导致SACC化疗耐药的作用机制，从而在细胞休眠状态下通过对下游因子的调控改善化疗敏感性，以期为SACC的临床治疗提供新靶点。
   负责人为口腔医学专业2022级学生，2024年曾赴山东大学基础医学院免疫学实验室参与项目研究，学习DNA提取，PCR，WB，Elisa等技术，在实验室学习过程中积极投入查阅文献、实验设计和实验操作等工作。负责人在实验室中充分积累经验，已具备的情况了一定的收集数据、提炼信息、独立思考和创新的能力。负责人曾作为项目组成员参加了2024年大学生创新训练计划项目《负载白芨多糖的壳聚糖基水凝胶作用于复发性口腔溃疡的作用机制及临床意义》。

一、国家自然科学基金青年项目，昼夜节律紊乱调控DEC2+休眠细胞磷脂酸代谢在唾液腺腺样囊性癌不良预后中的作用及机制研究，82403626，30万，在研，主持。

二、国家博士后基金面上项目，BHLHE41+休眠细胞通过TRIM31/MAVS/ NLRP3信号通路降低涎腺腺样囊性癌化疗敏感性的机制研究，2023M731306，8万，已结题，主持。

三、山东省自然科学基金青年项目，DEC2/Slug异常表达致唾液腺腺样囊性癌化疗耐药的分子机制，ZR2023QH390，15万，在研，主持。四、济宁市重点研发计划，DEC2+休眠细胞通过TRIM22/TAB2/NF-κB信号轴促进唾液腺腺样囊性癌进展并降低化疗敏感性的机制研究，2023YXNS，1万，在研，主持。五、济宁医学院附属医院博士科研基金，DEC2调控的肿瘤休眠对唾液腺腺样囊性癌化疗敏感性的影响及机制研究，2021-BS-023，40万，在研，主持。

在课题设计和完成过程中给予技术支持及帮助。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
常远 口腔医学院 口腔医学（本科） 2022 文献查阅，实验实施
韩佳慧 口腔医学院 口腔医学（本科） 2022 文献查阅，实验实施
刘若萱 口腔医学院 口腔医学（本科） 2022 数据整合，实验实施

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
杨肖 口腔医学院 否

立项依据

本项目拟在前期研究的基础上，进一步阐明休眠细胞中DEC2通过靶向调控DGKH导致其磷脂酸代谢异常，进而促进涎腺腺样囊性癌化疗耐药的功能效应和临床意义；通过体内外实验验证化疗药物联合使用DGKH抑制剂能够有效降低涎腺腺样囊性癌的耐药性，降低复发转移率，进而改善患者预后的科学假说；并根据上述实验结果，为涎腺腺样囊性癌预后预测和临床治疗奠定一定的理论基础。
第一部分：SACC组织中DEC2+休眠细胞与DGKH表达及化疗耐药的相关性
①采用免疫组化检测SACC组织样本中DEC2、休眠标记物、DGKH以及多药 耐药基因之间的相关性；②收集患者的新鲜离体肿瘤组织及癌旁正常的涎腺组织，利用基因测序技术分离筛选休眠与增殖细胞，检测休眠细胞群与正常增殖的细胞群之间，基因表达水平的差异；③分析DEC2和DGKH与患者临床病理指标和预后的相关性。
第二部分：DEC2诱导的细胞休眠在SACC化疗耐药中的作用
1、利用慢病毒载体或shRNA构建DEC2过表达或沉默的SACC细胞株，进一步：①验证细胞的休眠表型（增殖、周期、凋亡和衰老）及休眠标志物的表达水平；②顺铂处理DEC2+休眠细胞、shDEC2细胞以及对照组细胞，检测细胞 增殖、周期、凋亡、衰老和IC50的差异；③检测耐药相关基因的表达变化；④检测细胞迁移、侵袭以及耐药性等生物学行为的变化。
2、筛选并明确DEC2/DGKH轴：①将DEC2过表达及对照组细胞进行转录测序以及Cut/Tag检测并将两种结果结合分析，以筛选共同差异表达的基因；②qRT-PCR和WB验证DEC2/DGKH、MDR1的mRNA及蛋白表达水平；③检测细胞的磷脂酸代谢水平；④分别给予细胞化疗药物或化疗药联合DGKH抑制剂诱导，进一步检测细胞迁移、侵袭能力、化疗敏感性和磷脂酸代谢水平的变化。
3、利用药物浓度逐步递增法诱导SACC细胞系以构建稳定耐药的细胞株，进一步：① 检测耐药细胞中DEC2、DGKH和MDR1的表达变化；②检测细胞的磷脂酸代谢水平；③在耐药细胞中敲减DEC2并检测细胞耐药能力的改变；④分别给予细胞化疗药物或化疗药联合DGKH抑制剂诱导，检测药物敏感性变化。
第三部分：DEC2/DGKH轴调节SACC化疗耐药的分子机制
1、在前期筛选得到DGKH为DEC2下游调控的靶基因的基础上，进一步：①采用CoIP和GST pull-down验证DEC2与DGKH的结合作用；②通过构建DEC2过表达及沉默SACC细胞系，验证二者的互作介导化疗耐药的作用。
