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Tox3通过NF-κB通路调控破骨细胞分化参与牙周炎的作用研究

申报人：李高然 申报日期：2025-03-22

基本情况

2025创新项目
Tox3通过NF-κB通路调控破骨细胞分化参与牙周炎的作用研究 学生申报
创新训练项目
医学
口腔医学类
学生自主选题
二年期
牙周炎是一种由菌斑生物膜引发的慢性感染性疾病，其特征是牙周支持组织的进行性破坏。破骨细胞异常活化导致的骨吸收是牙周炎病理进展的核心环节，其调控机制尚未完全阐明。NF-κB信号通路是调控破骨细胞分化和炎症反应的关键通路，Tox3为新近发现的转录调控因子，可抑制NF-κB信号通路的活化，机制不明，参与免疫调控和肿瘤相关疾病，但其在牙周炎及破骨细胞分化中的作用未知。课题组前期发现Tox3敲除后破骨细胞分化显著富集，牙周炎中Tox3表达降低，髓系敲除Tox3可加重牙周炎进展。本项目旨在探索Tox3是否通过调控NF-κB通路影响破骨细胞分化，从而驱动牙周炎骨吸收的分子机制，有望发现破骨细胞分化的关键调控因子，揭示牙周炎发生的新机制，为其干预提供新靶点及新思路。
       负责人为口腔医学专业2023级学生，对科研有非常浓厚的兴趣，2023年至今加入基础医学院免疫学实验室，参与基础项目研究，负责糖耐量、胰岛素敏感性等检测，在实验室学习过程中积极投入查阅文献、实验设计和实验操作等工作。负责人在实验室中充分积累经验，已具备了一定的收集数据、提炼信息、独立思考和创新的能力。负责人曾作为项目组成员参加了2024年大学生创新训练计划项目《IL-37d调控巨噬细胞在川崎病中的作用及机制研究》和济宁医学院第八届基础医学创新实验大赛《胰高血糖素样肽﹣1(GLP-1）通过调控2型固有淋巴细胞活化缓解肥胖的机制研究》。
  1. 2024年山东省医药卫生计划：ODAM对牙周炎结合上皮内巨噬细胞趋化及极化的作用及机制研究 主持 在研
  2. 2023年济宁医学院高层次科研项目立项：结合上皮中牙源性成釉细胞相关蛋白（ODAM）的表达对牙周炎的影响及其机制研究 主持 在研
       为项目提供全面的学术指导、实验支持和数据分析帮助，确保研究方向的科学性和创新性。同时，定期跟踪项目进展，协助解决技术难题，并指导论文写作，帮助学生顺利完成项目并提升科研能力。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
李高然 口腔医学院 口腔医学（本科） 2023 实验整体设计与规划、实验实施和论文撰写
施慧 精神卫生学院 精神医学（本科） 2023 实验数据分析及论文撰写
王倚萱 精神卫生学院 精神医学（本科） 2023 实验数据整理、文献查阅及论文撰写

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
侯萌 口腔医学院 否

立项依据

  1. 明确Tox3调控破骨细胞分化在牙周炎中的具体作用，为牙周炎的干预提供新的候选靶点。
  2. 明确Tox3通过NF-κB调控破骨细胞参与牙周炎的作用，为牙周炎发病机制研究提供新的思路。
  3. 阐明Tox3调控NF-κB介导破骨细胞分化的分子机制，拓宽Tox3新型生物学功能，为破骨细胞相关骨代谢疾病干预策略研究提供新举措。
       本项目前期利用小鼠骨髓巨噬细胞RNA-seq转录组测序，差异基因进行通路富集分析，发现Tox3敲除后破骨细胞分化富集最为显著，提示Tox3在牙周炎中的潜在作用，另发现敲除Tox3的巨噬细胞中NF-κB磷酸化显著增强。数据库分析发现牙周炎患者Tox3 mRNA表达降低，牙周炎小鼠牙龈组织中Tox3 mRNA表达显著降低。利用髓系细胞敲除Tox3的小鼠构建牙周炎模型，发现Tox3敲除小鼠牙周炎呈加重的趋势，具体作用及机制有待进一步明确，研究内容设计如下：

