研究一 隔药灸脐法对 IBS-D 大鼠炎症反应、肠屏障损伤的影响
1.评价隔药灸脐法治疗 IBS-D 整体疗效
采用结肠注入乙酸与束缚应激法建立 IBS-D 大鼠模型，以生理盐水、匹维溴铵为对照，给予隔药灸脐法干预，观察大鼠的精神状态、皮毛色泽、饮食饮水量、体质量增长率等一般情况、粪便性状、粪便含水量等排便情况以及AWR评分。
2.评价隔药灸脐法改善 IBS-D 大鼠炎症反应的作用
酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠结肠组织、血清中促炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、白细胞介素 (IL)-6 和肿瘤坏死因子(TNF)-a 的水平，明确隔药灸脐法对 IBS-D 大鼠炎症反应的改善作用。
3.评价隔药灸脐法改善 IBS-D 大鼠肠屏障损伤的作用
① HE 染色观察各组大鼠肠组织病理结构；
②免疫荧光双标法观察肠上皮细胞紧密连接蛋白 Occludin、ZO-1 蛋白的分布和表达情况，明确隔药灸脐法对 IBS-D 大鼠肠屏障损伤的改善作用。
研究二 隔药灸脐法在IBS-D模型大鼠结肠巨噬细胞糖酵解代谢的关键调控作用
1.评价隔药灸脐法对IBS-D模型大鼠结肠巨噬细胞极化的影响
①采用流式细胞术测定结肠组织中CD68+/F4/80+细胞的MHC-II+、iNOS+、CD163+、CD209+及Ki-67+表达水平；
②免疫荧光法检测结肠黏膜固有层巨噬细胞的M1/M2极化亚型。
2.评价隔药灸脐法对IBS-D模型大鼠结肠糖酵解关键激酶的影响
①Western blot检测各组大鼠结肠糖酵解关键激酶HK2、PKM2、PDK1、LDHA蛋白表达水平；
②RT-qPCR检测检测各组大鼠结肠糖酵解关键激酶HK2、PKM2、PDK1、LDHA mRNA表达水平。
研究三 基于PI3K/AKT/HIF-1α信号通路探讨隔药灸脐法通过抑制糖酵解-M1/M2极化轴失衡恢复肠道免疫稳态的分子机制
1.评价隔药灸脐法对PI3K/AKT/HIF-1α信号通路关键分子表达的影响
采用Western blot、RT-qPCR、ELISA技术检测大鼠结肠组织中PI3K、AKT、pAKT、pm TOR及HIF1α的表达情况。
2.评价PI3K/AKT/HIF-1α信号通路介导的结肠糖酵解-M1/M2极化轴在隔药灸脐法抑制结肠炎症，恢复结肠黏膜屏障中的关键作用，揭示其具体作用机制
通过设置正常组、模型组、隔药灸脐组、隔药灸脐+PI3K抑制剂组、匹维溴铵组，然后对大鼠进行结肠炎症反应、黏膜屏障、巨噬细胞极化、糖酵解、PI3K/AKT/HIF-1α信号通路关键分子表达情况等上述检测。
具体研究方法
1.实验动物及分组
健康SD大鼠，雄性，SPF级，实验动物饲养及观察在济宁医学院动物实验中心（SPF 级）进行，整个实验操作需要遵循中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，围绕目标1、目标2动物分为正常组、模型组、隔药灸组、匹维溴铵组，围绕目标3动物分为正常组、模型组、隔药灸脐组、隔药灸脐+PI3K抑制剂组、匹维溴铵组，并根据检测指标确定各组大鼠所需具体只数。
2.模型制备
适应性喂养 1 周后，给予乙酸灌肠+束缚应激建立 IBS-D 模型。 造模前 24h 大鼠禁食不禁水，在乙醚麻醉后经肛门插入连接注射器的硅胶管（距肛门约 7cm），结肠内灌入 40mL/L 的乙酸 1mL，缓慢拔出硅胶管，用手压迫肛门并将大鼠尾巴抬高 30s， 后用 0.01mmoL/L 磷酸盐缓冲液（PBS）1mL 冲洗结肠，放回笼中自由活动进食水，于第 7 天行束缚应激，每天用宽透明胶带束缚前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部[1]，束缚时间 2h，连续束缚 7 天。各造模组大鼠粪便含水量[2]及腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex, AWR）评分[3]高于正常组（有统计学意义）为造模成功的标准。
3.干预方法