2、将DEC2+休眠及对照组SACC细胞经裸鼠季肋部皮下注入以构建移植瘤模型进一步：①成瘤过程中记录瘤体生长曲线并比较两组肿瘤大小；②成瘤后实验组和对照组均分别经腹腔给予生理盐水、化疗药、化疗药+DGKH抑制剂，记录肿瘤体积变化；③取出瘤体，检测DEC2、DGKH的表达差异。
3、将DEC2+休眠及对照组SACC细胞经裸鼠尾静脉注入以构建肺转移模型进一步：①记录裸鼠体重变化以及肺部转移灶的形成情况；②转移灶形成后两组均分别经腹腔给予生理盐水、化疗药、化疗药+DGKH抑制剂，观察转移瘤数量和体积变化；③取出肺组织，检测DEC2、DGKH的表达差异。
结合临床样本、细胞实验及动物模型结果，尝试分析DEC2/DGKH信号轴通过调控休眠细胞的磷脂酸代谢导致SACC化疗耐药及不良预后的作用机制。 
涎腺腺样囊性癌（Salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是发生于口腔颌面部的涎腺上皮源性恶性肿瘤[1]，虽然生长缓慢，但侵袭性强，局部复发及远处转移率高达85%[2]，患者病程较长且病变隐匿，常因肿瘤浸润周围神经引起疼痛和神经麻痹，并造成功能障碍而就诊。由于SACC对化疗药物的敏感性低，目前临床上主要采用手术辅以术后放疗，但较强的局部浸润和神经侵袭能力常导致其不能被彻底根治，复发和转移率居高不下，患者预后较差并常面临“无药可医”的局面[3]。因此，探究SACC化疗耐药的产生机制，寻找增强药物敏感性的相关靶点，对提高其治疗效果及改善患者预后至关重要。
肿瘤细胞休眠是指肿瘤细胞既不增殖也不凋亡或衰老，细胞周期阻滞于G0/G1期，此时患者无任何临床症状且现有的方法亦检测不到肿瘤的存在[4]，但休眠状态并不是一成不变的，当微环境改变或相应的信号通路被激活时，细胞可恢复增殖能力，进而导致肿瘤复发和转移。细胞休眠在肿瘤进展过程中普遍存在，由于具备更强的迁移和侵袭能力，加上其特殊的生长停滞状态，常能够逃避抗肿瘤药物的杀伤作用[5]，因此，被认为是造成患者不良预后的主要原因之一。有学者提出通过激活休眠细胞增加治疗敏感性的科学假说[6]，但这一方法可能存在肿瘤大面积增殖乃至复发的风险。能否在休眠状态下通过靶向调控相关的信号通路而非激活休眠细胞进入增殖周期，降低细胞的迁移侵袭能力并增强药物敏感性，从而实现针对休眠肿瘤细胞的靶向治疗[7]，则需要我们进一步研究。
SACC所具有的生长缓慢、对化疗药物敏感性低以及复发转移率高的临床特点均提示其很可能发生肿瘤休眠，我们的前期研究对此进行了验证，结果显示SACC临床组织样本中存在大量休眠表型的肿瘤细胞，分化程度越低且预后越差的样本中休眠细胞越多（IF：11.3），可见休眠细胞的存在很可能是SACC化疗耐药及不良预后的根源所在，但其具体调控机制需要进一步探究。
此外，我们还发现分化型胚胎软骨发育基因2(Differentiated embryonic chondrocyte gene 2, DEC2)参与调控SACC的休眠过程并在体内外模型上进行了验证，DEC2过表达能够诱导SACC发生休眠并降低药物敏感性，同时DEC2+休眠细胞具备更强的迁移和侵袭能力[8]。DEC2属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子超家族成员，参与调控昼夜节律、细胞分化、凋亡、缺氧以及免疫应答[9]，并在头颈部鳞癌、乳腺癌和前列腺癌的休眠过程中发挥重要作用[10]。由此可见，DEC2很可能通过诱导SACC细胞休眠导致其化疗耐药，进而促进患者的不良预后。
为了进一步探究以上调控过程的具体机制，我们利用转录测序和Cut&Tag检测并将二者结果结合分析筛选出DEC2的靶向调控基因二酰基甘油激酶η（Diacylglycerol kinase η，DGKH），它是一类脂质信号调节因子，催化二酰基甘油（Diacylglycerol，DAG）转化为磷脂酸，调控磷脂酸代谢。在双相情感障碍以及肾结石病等患者体内存在异常表达[11-12]，但在肿瘤领域内的研究则较为局限，其表达增加与急性髓系白血病患者的不良预后有关[13]，而在其他类型肿瘤中的作用以及与化疗敏感性的相关性尚未见报道。DEC2+休眠细胞是否存在磷脂酸代谢异常并因此促进SACC化疗耐药，其具体机制如何，还需进一步研究。
本项目拟在前期研究基础上，进一步探究休眠细胞中DEC2靶向调控DGKH，进而介导磷脂酸代谢异常，并最终导致SACC化疗耐药等不良预后的发生，研究结果有望为寻找治疗SACC的新靶点提供理论基础，并有望优化患者的临床治疗策略，改善预后状态。