1.明确Tox3调控破骨细胞分化在牙周炎中的具体作用
（1）明确Tox3与牙周炎的相关性：利用TCGA数据库、RNA-seq及单细胞测序数据分析牙周炎患者及治疗前后Tox3表达变化，分析其与破骨细胞分化相关指标NFATc1、CTSK等指标及牙周炎严重程度的相关性。
（2）明确髓系敲除Tox3对牙周炎进展的影响：利用髓系敲除Tox3（Tox3fl/flLysMCre；CKO）及对照小鼠（Tox3fl/fl）分别取双侧上颌第二磨牙利用丝线结扎建立小鼠牙周炎模型，Micro-CT检测牙槽骨吸收情况，牙槽骨组织切片HE染色观察炎细胞浸润情况，TRAP染色检测破骨细胞数量，牙周组织qRT-PCR检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6等mRNA表达情况。
（3）明确Tox3对破骨细胞分化及功能的影响：利用RAW264.7细胞建立Tox3过表达或干扰细胞系，分离髓系敲除Tox3及对照小鼠骨髓细胞诱导建立破骨细胞模型，TRAP染色检测破骨细胞数量、形态，检测关键转录因子NFATc1及组织蛋白酶CTSK mRNA及蛋白表达水平，利用骨片检测骨吸收功能。

2.明确Tox3通过NF-κB调控破骨细胞参与牙周炎的作用
（1）明确Tox3敲除对破骨细胞分化相关通路的影响：利用Tox3 CKO及对照小鼠，取骨髓诱导破骨细胞，Western blotting检测TRAF6、NF-κB 、MAPK（p38、ERK、JNK)、PI3K/AKT、β-catenin信号通路活化情况。
（2）明确NF-κB通路在Tox3调控破骨细胞分化及功能中的作用：同上诱导破骨细胞模型，分别利用NF-κB抑制剂DHMEQ（抑制NF-κB的DNA结合活性）、IKK-16(异性抑制IKKβ)预处理，TRAP染色检测破骨细胞数量，检测NFATc1、CTSK表达及骨吸收功能。
（3）明确NF-κB通路在Tox3调控破骨细胞影响牙周炎进展的关键作用：利用Tox3 CKO及对照小鼠构建牙周炎模型，同时给予DHMEQ或IKK-16处理小鼠，Micro-CT、HE染色评估牙槽骨损伤情况，TRAP染色及qRT-PCR检测破骨细胞相关指标的变化。

3.阐明Tox3调控NF-κB介导破骨细胞分化的分子机制
（1）明确Tox3对NF-κB上游活化通路的影响：利用Tox3过表达RAW264.7细胞系或Tox3 CKO小鼠骨髓诱导破骨细胞，RANKL刺激于不同时间点Western blotting检测IKK、RIP1、TRAF6、IκBα表达及磷酸化情况，qRT-PCR检测其mRNA表达情况，分别利用抑制剂处理，检测NF-κB p65磷酸化情况。
（2）明确Tox3对NF-κB核转位的影响：利用Tox3过表达RAW264.7细胞系或Tox3 CKO小鼠骨髓诱导破骨细胞，RANKL刺激于不同时间点，利用p65进行免疫荧光检测分析NF-κB在细胞核、细胞浆的分布情况。
（3）明确Tox3对NF-κB结合DNA能力的影响：Tox3与NF-κB reporter共转染HEK293细胞，利用TNF-α进行刺激，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测NF-κB的转录活性。利用Tox3过表达RAW264.7细胞系或Tox3 CKO小鼠骨髓诱导破骨细胞，EMSA检测DNA结合能力。
  1. 牙周炎的发病现状及危害
          牙周炎是一种慢性多因素炎症性疾病，常见特征包括牙龈炎症、临床附着丧失、牙槽骨流失的影像学证据、探诊深度较深的部位、活动度、探诊出血和病理迁移。牙周炎在全球范围内影响约7.43亿人的口腔健康，尤其在成年人群中发病率较高。据统计，全球范围内牙周炎影响了一半以上的中国成年人，其患病率呈上升趋势。此外，牙周炎也是导致牙齿丧失的主要原因之一，约占所有牙周炎患者的90%至95%。
           牙周炎主要由牙菌斑微生物引发，与牙菌斑的积累有关，其特征是牙齿支撑器官（包括牙周韧带和牙槽骨）的进行性破坏[1-2]。补体系统在牙周炎的病理生理过程中扮演重要角色，其激活产生的免疫炎症反应加剧了牙周组织的破坏。牙周炎涉及特定细菌病原体、破坏性宿主免疫反应以及吸烟等环境因素之间复杂的动态相互作用（图1）[1,3]。牙周炎与心血管疾病有关，亚临床心血管疾病患病率、冠状动脉疾病的患病率以及心肌梗死和其他冠状动脉事件的风险、患脑血管疾病的患病率和中风风险、患外周动脉疾病的患病率和发病率、患心力衰竭、心房颤动的风险都呈正相关[4-5]。因此，深入探讨牙周炎发病机制，发现新的干预靶点，具有重要理论研究价值及临床意义。
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    图1 牙周炎与多种因素有关