将大鼠随机分为对照组、模型组、隔药灸脐组、隔药灸脐+PI3K抑制剂组和匹维溴铵组。连续干预 10 天。
①正常组：不做治疗，每天给予生理盐水灌胃，同时与隔药灸脐组同步的抓取固定。
②模型组：不做治疗，每天给予生理盐水灌胃，同时与隔药灸脐组同步的抓取固定。
③隔药灸脐组：
大鼠神阙穴定位：根据类比原理，在胸腹正中线上，剑突至耻骨联合上缘上 2/3 与下 1/3 交界处[4-5]。
方药组成及制备：选自首届岐黄学者、第二届全国名中医高树中教授临床经验方腹泻方（白术、茯苓、丁香、芍药、五倍子等，国家发明专利：ZL201110138851.9），将药物超微粉碎混合，密封备用。
隔药灸脐操作方法：将大鼠仰卧固定，用 75%酒精常规消毒神阙穴，以温开水调面粉成圆圈状（内径约 0.5cm），置于大鼠神阙穴上，再将备好的药末均匀地填至神阙穴，将小艾炷（直径 8 约 0.3cm，高约 0.3cm）置于药末上施灸。连灸 10 壮，约 30 分钟，注意防止烫伤。
每 3 天治疗 1 次，同时每天给予生理盐水灌胃。
④隔药灸脐+PI3K抑制剂组
先按照20mg/kg剂量予以LY294002腹腔注射，2 h后进行隔药灸干预，操作方法同电针组。
⑤匹维溴铵组：
将匹维溴铵用生理盐水稀释后制成浑浊悬浮液后灌胃，灌胃剂量根据《药理实验方法学》 按成人 70kg 体质量与 IBS-D 模型大鼠 200g 体质量 1:0.018 比例配制灌胃溶液。大鼠每天上午定时灌胃干预一次，给予连续灌胃 9 天，同时与隔药灸脐组同步的抓取固定。
4.观察指标与方法
①一般情况及腹泻症状检测
一般情况：精神状态、皮毛色泽；饮食量；体质量增长率；
腹泻症状：排便情况；粪便性状；粪便含水量。
②行为学检测（AWR 评分）
腹壁撤退反射（AWR），每只大鼠用温水给予球囊扩张 3 次，容量分别为 1.0mL、 1.5mL、 2.0 mL，每次扩张持续 20s，间隔 30s（以防肠道缺血）。每个容量重复3次，取 3 次评分的均值。
③血清、组织炎症因子水平检测
a .血清 IL-1β、IL-6 和 TNF-a 检测
取各组大鼠腹主动脉抽血标本，利用特异的炎症因子 ELISA 试剂盒，对结肠组织及血清中炎症因子 IL-1β、IL-6 和肿瘤坏死因子 TNF-a 进行检测，明确各组 IBS-D 模型大鼠血清炎症因子表达情况。
b .肠组织 IL-1β、IL-6 和 TNF-a 水平
Western blot 检测法，提取蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒定量，蛋白变性，制备体系，制备 SDS-PAGE 凝胶，样品变性及电泳，电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印，然后标记、孵育、采用 PVDF 膜作为固相支持物及半干 转的转膜方式。对胶片进行扫描，生成灰度值，检测 IL-1β、IL-6 和 TNF-a 蛋 白表达情况。
④肠屏障损伤指标检测
a .大鼠肠组织病理结构
将无菌条件下取出大鼠末端结肠组织，制作成组织切片，在透射电镜下观察肠粘膜上皮细胞超微结构分别观察肠粘膜上皮细胞形态、大小、排列及连接 微结构，微绒毛形态、密度、长度、排列及整齐程度等。
b .肠上皮细胞紧密连接的状态
利用激光共聚焦技术和免疫荧光方法，观察 IBS-D 大鼠肠上皮细胞紧密连接蛋白 Occludin、ZO-1 的分布和表达情况，通过 RT-PCR 技术和 Western Blot 技术，对大鼠结肠组织内的紧密连接蛋白 Occludin、ZO-1 的 mRNA 和蛋白的表达情况进行检测。
⑤巨噬细胞极化相关指标检测
a .CD68+/F4/80+细胞的MHC-II+、iNOS+、CD163+、CD209+及Ki-67+表达水平