本项目的科学假说机制图summernote-img
主要参考文献
[1] Ammad Ud Din M, Shaikh H. Adenoid cystic cancer. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2024 Jan.
[2] Locati LD, Galbiati D, Calareso G, Alfieri S, Singer S, Cavalieri S et al. Patients With Adenoid Cystic Carcinomas of the Salivary Glands Treated With Lenvatinib: Activity and Quality of Life. Cancer. 2020;126(9):1888-1894.
[3] Liu XH, Yang XJ, Zhan CN, Zhang Y, Hou J, Yin XM. Perineural Invasion in Adenoid Cystic Carcinoma of the Salivary Glands: Where We Are and Where We Need to Go. Front Oncol. 2020; 10:1493.
[4] Corthay A, Bakacs T, Thangavelu G, Anderson CC. Tackling cancer cell dormancy: Insights from immune models, and transplantation. Semin Cancer Biol. 2022 Jan; 78:5-16.
[5] Gerstberger S, Jiang Q, Ganesh K. Metastasis. Cell. 2023 Apr 13;186(8):1564- 1579.
[6] Recasens A, Munoz L. Targeting Cancer Cell Dormancy. Trends Pharmacol Sci. 2019 Feb;40(2):128-141.
[7] Francescangeli F, De Angelis ML, Rossi R, Cuccu A, Giuliani A, De Maria R et al. Dormancy, stemness, and therapy resistance: interconnected players in cancer evolution. Cancer Metastasis Rev. 2023 Mar;42(1):197-215.
[8] Yang X, Wu JS, Li M, Zhang WL, Gao XL, Wang HF et al. Inhibition of DEC2 is necessary for exiting cell dormancy in salivary adenoid cystic carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2021; 40: 169.
[9] Furukawa T, Mimami K, Nagata T, Yamamoto M, Sato M, Tanimoto A. Approach to Functions of BHLHE41/DEC2 in Non-Small Lung Cancer Development. Int J Mol Sci. 2023 Jul 21;24(14):11731.
[10] Fluegen G, Avivar-Valderas A, Wang Y, Padgen MR, Williams JK, Nobre AR et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nat Cell Biol. 2017 Feb;19(2):120-132.
[11] Grillault Laroche D, Curis E, Bellivier F, Nepost C, Courtin C, Etain B et al. Childhood maltreatment and HPA axis gene expression in bipolar disorders: A gene network analysis. Psychoneuroendocrinology. 2020 Oct;120:104753.