  2. 牙周炎的致病机制复杂，破骨细胞在其中发挥重要作用
           牙周炎主要由牙菌斑中的微生物及其产物引发，相关微生物作为始动因子，导致牙周组织的破坏和牙槽骨的吸收[6]，具体发病机制尚未完全明确。研究显示，牙周炎与宿主对菌斑微生物及其产物的免疫应答反应密切相关[7]，提示免疫反应参与牙周炎损伤过程。牙周组织含有多种免疫细胞，巨噬细胞在识别和清除细菌方面发挥关键作用。然而，免疫是一把双刃剑，免疫反应的过度激活也会导致牙周组织的损伤。巨噬细胞在脂多糖等刺激下，极化为M1型，分泌大量的促炎因子，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，炎症因子既参与牙周致病微生物的清除，亦可促进破骨细胞的分化，从而加速牙槽骨的吸收[8]。
           破骨细胞是负责骨吸收的主要细胞，其活性受RANKL/OPG信号通路的调控。在牙周炎中，核因子κB受体激活蛋白配体（RANKL）的表达增加，RANKL与破骨细胞前体上的RANK受体结合，促进破骨细胞的形成，而OPG的表达减少，导致破骨细胞的活化。破骨细胞的活性还受到炎症因子的影响，TNF-α和IL-6通过激活NF-κB信号通路促进破骨细胞的分化和骨吸收[8，9]。miRNA在牙周炎中通过调控基因表达影响破骨细胞的增殖和分化，miR-21在牙周炎牙龈中表达增高，可能通过抑制相关基因的表达，促进破骨细胞的增殖。

  3. 破骨细胞分化的调控机制及关键信号通路
           破骨细胞分化受多重机制调控。RANKL/RANK/OPG信号通路：RANK属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，在破骨细胞前体表达，RANKL与RANK结合后，激活下游信号通路；RANKL由成骨细胞分泌，与破骨细胞前体表面的RANK结合，启动破骨细胞的分化和激活[10-11]；骨保护素（OPG）为RANKL的竞争性受体，通过与RANKL结合，抑制RANKL/RANK信号通路，从而抑制破骨细胞的分化和活性。巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）信号通路：M-CSF与破骨细胞前体表面的c-Fms受体结合，激活PI3K/Akt和ERK信号通路，促进破骨细胞前体的增殖和存活[12]。其他细胞因子和激素：IL-1、IL-6、IL-17和TNF-α炎性细胞因子可通过促进RANKL的表达，间接激活破骨细胞分化；1,25-二羟维生素D3通过促进M-CSF和RANKL的表达，间接调控破骨细胞的分化。
           多个信号通路促进破骨细胞的分化。p38-MAPK：在破骨细胞分化的早期阶段，p38-MAPK信号通路促进TRAP的表达，驱动下游因子的激活[13]。ERK1/2-MAPK：ERK信号通路参与破骨细胞的存活、增殖和分化，低剂量奥巴克拉可阻断RANKL对ERK的激活，抑制破骨前体细胞的增殖和融合[14]。JNK-MAPK：JNK信号通路在破骨细胞分化中起重要作用，通过影响NFATc1的活性，调控破骨细胞的形成[13]。PI3K/Akt信号通路：PI3K/Akt信号通路在破骨细胞前体的存活和增殖中发挥关键作用，RANKL与RANK结合后，激活PI3K/Akt信号通路，促进破骨细胞的形成和活化[10]。TGF-β/Smad信号通路：TGF-β通过调节RANKL与护骨因子的平衡，间接影响破骨细胞的分化，RANKL/RANK信号通路的下游介质通过NFATc1调节破骨细胞的形成[14]。Wnt/β-catenin信号通路：LncRNA TUG1通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞的分化，进而影响破骨细胞的分化和骨代谢[15]。