将结肠组织剪碎至1-2 mm³碎片，置于含胶原酶IV（1-2 mg/mL）和DNase I（20 U/mL）的RPMI 1640中。37℃振荡消化30-45分钟，每隔10分钟吹打一次。加入含10% FBS的培养基终止反应。依次通过100 μm和40 μm细胞筛，收集滤液。用ACK buffer处理5分钟，PBS洗涤2次。台盼蓝染色评估活率（>80%为宜）。用抗CD16/32抗体（1:100）室温孵育10分钟。加入抗CD68-FITC和F4/80-PE-Cy7，避光孵育30分钟（4℃）。加入Fixable Viability Dye（1:1000），室温避光孵育20分钟。用4%多聚甲醛室温固定20分钟。对于胞内标记（iNOS、Ki-67）：使用预冷的90%甲醇，冰上透化30分钟。对于膜内标记（MHC-II、CD163、CD209）：使用0.1% Triton X-100透化10分钟钟。PBS洗涤2次。加入MHC-II-APC、iNOS-PE、CD163-PerCP-Cy5.5、CD209-Alexa Fluor 700和Ki-67-BV421，避光孵育30分钟（4℃）。上机检测。
b .免疫荧光法观察结肠黏膜上皮组织中巨噬细胞极化表达
石蜡切片完成脱水与脱蜡后，首先 PBS 洗涤 3 次，滴加含 1% 牛血清白蛋(BSA) ，10% 山羊血清和 0． 3% Triton X － 100 的封闭缓冲液室温孵育 1 h; 之后去除封闭液，滴加一抗稀释液 CD68( 1:200) ，M1 巨噬细胞标记物 i NOS ( 1: 200 ) ，M2 巨噬细胞标记物CD206( 1: 150) 在 4 ℃ 箱孵育过夜; 取出洗涤后滴加带荧光的二抗稀释液，室温避光孵育 1 h; 洗涤 3 次，再滴加 DAPI 工作液，室温避光孵育 5 min; 洗涤干净后滴加防荧光淬灭封片剂进行封片;最后使用荧光显微镜进行拍照。以百分比柱状图形式展现巨噬细胞极化水平，M1 巨噬细胞荧光蛋白比例 = i NOS+/ CD68+，M2巨噬细胞荧光蛋白比例 = CD206+/ CD68+。
⑥糖酵解相关指标检测
a .Western blot检测各组大鼠结肠糖酵解关键激酶HK2、PKM2、PDK1、LDHA蛋白表达水平
蛋白质免疫印迹法检测结肠糖酵解关键激酶 HK2、PKM2、PDK1、LDHA 蛋白表达 适量结肠组织加入 600μl ＲIPA 溶液，研磨后 4℃ 下 12000r·min－1离心 5min，取上清液，BCA 试剂盒测蛋白浓度。加入缓冲液沸煮 15min，制备 15% 和 8% 凝胶电泳，转
膜，脱脂奶粉封闭; 加 PKM2( 1∶ 1000) 、HK2( 1∶ 800) 、PDK1( 1∶ 1000) 、LDHA ( 1 ∶ 1000) 、GAPDH ( 1 ∶ 2000) 一抗 4℃ 孵育过夜; TBST 洗涤，加入山羊抗兔二抗( 1∶ 5000) 常温孵育，加入 ECL发光液显影曝光，凝胶成像系统分析，测定条带与内参的光密度值，取两者比值定量分析。
b .RT-qPCR检测检测各组大鼠结肠糖酵解关键激酶HK2、PKM2、PDK1、LDHA mRNA表达水平
用Trizol试剂提取结肠组织总RNA。以mRNA为模版进行逆转录生成cDNA，-20℃保存备用。应用荧光定量试剂盒进行HK2、PKM2、PDK1、LDHA mRNA 检测，采用引物设计软件 Primr premier 与 Omiga 对HK2、PKM2、PDK1、LDHA 扩增引物进行设计。以GAPDH为参照，结果采用 2-ΔΔCT计算各组目的mRNA表达变化。
⑦PI3K/AKT/HIF-1α信号通路关键分子表达检测
a. 酶联免疫吸附法检测信号轴关键分子蛋白表达情况：采用ELISA试剂盒检测PI3K、AKT、p-AKT、p-m TOR及HIF1α的蛋白表达，具体操作按照试剂盒进行。
b. Western blot检测信号轴关键分子蛋白表达情况：采用Western blot检测大鼠结肠组织中PI3K、AKT、p-AKT、p-m TOR及HIF1α的蛋白表达，操作同上。
c. RT-qPCR检测信号轴关键分子mRNA表达情况：采用RT-qPCR检测大鼠结肠组织PI3K、AKT、p-AKT、p-m TOR及HIF1α的mRNA表达，操作同上。
⑧统计学分析
本研究所有数据采用 SPSS 22. 0 统计分析软件进行统计分析，实验数据以 ±s表示，在检验数据正态分布及方差齐性的条件下，多组间数据比较采用方差分析，各组组间差异的比较用 LSD-t 检验，数据相关分析采用 Spearman 相关 ，以 P<0.05为差异有统计学意义。