[12] Howles SA, Wiberg A, Goldsworthy M, Bayliss AL, Gluck AK, Ng M et al. Genetic variants of calcium and vitamin D metabolism in kidney stone disease. Nat Commun. 2019 Nov 15;10(1):5175.
[13] Gravina T, Boggio CMT, Gorla E, Racca L, Polidoro S, Centonze S et al. Role of Diacylglycerol Kinases in Acute Myeloid Leukemia. Biomedicines. 2023 Jul 1;11(7):1877. 
1、研究角度新颖：肿瘤细胞休眠以及化疗耐药是目前的研究热点和难点，既往研究主要围绕休眠细胞的活化靶点展开。本项目独辟蹊径，以“维持休眠态”为主要切入点， 在明确SACC存在大量休眠细胞的基础上，结合其独特的生物学特征，通过构建SACC 的体内外休眠模型，进一步探究休眠增强化疗抵抗的作用机制，并提出通过对休眠基因下游因子的调控，实现细胞休眠状态下的药物增敏，有望为肿瘤化疗耐药研究提供新的模式和思路。
2、聚焦耐药调控新机制：我们的前期研究首次发现了生物钟基因DEC2对SACC 休眠的调节作用，本项目将进一步采用基因沉默或过表达手段，CoIP技术并结合转录测序和Cut&Tag测序探究DEC2通过靶向调控DGKH，导致休眠细胞中的磷脂酸代谢异常，进而介导SACC化疗耐药性的产生，本研究有望揭示DEC2调控肿瘤耐药的新机制。 
【技术路线】summernote-img
【拟解决的问题】
探究休眠细胞中生物钟基因DEC2通过靶向调控DGKH的表达，导致细胞内磷脂酸代谢异常，从而降低SACC对化疗药物的敏感性是本课题的关键科学问题。细胞休眠贯穿肿瘤发生发展的整个环节，由于具备较强的迁移侵袭能力且药物敏感性低，加之存在随时会被激活的可能性，严重影响患者预后。申请者前期实验发现SACC临床样本中存在大量休眠细胞，并通过体内外研究证实 DEC2参与调控上述休眠过程。激活休眠SACC细胞虽然能够增强其药物敏感性，但 却面临肿瘤大面积复发及转移的风险。根据对此项科学问题的探究，力求实现在细胞休眠状态下，通过对下游靶分子的调控并联合使用化疗药物，提高治疗的有效率，为改善 SACC患者的预后提供一定的理论依据。本项目拟运用多种分子和细胞生物学技术，通过临床样本、细胞学以及动物体内实验来回答上述关键科学问题。
【预期成果】
本研究从SACC化疗耐药导致患者复发转移率较高这一临床问题出发，围绕肿瘤细胞休眠这一重要事件，系统研究DEC2/DGKH通过调控磷脂酸代谢诱导SACC化疗耐药及不良预后的相关机制，探索可用于临床治疗的分子靶点。
1、揭示DEC2诱导的细胞休眠在SACC化疗耐药中的重要作用，及其临床意义。
2、阐明DEC2/DGKH通过调控休眠细胞的磷脂酸代谢促进SACC化疗耐药及复发转移的功能作用和分子机制，解析其相互作用模式。
3、在专业学术刊物上发表1-2篇论文。 
◆ 2025.06-2025.12 SACC 临床样本收集，转录组测序；HE及免疫组化染色，患者临床 病理指标统计，结果整理和分析
◆ 2026.01-2026.06 采用顺铂诱导并筛选稳定耐药的SACC细胞；利用基因沉默和过表达手段，在细胞水平上验证DEC2/DGKH通过调控磷脂酸代谢诱导SACC化疗耐药的分子机制
◆ 2026.07-2026.12 构建 SACC 裸鼠移植瘤和肺转移模型，在动物体内环境下验证体外细胞学的实验结果
◆ 2027.01-2027.06 整理分析数据，撰写论文 
1. 与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
与本项目相关的研究工作积累
（1） SACC患者临床样本中DEC2+细胞呈休眠特点且与患者不良预后密切相关summernote-img
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图1 SACC患者的临床研究：（A）复发组：DEC2+肿瘤细胞，Ki-67（增殖）呈弱阳性，TUNEL（凋亡）和β-galactosidase（衰老）检测结果为阴性，休眠标志物NR2F1表达呈阳性，提示DEC2+细胞处于休眠状态；无复发组：DEC2表达为弱阳性，Ki-67（增殖）呈阳性，TUNEL（凋亡）、β-galactosidase（衰老）以及NR2F1表达均为阴性，提示细胞增殖活跃；（B）DEC2表达水平与肿瘤发生部位、组织学分型、复发及转移率密切相关（发生于小唾液腺或病理分型为实性型即恶性程度越高以及复发转移率越高者，DEC2表达水平越高）。