  4. NF-kB信号通路在破骨细胞分化中的作用
           核因子NF-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一种具有调控基因转录作用的蛋白质核转录因子，主要存在于真核细胞的细胞质中，被多种因素诱导活化后，可转移至细胞核内参与调控多种基因的表达，在机体的正常免疫应答、炎性反应等过程中均发挥重要作用。NF-κB是一个由多个亚单位组成的转录因子家族，包括p50、p65、RelA、c-Rel和RelB，这些亚单位可以形成多种二聚体，其中p65/p50异源二聚体是最常见的形式，并在激活状态下进入细胞核，调节基因表达[16]。在静息状态下，NF-κB与抑制蛋白IκB结合，形成无活性的复合物，存在于细胞质中。当细胞受到外界刺激，如脂多糖（LPS）、RANKL等，NF-κB被激活，IκB发生磷酸化并降解，释放出活化的NF-κB二聚体进入细胞核，启动目标基因的转录[17]。
          研究表明，NF-κB 不是一种单一的蛋白，是由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。NF-κB 蛋白家族具有广泛的生物学活性，能够与调控免疫应答、炎性反应、细胞分化和生长、细胞黏附和凋亡所必需的许多细胞因子、黏附因子等基因启动子或增强子部位的κB位点（共同序列：5'-GGGRNYYYCC-3'；R为任一嘌呤，Y为任一嘧啶，N为任一核苷酸）特异性结合，在免疫细胞的活性和存活方面发挥重要的作用[18]。
           破骨细胞来源于骨髓中的造血前体细胞，其分化和成熟受多种全身性细胞因子和信号转导的调节[19]。具有多核特征的成熟破骨细胞可以紧密附着在骨表面，导致骨吸收[20]。在破骨细胞分化，通过促进破骨细胞谱系的特异性基因表达刺激破骨细胞生成，包括c-Fos、Mmp9、组织蛋白酶 K 和T细胞核因子胞浆1（NFATc1）[21-22]。研究表明，NF-κB的活化是破骨细胞形成所必需的细胞因子，NF-κB基因敲除的小鼠模型中，破骨细胞的形成受到限制，导致严重的骨硬化病，表明NF-κB在破骨细胞分化中的必要性[17]。在RANKL激活下游信号通路的早期阶段，NF-κB对破骨细胞的分化发挥重要调控作用，NF-κB通过诱导破骨细胞特异性基因的表达，如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP)和组织蛋白酶K，促进破骨细胞的成熟和功能。

  5. Tox3
           Tox3属于TOX家族[23]，TOX在CD4+T淋巴细胞和NK细胞等免疫细胞的发育以及淋巴结的形成过程中发挥重要作用，其中Tox3在中枢神经系统、回肠、大脑额叶及顶叶高表达，对神经细胞的生存发挥重要作用。据报道，Tox3可与CBP/CREB或CBP/CITED1复合物相互作用，保护神经系统免受脊髓损伤。研究发现Tox3可调控CREB蛋白，并使之活化后抑制NF-kB的核转位，从而抑制NF-κB信号通路[24-26]。同时Tox3也可作为抑制CD155的关键转录因子，阻断CD155可以改善脓毒症[27]。迄今，Tox3对于髓系免疫细胞的调控作用未见相关报道。

【参考文献】
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  1. Tox3调控破骨细胞分化在牙周炎中的具体作用是本项目首要特色，目前国内外未见相关文献报道。
  2. 阐明Tox3调控NF-κB影响破骨细胞分化参与牙周炎的作用机制是本项目另一特色，本项目基于转录组学测序提出新学说，有望发现破骨细胞分化的关键转录因子。

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2025.6-2025.12 完成动物实验，明确 Tox3 在牙周炎中的具体作用。
2026.1-2026.6 建立破骨细胞模型，明确 Tox3 对破骨细胞分化及功能的影响。
2026.7-2026.12 明确Tox3对NF-κB信号通路的影响及在调控破骨细胞分化及功能中的作用。
2027.1-2027.6 明确Tox3在体内通过 NF-κB通路调控破骨细胞分化参与牙周炎的作用。总结课题，撰写论文。
  1. RNA-Seq转录组测序显示Tox3敲除后破骨细胞分化富集最为显著。
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    图2 RNA-Seq转录组测序

  2. Tox3敲除促进NF-κB p65磷酸化
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    图3 Western blotting检测p65磷酸化

  3. 数据库分析显示，牙周炎中Tox3的表达降低
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    图4 数据库分析Tox3在牙周炎中的表达变化

  4. 小鼠牙周炎牙龈组织中Tox3 mRNA表达降低
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    图5 小鼠牙周炎中Tox3表达降低

  5. 髓系敲除Tox3促进牙周炎的进展
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图6 髓系敲除Tox3小鼠牙周炎呈加重趋势

       已具备髓系敲除Tox3的小鼠，建立小鼠牙周炎的模型及破骨细胞分化、检测体系。具备免疫学、分子及细胞生物学研究工作的基本仪器：配备有流式细胞仪、原子力显微镜、双向电泳仪、激光共聚焦显微镜、硬组织切片机、Micro-CT、低温高速离心机、定量 PCR 仪、恒冷冰冻切片机、各项常规组织标本制备所需要的仪器设备等。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 10000.00 购买关键实验材料、测试费用等 5600.00 4400.00
1. 业务费 5000.00 无 2600.00 2400.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 Micro-CT等仪器测试费 1500.00 500.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 1000.00 参加牙周炎相关学术会议 500.00 500.00
（4）文献检索费 1000.00 文献查阅检索、资料复印 600.00 400.00
（5）论文出版费 1000.00 发表论文版面费 0.00 1000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 5000.00 购买抗体、抑制剂、培养基、血清等实验材料 3000.00 2000.00
结束

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