（2）DEC2过表达诱导SACC细胞休眠并增强其迁移侵袭能力summernote-img
图2 DEC2过表达的SACC细胞增殖（A）和代谢能力降低（B）、细胞周期G0/G1期比例增加（C）、凋亡（D）及衰老（E）细胞比例无明显改变，均符合休眠细胞的特点；同时细胞迁移和侵袭能力增强，而DEC2沉默后则减弱。
（3）DEC2+休眠SACC细胞耐药性显著增强summernote-img
summernote-img图3 CCK-8（A）和集落形成实验（B）提示DEC2+细胞对药物的敏感性明显减弱；化疗药物处理后，与对照组相比，DEC2+SACC细胞中周期阻滞于G2/M期（C）以及凋亡细胞数量（D）均未见明显改变。
（4）DEC2调控SACC化疗耐药等恶性生物学行为机制的初步探究summernote-imgsummernote-img
图4 （A）将DEC2+和对照组细胞进行转录测序和Cut&Tag检测并结合分析，筛选出共同差异表达的基因共28个，其中DEC2与DGKH表达水平均显著增加，同时二者分别在昼夜节律调控以及磷脂酸代谢通路中明显富集；（B）化疗药物与DGKH抑制剂联合使用能够显著提高药物敏感性。
 已取得的研究工作成绩
已发表文章：
1. Yang X, Ma H, Zhang M, Wang R, Li X. TRIM32 promotes oral squamous cell carcinoma progression by enhancing FBP2 ubiquitination and degradation. Biochem Biophys Res Commun. 2023 Oct 20;678:165-172.（IF=3.1）
2. Yang X, Wu JS, Li M, Zhang WL, Gao XL, Wang HF et al. Inhibition of DEC2 is necessary for exiting cell dormancy in salivary adenoid cystic carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2021 May 14; 40(1):169. （IF=11.3）
3. Yang X, Liang X, Zheng M, Tang Y. Cellular Phenotype Plasticity in Cancer Dormancy and Metastasis. Front Oncol. 2018 Nov5;8:505. (IF=4.7)
已获批立项：
获批国家自然科学基金青年项目、中国博士后科学基金面上项目、山东省自然科学基金青年项目以及市级重点项目各一项。 
（1）申请人所在单位济宁医学院附属医院及其中心实验室基本具备了本项目所需的临床样本、细胞培养和裸鼠模型构建的条件，能提供研究所需要的主要实验仪器设备，包括冷冻和石蜡切片机、CO2细胞培养箱、超净工作台、离心机、荧光倒置显微镜、流式细胞仪、PCR仪、制冰机、电泳仪等，具备从事分子和细胞生物学检测的各项设备；实验所需的各种试剂可由国内外的生物试剂公司提供。这为本项目顺利完成提供了充分的物质保证。
（2）本项目的参与人员熟练掌握各项实验技能，能够完成本项目的全部工作。
（3）申请者本人长期从事肿瘤休眠领域的研究，具备扎实的理论知识，熟练掌握本研究所需的各项实验技能。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 10000.00 无 5600.00 4400.00
1. 业务费 2000.00 无 600.00 1400.00
（1）计算、分析、测试费 1000.00 流式细胞术、激光共聚焦显微镜、CO-IP实验等 600.00 400.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 1000.00 用于论文发表 0.00 1000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 8000.00 试剂及耗材购置费；抗体的购买；RT-PCR和Western Blot试剂盒；细胞周期/凋亡/衰老/增殖检测试剂盒；裸鼠购买/动物模型构建/饲养费；其他普通试剂购买等。 5000.00 3000.00
结束

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